華西廣醫(yī)1號急性毒性、鼻黏膜刺激性和增強(qiáng)免疫功能的研究

楊寧, 李軼, 彭成, 張明, 謝曉芳*

(1.廣安市人民醫(yī)院, 廣安 638001; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)/西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 611137;3.南充市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心, 南充 637000)

呼吸道感染(respiratory tract infection, RTI)是人類最常見、發(fā)病率最高的一大類疾病, 2018年的研究報(bào)道,在美國癥狀性流感的年發(fā)病率在3%～11%,兒童發(fā)病率最高[1];而針對中國2015—2020年的法定傳染病的一項(xiàng)疫情分析顯示,流感以年發(fā)病率77.178 5/10萬排在年均發(fā)病率第4位,僅次于手足口病、病毒性肝炎和其他感染性腹瀉[2]。當(dāng)前,疫苗接種是預(yù)防呼吸道感染,尤其是傳染性病毒感染的最有效辦法之一,然而由于致病病毒種類多、變異快等原因,還有許多RTI暫無疫苗可用,此時(shí)可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物成為防治RTI研究方向。霧化給藥是防治呼吸道感染的局部用藥方式,霧化的藥物通過口腔、鼻腔黏膜血管的吸收,或藥物直接到達(dá)咽、喉、支氣管等靶器官,作用迅速,且能避免肝臟的首過效應(yīng)[3-4],尤其是近年來有關(guān)霧化裝置的研究與發(fā)展很迅速[5],及近三年在新型冠狀病毒感染性肺炎疫情的全球防治發(fā)展下,使霧化制劑研發(fā)成為新熱點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥湯劑存在煎煮不便和胃腸道刺激等不良反應(yīng),而中藥霧化給藥方便,不良反應(yīng)少,尤其是可避免口服給藥的胃腸道刺激,避免患者對傳統(tǒng)中藥湯劑味苦的不適,臨床使用廣泛[6-7]。本文研究基于此優(yōu)點(diǎn)對院內(nèi)常用于治療RTI相關(guān)處方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,擬定華西廣醫(yī)1號處方并進(jìn)行制劑開發(fā)。該品種的功效解毒祛濕,益氣固表,擬用于防治上呼吸道感染,如預(yù)防感冒、流行性感冒、新冠肺炎病毒感染等,以滿足臨床需求。若能開發(fā)成功且有較好的預(yù)防作用,將對保障全球公共衛(wèi)生安全和人類健康有重要意義。

中醫(yī)認(rèn)為疾病的發(fā)生是正氣虛損、邪氣侵襲所致,故早在《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》就有“正氣存內(nèi),邪不可干”的認(rèn)識,即人體正氣充足,衛(wèi)外有固,則外邪不得侵襲。玉屏風(fēng)散首載于南宋張松《究原方》,由防風(fēng)、黃芪、白術(shù)三味中藥組成,功效為益氣固表止汗,因其功效似御風(fēng)屏障,珍貴如玉,故名玉屏風(fēng)[8]?，F(xiàn)代研究證實(shí),玉屏風(fēng)散含有黃酮、皂苷、揮發(fā)油、多糖等成分,具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗疲勞、抗呼吸系統(tǒng)疾病等作用[9-10]。在臨床上玉屏風(fēng)散用于小兒反復(fù)性呼吸道感染可縮短病程、降低復(fù)發(fā)率并增強(qiáng)免疫功能,相對而言,匹多莫德、轉(zhuǎn)移因子口服液等化學(xué)藥品對反復(fù)上呼吸道感染無降低復(fù)發(fā)率的作用[11-12],可能是因?yàn)橛衿溜L(fēng)散是通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用使然,有開發(fā)為預(yù)防上呼吸道感染的可能。

鑒于目前暫無定位為預(yù)防上呼吸道感染的霧化中成藥,廣安市人民醫(yī)院以霧化劑為擬開發(fā)制劑,完成了廣醫(yī)1號的藥學(xué)研究。按照中藥新藥的開發(fā)要求,需進(jìn)行系統(tǒng)的臨床前有效性和安全性評價(jià)。為后續(xù)研發(fā)是否開展及開發(fā)方向提供參考,按照國家新藥開發(fā)的相關(guān)要求[13-14],并結(jié)合其防治感染的臨床定位,現(xiàn)對華西廣醫(yī)1號開展急性毒性試驗(yàn)、鼻黏膜刺激性試驗(yàn)和增強(qiáng)免疫功能的活性評價(jià),以期為該院內(nèi)制劑的進(jìn)一步開發(fā)和臨床預(yù)試驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

華西廣醫(yī)1號為深褐色液體,由南充市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供,批號20220301,藥物含量:每1 mL相當(dāng)于原生藥 0.68 g;臨床上用生理鹽水稀釋10倍后使用。留樣標(biāo)本存放于西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。玉屏風(fēng)口服液,湖北東信藥業(yè)有限公司,批號211102。生脈飲口服液,北京同仁堂生產(chǎn),批號20260425。貞芪扶正膠囊,甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司,批號J20210605,每12粒膠囊相當(dāng)于生藥25 g,實(shí)驗(yàn)前用純水配置成0.5 g/mL溶液備用。環(huán)磷酰胺,SIGMA-ALORICH公司,批號LRAC0295,用生理鹽水配成5 mg/mL使用。

1.2 受試動(dòng)物

昆明種小鼠,SPF級,雌雄各半,3周齡;昆明種小鼠,SPF級,雌雄各半,18～22 g;SD大鼠,SPF級,雌雄各半,180～200 g,均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2019-11;豚鼠,普通級,雌性,280～300 g,由壁山區(qū)騰鑫養(yǎng)殖場生產(chǎn),生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2017-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房,使用許可證號:SCXK(川)2020-124。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

印度墨汁,Scientific Phygene公司生產(chǎn),批號180625。5%雞紅細(xì)胞,南京森貝伽生物科技有限公司,批號20220528。血清溶血素補(bǔ)體的制備:取2只健康、成年雌性豚鼠,麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,3 500 r/min離心15 min,取血清混合,即得血清溶血素補(bǔ)體,于-80 ℃分裝保存。試驗(yàn)前用無菌生理鹽水稀釋成10%使用。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

403壓縮空氣式霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);YLS-8A小動(dòng)物霧化箱(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司);移液器(德國eppendorf股份公司);Cytation 5細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(美國伯滕儀器有限公司);AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);Allegra X-30R高速冷凍離心機(jī)(德國貝克曼);BC-5120全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(邁瑞); Eclipse Ci-L正置顯微鏡(日本Nikon)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 華西廣醫(yī)1號對小鼠急性毒性的影響

取昆明小鼠40只,雌雄各半,按體重隨機(jī)分為空白組和給藥組,每組20只。禁食不禁水14 h后,將小鼠置于霧化箱內(nèi)霧化吸入0.34 g/mL藥液30 min,24 h內(nèi)共4次(相當(dāng)于34生藥g/kg),每次間隔6 h。空白組給予霧化吸入生理鹽水。每次霧化給藥后,立即取出小鼠,置于正常飼養(yǎng)環(huán)境,觀察其一般狀態(tài)及死亡情況,記錄異常變化的表現(xiàn)和時(shí)間,給藥后連續(xù)觀察14 d。于第1、3、7、14天稱體重,并測量第2、3、7、14天攝食量。在第14天小鼠禁食12 h后脫頸處死,大體解剖觀察內(nèi)臟情況,并剖取心、肝、脾、肺、腎,稱質(zhì)量計(jì)算臟器系數(shù)。

2.2 大鼠鼻黏膜刺激性試驗(yàn)

取SD大鼠24只,雌雄各半,按體重隨機(jī)分為正常對照組和 廣醫(yī)1號高、低劑量組,每組8只大鼠。禁食不禁水12 h后開始給藥。正常對照組每日經(jīng)右側(cè)鼻孔以移液器連接PE軟管定量滴入30 μL生理鹽水, 廣醫(yī)1號高、低劑量組大鼠以相同給藥方式分別給予0.34、0.068 g/mL藥液30 μL,每日1次,連續(xù)7 d。每次給藥后,觀察大鼠是否出現(xiàn)噴嚏、撓鼻、甩頭等行為。第7天給藥1 h后,每組隨機(jī)取4只大鼠,雌雄各半,脫頸處死,剪開鼻腔取鼻中隔黏膜,用生理鹽水洗凈血塊及黏液,放置于多聚甲醛溶液中4 ℃保存,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。剩余大鼠正常喂飼,不再給藥,于第10天同上處死,剖取鼻中隔觀察并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2.3 幼齡小鼠免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)

取三周齡的昆明種小鼠50只,雌雄各半,按體重隨機(jī)分為正常對照組、玉屏風(fēng)散組和 廣醫(yī)1號高、中、低劑量組,每組10只。正常對照組霧化生理鹽水30 min/次,玉屏風(fēng)散組給予灌胃玉屏風(fēng)口服液10 mL/kg每日1次, 廣醫(yī)1號高、中、低劑量組均給予0.068 g/mL的廣醫(yī)1號藥液霧化分別為60、30、15 min/次,相當(dāng)于5.10 g生藥/kg、2.55 g生藥/kg、1.275 g生藥/kg;每天霧化3次,每次間隔6 h,連續(xù)給藥7 d;玉屏風(fēng)散組每日灌胃1次,10 mL/kg。末次給藥后24 h,將小鼠處死,剖取脾臟和胸腺稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。

2.4 環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)

取昆明小鼠48只,雌雄各半,按體重隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、生脈飲組和 廣醫(yī)1號高、中、低劑量組,每組8只。正常對照組腹腔注射生理鹽水10 mL/kg,其余各組均腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg,連續(xù)2 d,從第3天起隔日注射1次,連續(xù)至第10天。從造模第1天開始,正常對照組和模型對照組給予生理鹽水霧化吸入,30 min/次,每天3次;生脈飲組灌胃生脈飲口服液10 mL/kg,每天1次,廣醫(yī)1號高、中、低劑量組均給予0.068 g/mL的廣醫(yī)1號藥液霧化吸入,分別為60、30、15 min/次;霧化給藥每天3次,每次間隔6 h,給藥劑量分別為5.10 g生藥/kg、2.55 g生藥/kg、1.275 g生藥/kg連續(xù)給藥10 d。第11天上午,各組小鼠眼眶后靜脈叢取血,采用血細(xì)胞分析儀測定外周血中WBC、RBC和HGB水平;當(dāng)日下午進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬碳粒廓清測試:每只小鼠尾靜脈注射墨汁(印度墨汁1∶3生理鹽水稀釋)0.1 mL/10 g,于注射墨汁后第2分鐘(t1)、第10分鐘(t2)時(shí),眼眶取血20 μL,置入2 mL 1% Na2CO3溶液試管,搖勻,在680 nm波長處測OD值分別為OD1、OD2。10 min時(shí)處死小鼠,剖取肝、脾、胸腺稱重,計(jì)算吞噬指數(shù)α及臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器重量/體重

(1)

(2)

2.5 環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠血清溶血素試驗(yàn)

取昆明小鼠60只,雌雄各半,按體重隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、貞芪扶正組和廣醫(yī)1號高、中、低劑量組,每組10只小鼠。環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型制備方法及廣醫(yī)1號高、中、低劑量組給藥劑量、方式均同2.4節(jié),貞芪扶正組灌胃貞芪扶正膠囊5 g/kg,每日1次。于實(shí)驗(yàn)第5天,各組小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞0.2 mL/只致敏;實(shí)驗(yàn)第10天末次給藥1 h后,各組小鼠均眼眶取血,離心取血清,用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋血清1 mL、5%雞紅細(xì)胞0.5 mL、10%補(bǔ)體0.5 mL混勻,37 ℃保溫30 min后置冰上終止反應(yīng),再離心取上清,540 nm波長測OD值,作為溶血素生成值。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不符合正態(tài)分布且方差不齊時(shí),采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

第一次給藥后,給藥組小鼠有豎毛,10 min后消失;第二次、第三次給藥時(shí)可見部分小鼠鼻尖略紅,但無其余不適,鼻尖紅在1 h內(nèi)緩解;繼續(xù)觀察14 d,無明顯不適反應(yīng)。對兩組小鼠的體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示,試驗(yàn)期間雌性小鼠或雄性小鼠的空白組和給藥組間無顯著性差異;雌雄合并統(tǒng)計(jì)表2顯示,給藥后第2天,給藥組雄性小鼠的攝食量較空白組有降低,至第2天開始,空白組與給藥組的平均攝食量相近。大體解剖觀察無明顯異常,由表3可知,給藥組肝、心、脾、肺、腎指數(shù)與空白組比較無異常。

表1 廣醫(yī)1號急性毒性試驗(yàn)對小鼠體重的影響Table 1 Effect of Guangyi No. 1 on body weight of mice in acute toxicity test

表2 廣醫(yī)1號急性毒性試驗(yàn)對小鼠攝食量的影響Table 2 Effect of Guangyi No. 1 on food intake of mice in acute toxicity test

表3 廣醫(yī)1號急性毒性試驗(yàn)對小鼠重要臟器的臟器指數(shù)影響Table 3 Effect of Guangyi No.1 on key organ indexes of in mice in acute toxicity test

綜上可見,廣醫(yī)1號以0.34 g/mL濃度在24 h內(nèi)霧化給藥4次,每次0.5 mL/只給藥,給藥劑量為34 g生藥/kg,無明顯急性毒性。

3.2 華西廣醫(yī)1號對大鼠鼻黏膜刺激性的影響

每日給藥后,兩組大鼠均在給藥時(shí)有短暫的噴嚏、撓鼻反應(yīng),但均在5 min內(nèi)緩解,與正常對照組比較,廣醫(yī)1號高、低劑量組的反應(yīng)稍強(qiáng),無其他不適反應(yīng)。

于給藥第7天后各組取部分大鼠解剖鼻黏膜,正常對照組無分泌物和充血反應(yīng),廣醫(yī)1號高劑量組個(gè)別大鼠鼻腔中有分泌物,鼻中隔黏膜稍有充血;停藥3 d后剩余大鼠解剖無異常。病理組織學(xué)檢查顯示,無論給藥7 d末還是停藥3 d末,正常對照組大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則緊密,固有層結(jié)締組織膠原纖維排列規(guī)則;給藥7 d末,廣醫(yī)1號低劑量組大鼠在給藥7 d末和停藥3 d末,鼻中隔黏膜亦均無明顯異常;廣醫(yī)1號高劑量組大鼠在給藥7 d末時(shí),鼻黏膜偶見炎性細(xì)胞浸潤,至停藥3 d末無異常,結(jié)果如圖1所示。參考文獻(xiàn)的評分標(biāo)準(zhǔn)[15]進(jìn)行評分:無改變或無明顯改變?yōu)?分;輕度充血,少量分泌物為1分;中度充血,分泌物較多為2分;重度瘀血,水腫,分泌物很多,黏膜變性為3分。結(jié)果如表4所示,兩個(gè)給藥組與正常對照組間無顯著性差異。

HE染色,Bar=100 μm,200×,紅色箭頭:炎性細(xì)胞圖1 廣醫(yī)1號對大鼠鼻中隔黏膜形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effect of Guangyi No.1 on histomorphology of nasal mucosa in rats

表4 廣醫(yī)1號對大鼠鼻中隔黏膜形態(tài)學(xué)評分的影響Table 4 Effect of Guangyi No.1 on histomorphological scores of nasal mucosa in rats

3.3 華西廣醫(yī)1號對幼齡小鼠免疫功能的影響

由表5可知,與正常對照組比較,玉屏風(fēng)散組和廣醫(yī)1號高劑量組的胸腺指數(shù)有升高趨勢,各組對脾臟指數(shù)無明顯升高作用。

表5 廣醫(yī)1號對幼齡小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響Table 5 Effects of Guangyi No.1 on organ indexes of thymus and spleen in immature mice

3.4 華西廣醫(yī)1號對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

由表6和表7可知,與正常對照組比較,模型對照組吞噬指數(shù)K和校正指數(shù)α均有降低趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,胸腺指數(shù)和外周血WBC數(shù)量顯著下降(P<0.01)。與模型對照組比較,生脈飲組的吞噬指數(shù)K和校正指數(shù)α均無升高,但胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.001), 廣醫(yī)1號高、中劑量組的噬指數(shù)K和校正指數(shù)α有升高趨勢,三個(gè)劑量組的胸腺指數(shù)有升高趨勢,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對照組比較,廣醫(yī)1號高、中劑量組的WBC、HGB均有升高趨勢,高劑量組的RBC也有升高趨勢;生脈飲對WBC、RBC、HGB均有升高趨勢,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 廣醫(yī)1號對免疫抑制小鼠吞噬指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 6 Effects of Guangyi No.1 on phagocytic index and thymus index in immunosuppressed mice

表7 廣醫(yī)1號對免疫抑制小鼠外周血WBC、RBC和HGB的影響Table 7 Effect of Guangyi No.1 on WBC, RBC, and HGB contents of peripheral blood in immunosuppressed mice

3.5 華西廣醫(yī)1號對免疫抑制小鼠血清溶血素生成的影響

由表8可知,與正常對照組比較,模型對照組吸光度顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較,廣醫(yī)1號中劑量組吸光度顯著升高(P<0.05),提示廣醫(yī)1號可增強(qiáng)免疫抑制小鼠免疫力;貞芪扶正組和廣醫(yī)1號高、低劑量組有也升高趨勢。

表8 廣醫(yī)1號對免疫抑制小鼠血清溶血素生成的影響Table 8 Effect of Guangyi No.1 on serum hemolysin production in immunosuppressed mice

4 討論與結(jié)論

藥物安全性與有效性是藥物的基本屬性,也是藥物開發(fā)時(shí)必須進(jìn)行的重要研究內(nèi)容。廣醫(yī)1號是由中藥經(jīng)典名方“玉屏風(fēng)散”化裁處方制備的制劑,擬臨床霧化給藥,用于預(yù)防上呼吸道感染,以提高群體,尤其是易感體質(zhì)人群對病原微生物侵襲的防御能力。針對其擬臨床擬用劑型、劑量和適應(yīng)癥,本研究對其進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、鼻黏膜刺激性試驗(yàn)和增強(qiáng)免疫功能試驗(yàn),以初步評價(jià)其安全性和有效性。

急性毒性是指機(jī)體在24 h內(nèi)一次或多次接觸外來藥物后所引起的中毒效應(yīng),被認(rèn)為是藥物安全性評價(jià)的第一步[16]。參考《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》等的要求,本研究開展了廣醫(yī)1號的小鼠急性毒性試驗(yàn)和大鼠鼻黏膜刺激性試驗(yàn)。經(jīng)預(yù)試,0.68 g/mL藥液太過濃稠,無法進(jìn)行霧化,經(jīng)無菌生理鹽水稀釋后的0.34 g/mL可進(jìn)行霧化,故以此為最高濃度進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示,24 h內(nèi)三次霧化吸入,除有短暫的豎毛、鼻尖紅外,無其他不適反應(yīng)。外來藥物的毒性可能會(huì)引起動(dòng)物拒食造成體重停止增長,甚至減輕。本藥對體重、攝食量無明顯影響,經(jīng)觀察14 d無明顯不良反應(yīng),亦無死亡,故對廣醫(yī)1號霧化給藥對小鼠的最大給藥量為34 g生藥/kg。藥物可對吸收部位具有刺激性,引起不良反應(yīng),故對本藥進(jìn)行大鼠鼻黏膜刺激性試驗(yàn),0.34 g/mL廣醫(yī)1號滴鼻大鼠右側(cè)鼻腔,僅給藥時(shí)有短暫噴嚏、撓鼻反應(yīng),病理結(jié)果顯示個(gè)別大鼠鼻中隔黏膜有少量炎性細(xì)胞浸潤、輕度充血;停藥3 d后無明顯病理變化;0.068 g/mL組大鼠鼻黏膜無明顯變化,提示廣醫(yī)1號在高濃度時(shí)對鼻黏膜有輕度刺激性,但停藥后可恢復(fù);擬用臨床濃度無明顯鼻黏膜刺激性。綜上,本藥霧化給藥,無明顯急性毒性和黏膜刺激性,可認(rèn)為本藥臨床應(yīng)用具有一定的安全性。

中藥 “益氣固表”功效常與免疫系統(tǒng)有關(guān)的特點(diǎn),認(rèn)為本藥可能具有增強(qiáng)免疫功能,是其防治上呼吸道感染的原理之一。據(jù)此,本文研究進(jìn)行了幼齡小鼠免疫器官測定和免疫抑制小鼠試驗(yàn)。免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫活性物質(zhì)組成,免疫器官的質(zhì)量如胸腺、脾臟、肝臟是衡量機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一[17]。巨噬細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞,當(dāng)外來抗原進(jìn)入機(jī)體能迅速將其吞噬和清除,巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一[18-19]。血清溶血素屬于免疫活性物質(zhì),由B淋巴細(xì)胞增殖分化為的漿細(xì)胞分泌的,其含量是衡量機(jī)體體液免疫功能的指標(biāo)之一[20-21]。環(huán)磷酰胺是常用的免疫抑制劑,可對機(jī)體白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞造成一定損害,用于誘導(dǎo)小鼠免疫抑制模型較成熟[22]。研究表明,環(huán)磷酰胺能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖和免疫器官發(fā)育,還能殺傷細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化所需的輔助細(xì)胞,進(jìn)而減少免疫細(xì)胞數(shù)量、降低抗體水平[23-24]。 在本次實(shí)驗(yàn)中小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺注射后,從外部特征看小鼠毛發(fā)稀疏無光澤、手感體溫降低、行動(dòng)遲緩,可能處于免疫抑制狀態(tài);從內(nèi)部特征看,小鼠免疫器官發(fā)育受到抑制,白細(xì)胞數(shù)目和抗體水平降低,可認(rèn)為本次實(shí)驗(yàn)成功利用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)創(chuàng)建小鼠免疫抑制模型通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力而預(yù)防上呼吸道感染具有意義,同時(shí)也符合“正氣存內(nèi),邪不可干”的病機(jī)認(rèn)識?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散能緩解地塞米松致小鼠自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性降低以及胸腺指數(shù)、脾指數(shù)降低,并升高白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞含量,降低中性粒細(xì)胞含量,升高CD4+/CD8+比值,提示玉屏風(fēng)散能增強(qiáng)免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫和非特異性免疫功能[25]。有效物質(zhì)基礎(chǔ)可能與類黃酮、皂苷、香豆素等成分通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用有關(guān)[26]。華西廣醫(yī)1號在玉屏風(fēng)散基礎(chǔ)方上加味芳香化濕代表藥藿香發(fā)揮增效作用,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)廣藿香具有抗病毒和調(diào)節(jié)免疫作用而用于呼吸道疾病[27-28],支持本方的組方。本文研究顯示,廣醫(yī)1號在0.068 g/mL下霧化給藥,對正常幼齡小鼠免疫器官胸腺和肝臟指數(shù)無明顯影響,提示該藥對正常機(jī)體免疫系統(tǒng)可能無明顯作用,不會(huì)引起機(jī)體免疫系統(tǒng)亢進(jìn)。相對而言,廣醫(yī)1號可顯著增強(qiáng)免疫低下小鼠的溶血素生成水平,并有增加其碳粒廓清吞噬指數(shù)K、校正指數(shù)α、胸腺指數(shù)及其外周血白細(xì)胞數(shù)目的作用趨勢,表明該藥能對抗環(huán)磷酰胺所致的免疫功能下降,增強(qiáng)體液免疫功能。

綜上,華西廣醫(yī)1號無明顯急性毒性和鼻黏膜刺激性,對正常小鼠免疫功能無明顯影響,對免疫抑制小鼠可升高溶血素水平、胸腺指數(shù)、增加白細(xì)胞數(shù)目的作用,表明其霧化給藥具有較好的安全性,并有溫和的提高免疫功能的作用,適用于預(yù)防上呼吸道感染。本文研究為華西廣醫(yī)1號的進(jìn)一步開發(fā)和臨床預(yù)試驗(yàn)提供了科學(xué)依據(jù),后續(xù)還需要進(jìn)行系統(tǒng)的安全性評價(jià),尤其是體內(nèi)體外抗病毒作用研究和機(jī)制研究,促進(jìn)其開發(fā)和推廣。