奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanella oneidensis) MR-1對氟西汀降解過程的轉(zhuǎn)錄組及功能基因分析

萬 宇,杭小帥,王志剛,張 瀾①,周 莉,尤曉慧,朱冬冬,王 燕,肖 靜,陳 翔

(1.揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210042)

抑郁癥已成為全球最常見的精神疾病之一,全球抑郁癥患者超過3億人,而中國抑郁癥患者超過9 500萬人,每年有大量的抗抑郁藥在我國被消費[1-2]。氟西汀是我國抑郁癥患者最廣泛使用的抗抑郁藥物之一,但經(jīng)口服給藥后僅有低于10%的劑量被代謝,剩余部分則以母體或代謝產(chǎn)物的形式釋放到環(huán)境中[3]。在污水處理廠出水中檢測到氟西汀的質(zhì)量濃度高達(dá)3 465 ng·L-1[4],進(jìn)水濃度可能更高。此外,在地表水和飲用水中也檢測到了氟西汀[5-6],主要為ng·L-1級別。盡管氟西汀在水體中濃度較低,但由于其較高的靶向生物活性和難以被水中微生物降解的特性,會對水生態(tài)系統(tǒng)中的非目標(biāo)生物和人體健康造成潛在威脅[7-8],如何有效去除污水中的氟西汀成為研究關(guān)注的熱點。

微生物降解技術(shù)是目前污水處理的常用技術(shù)之一,因其工藝簡單、處理成本低和易規(guī)?；膬?yōu)點而被廣泛應(yīng)用[9],其中異化金屬還原菌可以在厭氧或缺氧條件下以金屬鐵、錳等氧化物作為最終電子受體將其還原為低價態(tài)的金屬離子,這一過程可偶聯(lián)多種有機(jī)物的氧化,加速其在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化,因而在環(huán)境污染修復(fù)領(lǐng)域中具有巨大的潛在應(yīng)用價值[10-12]。ShewanellaoneidensisMR-1作為典型的異化金屬還原菌株之一,在厭氧條件下利用Fe3+作為末端電子受體,通過氧化電子供體對多種有機(jī)污染物進(jìn)行降解[13-14]。目前,關(guān)于ShewanellaoneidensisMR-1胞外電子傳遞機(jī)制的研究已有不少報道。HE等[15]研究了ShewanellaoneidensisMR-1降解硝基芳香族化合物,發(fā)現(xiàn)其降解過程中電子傳遞效的存在率主要依賴c-型細(xì)胞色素家族基因cymA和硝基還原酶基因nfnB的表達(dá)。近年來,微生物組學(xué)如蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析已被用于探索微生物降解途徑[16-18]。其中,轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以從基因水平上探索微生物降解途徑。CAO等[17]基于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了ShewanellaoneidensisMR-1降解甲基橙的機(jī)理,發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)、氨基酸生物降解和電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的基因表達(dá)水平在甲基橙的影響下被顯著改變。但是目前從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度分析ShewanellaoneidensisMR-1降解抗抑郁藥的研究相對較少。

筆者研究了ShewanellaoneidensisMR-1厭氧還原降解氟西汀的性能,并采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)從水平層面分析ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀的作用機(jī)制,為ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀的功能基因和降解機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時也為抗抑郁藥污染的微生物修復(fù)技術(shù)提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ShewanellaoneidensisMR-1:來自中國科學(xué)院南京土壤研究所實驗室。

主要試劑:氟西汀鹽酸鹽、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、無水氯化鐵、檸檬酸三鈉、乳酸鈉、甲醇、鄰菲羅啉、乙酸銨、冰乙酸,均購自上海市阿拉丁化學(xué)試劑有限公司,所有化學(xué)試劑皆為分析純。

主要儀器:紫外分光光度計(島津UV2700)、高效液相色譜(安捷倫1260)。

1.2 培養(yǎng)基的配置

LB培養(yǎng)基(1 L):10 g NaCl、10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g瓊脂粉(配制固體培養(yǎng)基時加入)。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(1 L):0.46 g NaCl、0.23 g K2HPO4、0.23 g KH2PO4、0.12 g MgSO4·7H2O、0.23 g (NH3)2SO4、11.91 g HEPES 和微量元素10 mL,用2 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至7。

1.3 氟西汀降解實驗

將40 mL加入含檸檬酸鐵的無機(jī)鹽培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至100 mL鹽水瓶中,使用橡膠塞封口,在121 ℃下高溫高壓滅菌20 min。鹽水瓶冷卻至室溫后,通氮氣30 min以去除溶液中的氧氣,加入氟西汀溶液、乳酸鈉溶液和菌液,再使用滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基定容到50 mL。將鹽水瓶放入 30 ℃水浴鍋中,使用氮氣持續(xù)曝氣進(jìn)行氟西汀降解實驗,定期從鹽水瓶中取樣分析測定。每組實驗設(shè)置3個平行樣,取3個平行樣的平均值作為實驗結(jié)果。實驗組反應(yīng)體系的菌體濃度OD600為0.50,乳酸鈉濃度為10 mmol·L-1,Fe3+濃度為10 mmol·L-1,氟西汀濃度為4 mg·L-1。質(zhì)控組不添加細(xì)菌,其余條件與實驗組一致。滅活菌組將等量細(xì)菌經(jīng)高壓滅活后添加到4 mg·L-1氟西汀的培養(yǎng)基中,其余條件均與實驗組反應(yīng)體系一致。對照組(CK)不添加氟西汀,其余條件均與實驗組反應(yīng)體系一致。

1.4 氟西汀的濃度測定

使用一次性無菌注射器在降解2、4、6、8、10、12 h時取樣,吸取溶液0.20 mL,于10 000 r·min-1離心10 min后(離心半徑為6 cm)使用0.22 μm孔徑水系濾膜過濾,用高效液相色譜進(jìn)行分析測定。色譜柱為C18 色譜柱(15 μm , 4.5 mm × l5 mm),流動相為v(甲醇)∶v(0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液)=55∶45,流速為1 mL·min-1,檢測波長為230 nm,柱溫為30 ℃,檢測器為二極管陣列。

1.5 提取總核糖核酸(RNA)與建庫測序

對于培養(yǎng)4 h后的菌株(每組3個平行),在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min(離心半徑為6 cm)收集菌體。RNA采用TRIzol(Invitrogen)法提取,利用Nanodrop 2000對RNA濃度和純度進(jìn)行檢測,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,Agilent 2100測定RNA完整性數(shù)值(RIN)。單次建庫要求RNA總量≥1 μg,ρ≥35 ng·μL-1,OD260/280≥1.80,OD260/230≥1.0。

對于試驗組和對照組的RNA(每組3個平行)進(jìn)行建庫測序,RNA測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用TruSeqTM RNA試劑盒(Illumina,美國)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫,使用Illumina HiSeq X Ten(2×150bp)進(jìn)行RNA-seq雙端測序。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切,得到高質(zhì)量的處理后數(shù)據(jù)(clean data)。每個樣本中的高質(zhì)量測序片段(reads)比對已經(jīng)注釋的參考基因組,獲得用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)匹配,同時對此次測序的比對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估。ShewanellaoneidensisMR-1參考基因組為NC_004347(GenBank accession)。

1.6 差異表達(dá)分析與功能富集

利用每百萬測序量匹配到該基因每千個堿基的單端片段的數(shù)量(transcripts per million reads,TPM)來計算實驗組和對照組的基因表達(dá)量,分析識別實驗組和對照組之間的差異表達(dá)基因。在獲得差異表達(dá)基因的表達(dá)量水平后,利用DESeq2對不同試驗組間基因差異表達(dá)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)進(jìn)行注釋分析和顯著性富集分析,確定差異表達(dá)基因主要行使的生物學(xué)功能及參與氟西汀降解的生化代謝途徑,從而推測ShewanellaoneidensisMR-1耐受和降解氟西汀的分子機(jī)理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Shewanella oneidensis MR-1降解氟西汀的特性

由圖1可以看出,ShewanellaoneidensisMR-1對體系中氟西汀的降解率隨時間增加而增加,氟西汀濃度在0～4 h快速下降,4 h降解率達(dá)78.51%,降解速率為0.94 mg·L-1·h-1;6～12 h氟西汀的降解速率逐漸減小,12 h降解率達(dá)93.12%。實驗組ShewanellaoneidensisMR-1對氟西汀的去除率都顯著高于空白不加菌的質(zhì)控組(P<0.01),說明氟西汀的去除主要依賴于ShewanellaoneidensisMR-1的厭氧降解作用。滅活菌組菌體對氟西汀的去除率約為11%,說明菌體對氟西汀具有一定的吸附作用。因此,ShewanellaoneidensisMR-1對氟西汀的去除主要依賴于降解作用,吸附作用貢獻(xiàn)較小。

實驗組反應(yīng)體系的菌體濃度OD600=0.50,乳酸鈉濃度為10 mmol·L-1、Fe3+濃度為10 mmol·L-1,氟西汀濃度為4 mg·L-1;質(zhì)控組不添加細(xì)菌,滅活菌組添加等量滅活細(xì)菌,其余條件與實驗組一致。

2.2 Shewanella oneidensis MR-1在降解氟西汀后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

利用Illumina Hiseq高通量測序平臺對降解氟西汀后的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序,表1統(tǒng)計了本次轉(zhuǎn)錄組原始產(chǎn)出數(shù)據(jù)和進(jìn)行質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)。堿基質(zhì)量值反映了識別堿基的數(shù)據(jù)精確性,堿基質(zhì)量值(Q)越高,說明測序錯誤率越低,一般認(rèn)為Q>20即在可接受范圍。由表1數(shù)據(jù)可知,對照組和實驗組的Q值基本在20以上,對照組占了97.94%,A組占了97.79%。所以此次的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好,達(dá)到后續(xù)基因分析要求。

表1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2.1基因差異表達(dá)分析

根據(jù)P<0.05與|lgCF|≥2(CF為差異倍數(shù))的原則來篩選ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后與對照(不含氟西汀)之間的差異表達(dá)基因。圖2是ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后實驗組與對照組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因分布。在降解氟西汀后,ShewanellaoneidensisMR-1共獲得4 797 個差異表達(dá)基因,其中2 255個基因顯著上調(diào),2 368個基因顯著下調(diào)。該結(jié)果說明,氟西汀在降解過程中改變了ShewanellaoneidensisMR-1的基因表達(dá),菌株可以通過上調(diào)或下調(diào)部分基因來應(yīng)對氟西汀的刺激,維持細(xì)胞正常生長。

P′為校正P值,CF為差異倍數(shù)。數(shù)據(jù)點越靠近左上角或右上角表示下調(diào)或上調(diào)越顯著。

2.2.2差異表達(dá)基因GO功能分析

為進(jìn)一步揭示ShewanellaoneidensisMR-1對氟西汀代謝的功能響應(yīng),對氟西汀處理組和對照組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO注釋和富集分析。通過GO功能分析,可得到差異表達(dá)基因顯著富集的GO 通路,確定差異表達(dá)基因與生物學(xué)功能的關(guān)系。GO數(shù)據(jù)庫將基因的功能分為3大類:生物學(xué)過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)。選取最顯著富集的20個GO 通路進(jìn)行注釋分析(圖3),根據(jù)差異表達(dá)基因的GO注釋分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),參與生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能的差異表達(dá)基因比例依次為4.68%、53.07%和42.25%。差異表達(dá)基因數(shù)量最多的GO 通路屬于細(xì)胞組分和分子功能。其中在細(xì)胞組分類別中與細(xì)胞膜的組成部分有關(guān)的差異表達(dá)基因最多(311個)。分子功能分類中基因數(shù)目最多的差異表達(dá)基因與ATP結(jié)合、DNA結(jié)合和金屬離子結(jié)合有關(guān),分別含有94、93、93個表達(dá)基因,這些基因與電子的跨膜運輸有關(guān)。

GO的二級分類

選取最顯著富集的20個GO 通路進(jìn)行富集分析,由圖4可知,上述GO通路主要富集到氨基酸代謝和有機(jī)酸代謝相關(guān)的通路,其中有機(jī)酸代謝過程(organic acid metabolic process)、小分子代謝過程(small molecule catabolic process)和羧酸代謝過程(carboxylic acid catabolic process)可能與氟西汀的降解有關(guān)。

圖4 基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)富集分析

2.2.3差異表達(dá)基因KEGG功能分析

KEGG數(shù)據(jù)庫一般用來描述細(xì)菌代謝通路,通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫可以探索微生物體內(nèi)各種物質(zhì)的代謝過程。因此,KEGG數(shù)據(jù)庫中豐富的通路信息有助于從系統(tǒng)水平研究基因的生物學(xué)功能。KEGG富集分析能夠確定差異表達(dá)基因所參與的生物學(xué)功能,其中富集到的有4大類代謝通路:代謝(M)、細(xì)胞過程(CP)、遺傳信息處理(GIP)和環(huán)境信息處理(EIP)。圖5為實驗組與對照組差異表達(dá)基因的KEGG通路注釋分析,4大代謝通路的差異表達(dá)基因所占比例分別為63.33%(代謝)、13.90%(細(xì)胞過程)、6.95%(遺傳信息處理)和15.82%(環(huán)境信息處理)。圖5展示了與耐受和降解氟西汀有關(guān)的通路,其中差異表達(dá)基因數(shù)量最多的KEGG通路屬于代謝(M)。代謝通路中差異表達(dá)基因最多的與氨基酸代謝(amino acid metabolism)有關(guān),含有117個差異表達(dá)基因。并且像代謝(M)中碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、輔因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、能量代謝(energy metabolism)的基因也有較多的表達(dá),分別含有54、79、56個表達(dá)基因,這說明氟西汀的降解需要細(xì)菌進(jìn)行正常的生命活動提供能量。遺傳信息處理(GIP)和環(huán)境信息處理(EIP)中的細(xì)胞運動(cell motility)和膜轉(zhuǎn)運(membrane transport)較多基因的表達(dá)也說明氟西汀降解需要跨膜的能量傳遞過程。

圖5 京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)注釋分析

選取最顯著富集的9個KEGG通路進(jìn)行分析(圖6),在代謝通路中除了富集到氨基酸合成和代謝相關(guān)通路外,還富集到二元酸代謝(C5-Branched dibasic acid metabolism)、丙酸代謝(Propanoate metabolism)等小分子有機(jī)酸代謝的通路。這些通路反映了ShewanellaoneidensisMR-1相關(guān)基因可能在耐受和降解氟西汀方面發(fā)揮功能。

圖6 京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)富集分析

2.2.4與耐受相關(guān)的功能基因分析

通過對氟西汀處理后ShewanellaoneidensisMR-1的轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)一些顯著上調(diào)的基因與菌株的耐性有關(guān)(表2)。表2列出了12個與菌株耐受作用相關(guān)的基因,與應(yīng)激相關(guān)的基因中包膜應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白基因、毒素-抗毒素體系基因、氧化應(yīng)激防御蛋白高表達(dá)且顯著性上調(diào)。其中氧化應(yīng)激防御蛋白基因顯著上調(diào)13.37倍(P<0.01),且高表達(dá)(TPM值=910.48);包膜應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白基因均高表達(dá),包膜應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白PspB基因和PspC基因的表達(dá)量分別為2 392.20和3 598.60(TPM)。另外,與細(xì)胞膜組成相關(guān),可以保護(hù)細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的噬菌體休克蛋白PspA基因、ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因、外膜蛋白組裝因子基因均顯著上調(diào)且高表達(dá)。噬菌體休克蛋白PspA基因表達(dá)量高達(dá)5 594.62,上調(diào)倍數(shù)為4.58倍(P<0.01);ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)量為530.07,上調(diào)倍數(shù)最高為11.64倍(P<0.01);外膜蛋白組裝因子基因表達(dá)量最高為344.29,上調(diào)倍數(shù)為3.44倍(P<0.01)。這些基因的表達(dá)量顯著性上調(diào),說明在ShewanellaoneidensisMR-對氟西汀的耐受中發(fā)揮了重要的作用。

表2 Shewanella oneidensis MR-1轉(zhuǎn)錄組中部分與氟西汀耐受相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.2.5與降解相關(guān)的功能基因分析

表3列出了高表達(dá)且差異倍數(shù)大于3的基因,這些基因都與氟西汀的降解相關(guān)。與氟西汀降解相關(guān)的功能基因主要分為調(diào)控氧化還原酶和電子傳遞相關(guān)的基因。氧化還原相關(guān)的基因中硝基還原酶NfsB基因、丙酮酸脫氫酶基因、高絲氨酸脫氫酶Ⅰ基因、厭氧核糖核苷-三磷酸還原酶基因等發(fā)生顯著上調(diào)。其中硝基還原酶NfsB基因表達(dá)量為2 572.95,上調(diào)倍數(shù)達(dá)4.85倍(P<0.01);高絲氨酸脫氫酶Ⅰ基因表達(dá)量為428,上調(diào)倍數(shù)高達(dá)36.70(P<0.01)。電子傳遞相關(guān)的基因中乳酸利用蛋白基因、細(xì)胞色素C基因、細(xì)胞色素C基因過氧化物酶基因、細(xì)胞色素C成熟蛋白CcmE基因等表達(dá)量均顯著上調(diào),其中乳酸利用蛋白基因表達(dá)量為2 572.95,上調(diào)倍數(shù)高達(dá)43.44倍(P<0.01);細(xì)胞色素C基因的表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)達(dá)12.95倍(P<0.01),高達(dá)1 236.11(TPM)。結(jié)果表明,調(diào)控氧化還原酶和電子傳遞相關(guān)的基因在氟西汀的降解轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著十分重要的作用。

表3 Shewanella oneidensis MR-1轉(zhuǎn)錄組中部分與氟西汀降解相關(guān)的差異表達(dá)基因

3 討論

對ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀進(jìn)行研究,12 h氟西汀的去除率達(dá)93.12%,降解速率達(dá)0.94 mg·L-1·h-1(圖1)。實驗結(jié)果表明,ShewanellaoneidensisMR-1能夠有效降解氟西汀。氟西汀微生物降解主要分為單一菌中降解和微生物群落降解。MOREIRA等[10]探究了LabrysportucalensisF11降解氟西汀的性能,發(fā)現(xiàn)其在2 d內(nèi)可將2 μmol·L-1氟西汀完全降解。PALMA等[9]利用厭氧還原細(xì)菌菌落降解氟西汀,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌落在28 d可以去除體系中69%±12%的氟西汀(20 mg·L-1)。因此,ShewanellaoneidensisMR-1在厭氧條件下對氟西汀的降解更為高效,是一個具有應(yīng)用前景的微生物處理技術(shù)。

ShewanellaoneidensisMR-1的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,氟西汀處理條件下的菌株與不添加氟西汀對照組的基因表達(dá)有很大的差異,共有2 255個顯著上調(diào)基因和2 368個顯著下調(diào)基因(圖2),說明在氧化應(yīng)激條件下ShewanellaoneidensisMR-1體內(nèi)存在一個自我調(diào)節(jié)的系統(tǒng),通過調(diào)控一系列基因的表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境的改變。差異表達(dá)基因的GO富集分析顯著富集到支鏈氨基酸異亮氨酸的生物合成與纈氨酸代謝過程(圖4);KEGG同樣也富集到支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成與代謝通路(圖6)。據(jù)報道,控制支鏈氨基酸合成與代謝的基因在清除自由基及增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力方面有明顯作用,補(bǔ)充支鏈氨基酸可上調(diào)活性氧(ROS)防御系統(tǒng)基因,降低ROS的產(chǎn)生[19,20]。這些支鏈氨基酸的合成與代謝可能與氟西汀降解轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的應(yīng)激相關(guān)。GO富集分析還富集到氧酸、有機(jī)酸、羧酸等小分子有機(jī)酸的合成與代謝(圖4),KEGG同樣也富集到丙酸、C5二元酸小分子有機(jī)酸的代謝通路(圖6)。已有研究證實,小分子有機(jī)酸可以加速細(xì)菌產(chǎn)生ROS,從而促進(jìn)芳香族化合物的降解[21]。因此,這些小分子有機(jī)酸的合成與代謝可能與氟西汀降解轉(zhuǎn)化相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果表明,在ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后出現(xiàn)上調(diào)的2 255個表達(dá)差異顯著的基因中,與支鏈氨基酸以及小分子有機(jī)酸的合成與代謝相關(guān)基因是研究細(xì)菌耐受和降解氟西汀機(jī)理的關(guān)鍵點。此外,GO富集分析結(jié)果表明,差異基因富集在細(xì)胞膜的組成部分,這可能與氟西汀降解過程中的膜運動相關(guān)。氟西汀的降解可分為胞內(nèi)和胞外作用,一方面,氟西汀可與細(xì)胞膜進(jìn)行相互作用[22],進(jìn)入胞內(nèi)被ShewanellaoneidensisMR-1降解;另一方面,ShewanellaoneidensisMR-1對有機(jī)污染物的降解和胞外電子傳遞有關(guān),胞外電子傳遞過程與細(xì)胞膜的跨膜運輸相關(guān)[23]。

在ShewanellaoneidensisMR-1的應(yīng)激反應(yīng)中,與膜蛋白相關(guān)的包膜應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白基因、外膜蛋白組裝因子基因和ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因顯著上調(diào)且高表達(dá)(P<0.01)(表2),說明菌株可以通過調(diào)控細(xì)胞膜蛋白基因的表達(dá)來應(yīng)對環(huán)境的變化。研究表明,膜蛋白可以保護(hù)細(xì)菌免受各種環(huán)境脅迫,ABC轉(zhuǎn)運蛋白作為最大的膜蛋白家族之一,在研究解毒和耐藥性方面具有重要意義[24]。這些控制ABC轉(zhuǎn)運蛋白的相關(guān)功能基因發(fā)生上調(diào)且高表達(dá),說明其在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。有研究表明,氟化物可以對微生物產(chǎn)生脅迫[25]。微生物可以通過毒素-抗毒素(TA)體系應(yīng)對產(chǎn)生脅迫的有害化學(xué)物質(zhì),以維持細(xì)菌的正?；顒覽26]。表2中TA系統(tǒng)的基因明顯上調(diào)并且高表達(dá),這可能與ShewanellaoneidensisMR-1通過提高調(diào)控TA系統(tǒng)功能基因的表達(dá)來應(yīng)對氟化物的脅迫有關(guān)。氧化應(yīng)激蛋白可以增強(qiáng)細(xì)菌對氧化環(huán)境的耐受能力,保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整以進(jìn)行正常的生命活動[27]。表2中氧化應(yīng)激蛋白基因的表達(dá)量明顯增加,說明ShewanellaoneidensisMR-1通過提高自身的抗氧化能力應(yīng)對電子傳遞過程中產(chǎn)生的ROS。噬菌體休克蛋白在保護(hù)細(xì)胞膜的功能上發(fā)揮了十分重要的作用,一般可以用于消除細(xì)胞受損蛋白[28]。實驗組中噬菌體休克蛋白基因的表達(dá)量顯著增加,說明其在ShewanellaoneidensisMR-1應(yīng)對氟西汀的應(yīng)激中具有十分重要的作用。

目前推測含氟有機(jī)化合物微生物降解的路徑主要有加氧、還原、水解、脫氟等[29-30]。KHAN等[31]已經(jīng)報道了微生物降解氟西汀的路徑是將氟西汀轉(zhuǎn)化成4-(三氟甲基)苯酚(TFMP)和3-(甲基氨基)-1-苯基丙烷-1-醇,最終轉(zhuǎn)化為三氟乙酸鹽和氟離子。在氟西汀微生物的降解途徑中,氧化還原過程是降解的關(guān)鍵步驟之一。ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后,一些與氧化還原作用相關(guān)的基因發(fā)生了顯著的變化,這可能與降解氟西汀有著密切的聯(lián)系。在ShewanellaoneidensisMR-1 降解氟西汀過程中,氧化還原相關(guān)的基因包括厭氧核糖核苷-三磷酸還原酶基因、蛋氨酸還原酶基因、亞甲基四氫葉酸還原酶基因、高絲氨酸脫氫酶Ⅰ基因、4Fe-4S脫氫酶基因、丙酮酸脫氫酶基因均高表達(dá)且顯著上調(diào)(P<0.01)(表3)。高絲氨酸脫氫酶I、4Fe-4S脫氫酶、丙酮酸脫氫酶都被報道與芳香化合物的微生物降解有關(guān),它們都可以參與污染物的氧化還原反應(yīng)[32-34]。表3中控制這些酶的基因表達(dá)量均有不同程度的增加,說明這些基因都與氟西汀降解轉(zhuǎn)化有關(guān)。有研究證明,氟磺胺草醚可以通過硝基還原酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化降解,因此該研究中硝基還原酶NfsB基因的上調(diào)說明該基因在氟西汀的降解中發(fā)揮了一定的貢獻(xiàn)[22]。實驗中采取的電子供體為乳酸鈉,由表3可知乳酸利用蛋白基因顯著上調(diào)且高表達(dá)(P<0.01),說明ShewanellaoneidensisMR-1可以利用乳酸鈉進(jìn)行生命活動并產(chǎn)生電子。目前,ShewanellaoneidensisMR-1胞外電子傳遞途徑主要分為直接電子傳遞和間接電子傳遞,其中直接電子傳遞用外膜細(xì)胞色素C與胞外電子受體直接接觸進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移[35]。因此控制細(xì)胞色素C產(chǎn)生的相關(guān)基因可以反映電子的傳遞效率變化。表3中控制細(xì)胞色素C產(chǎn)生與代謝相關(guān)基因表達(dá)均有不同程度的增加,說明在氟西汀降解過程中電子傳遞的效率明顯增加。綜上,氧化還原和促進(jìn)胞外電子傳遞的相關(guān)基因是ShewanellaoneidensisMR-1厭氧降解氟西汀的關(guān)鍵基因。

4 結(jié)論

ShewanellaoneidensisMR-1通過胞外電子傳遞機(jī)制可以有效去除氟西汀,12 h氟西汀的去除率達(dá)93.12%,降解速率達(dá)0.94 mg·L-1·h-1。研究利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析得到ShewanellaoneidensisMR-1對氟西汀刺激以及降解的功能基因。菌株在降解氟西汀后與不添加氟西汀培養(yǎng)菌株的轉(zhuǎn)錄組比對中共獲得4 797個差異表達(dá)基因,說明ShewanellaoneidensisMR-1可以通過基因的上下調(diào)來應(yīng)對氟西汀的刺激,維持細(xì)胞正常的生命活動。在差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析中都富集到氧化應(yīng)激相關(guān)的支鏈氨基酸合成與代謝基因以及與氟西汀降解相關(guān)的小分子酸合成與代謝基因。高差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果表明,ShewanellaoneidensisMR-1對氟西汀的應(yīng)激主要依賴于調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白基因、ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因、噬菌體休克蛋白PspA基因,以提高對細(xì)菌對于環(huán)境的適應(yīng)能力。ShewanellaoneidensisMR-1對氟西汀的降解主要通過調(diào)控氧化還原酶和電子傳遞相關(guān)基因,尤其是細(xì)胞色素C基因、硝基還原酶NfsB基因、乳酸利用蛋白基因。研究為ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀的功能基因和降解機(jī)理提供了豐富的基因數(shù)據(jù),同時也為抗抑郁藥污染的微生物修復(fù)技術(shù)提供了理論參考。