β-環(huán)糊精金屬有機(jī)骨架材料HPLC手性柱拆分噁唑禾草靈

張家昌,陸金富,沙濤,沈靜茹

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 分析化學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430074)

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,大多數(shù)手性農(nóng)藥是作為外消旋混合物施用的,盡管某種農(nóng)藥的生物活性通常只由一種異構(gòu)體決定,而其他異構(gòu)體通常用處不大(大部分單一手性源的對(duì)象,若能使之分離,即可減少一半的施藥量),甚至對(duì)非目標(biāo)生物產(chǎn)生毒副作用,這會(huì)誤判其潛在的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)[1]。隨著手性農(nóng)藥的概念越來越被接受,目前,學(xué)術(shù)界已經(jīng)對(duì)其開展了包括手性分離與合成、環(huán)境行為、生物代謝、毒理作用等[2]方面的研究,這對(duì)手性農(nóng)藥限制的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和監(jiān)管政策制定至關(guān)重要[3]。

噁唑禾草靈(Fenoxaprop-ethyl,FE)是一種芳氧基苯氧丙酸除草劑,研究表明,R-FE是除草活性異構(gòu)體,FE在生命體中和環(huán)境中的代謝物對(duì)生物體表現(xiàn)出對(duì)映選擇性[4]。例如,Xu等[5]研究了FE及其手性代謝物2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯(EHPP)、2-(4-羥基苯氧基)丙酸(HPPA)和6-氯-2,3-二氫苯并噁唑-2-酮(CDHB)對(duì)斑馬魚的影響,研究發(fā)現(xiàn)FE、FA、CDHB和EHPP的S型對(duì)映體比R型對(duì)映體毒性更大。使用FE的單一對(duì)映體能有效地降低消旋體施藥對(duì)生物體和環(huán)境的負(fù)面影響。目前,分離FE對(duì)映體的高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法,多采用的色譜柱為商業(yè)柱。例如,Yan等[6]采用全甲基化β-環(huán)糊精商業(yè)柱作為固定相,以甲醇和水作為流動(dòng)相,實(shí)現(xiàn)了FE對(duì)映體的分離,分析時(shí)間大于10 min;Liu等[7]使用Chiralpak IC商業(yè)手性柱對(duì)R-FE和S-FE的保留時(shí)間相差小,且分析時(shí)間長。

環(huán)糊精金屬有機(jī)框架材料(Cyclodextrin Metal-Organic Frameworks,CD-MOFs)是理想的手性高效液相色譜柱材料[8]。研究人員可以通過選擇不同的金屬離子、有機(jī)配體和環(huán)糊精的類型來調(diào)整CD-MOFs的結(jié)構(gòu)和性能。這類MOF材料的多孔結(jié)構(gòu)還可以提高樣品與固定相的相互作用,進(jìn)一步增強(qiáng)分離效率[9]。其能夠拆分一些傳統(tǒng)手性色譜柱中難以實(shí)現(xiàn)的高分子質(zhì)量化合物,CD-MOFs出色的手性選擇性,使之能夠有效地分離和鑒定各種手性分子,包括藥物、天然產(chǎn)物和農(nóng)藥等[10]。在HPLC手性色譜分析領(lǐng)域,CD-MOFs作為手性色譜柱的應(yīng)用已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展[11-12]。盡管如此,這一領(lǐng)域的研究仍然存在一些挑戰(zhàn),如合成方法的進(jìn)一步改進(jìn)優(yōu)化、CD-MOFs的穩(wěn)定性以及對(duì)一些復(fù)雜樣品的適用性。未來的研究應(yīng)致力于解決這些問題,并進(jìn)一步推動(dòng)CD-MOFs在HPLC手性色譜分析中的應(yīng)用。

本文采用蒸汽擴(kuò)散法合成了全新的β-環(huán)糊精和間羧基苯磺酰氯金屬有機(jī)骨架材料,通過加入交聯(lián)試劑將其鍵合在全多孔二氧化硅微球表面,形成復(fù)合材料(β-CD-MOF-P20@SiO2),以此作為HPLC手性固定相填料。在反相色譜模式下,以乙酸銨-三乙胺/乙酸緩沖液和乙腈作為流動(dòng)相,對(duì)手性農(nóng)藥噁唑禾草靈對(duì)映體進(jìn)行拆分研究,在所探究的色譜條件下,均能實(shí)現(xiàn)噁唑禾草靈兩對(duì)映體的基線分離,分離度RS大于7.30,說明該新型手性固定相對(duì)噁唑禾草靈對(duì)映體具有好的對(duì)映體選擇性。在最佳分離條件下,分離度可達(dá)9.89,與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的工作相比,該體系對(duì)噁唑禾草靈對(duì)映體分離效果更好,分析速度更快,重現(xiàn)性好,線性范圍寬,為噁唑禾草靈對(duì)映體的分離分析及單一對(duì)映體定性定量和制備提供了新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)試劑和藥品

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(HITACHI L-7000,Japan);傅里葉紅外光譜儀(Nicolet Nexus 470,USA);紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(Agilent Cary 5000,USA);X-射線衍射儀(Bruker D8,Germany);場發(fā)射電鏡(HITACHI SU8010,Japan);真空干燥箱(上海精宏XMTD-8222,中國);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(武漢科爾DF-101S,中國);自動(dòng)電位滴定計(jì)(上海偉業(yè)ZD-2型,中國);分析天平(Sartorius ALC-210.4,Germany)。

1.3 手性柱材料的合成

1.3.1β-環(huán)糊精摻雜間羧基苯磺酰氯金屬有機(jī)骨架材料的合成

采用蒸汽擴(kuò)散法合成:稱取適量的β-環(huán)糊精、間羧基苯磺酰氯和氯化鉀,置于燒杯中攪拌溶解,過濾后轉(zhuǎn)移至密閉容器中,加熱反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后,自然冷卻至室溫,過濾,用適量甲醇洗滌數(shù)次,烘干,得無色透明晶體產(chǎn)物β-CD-MOF-P20。

1.3.2 手性柱材料β-CD-MOF-P20@SiO2的合成

稱取適量上述β-CD-MOF-P20溶于溶劑中,加入一定量的氫化鈉,室溫下攪拌后將濾液轉(zhuǎn)移至三頸燒瓶中,加入適量偶聯(lián)劑,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱反應(yīng)5 h。然后,加入活化的全多孔二氧化硅微球,冷凝回流反應(yīng)24 h;反應(yīng)結(jié)束后,冷卻至室溫,過濾,產(chǎn)物用適量溶劑依次洗滌,放置烘箱中真空干燥,得白色固體粉末。

1.3.3 手性柱填充

稱取適量1.3.2的手性柱材料分散在50 mL勻漿液中,將其倒入勻漿罐中,以一定比例洗脫液作為流動(dòng)相,在25 MPa壓力下填充至不銹鋼空柱(4.6 mm×150 mm)。

1.4 實(shí)驗(yàn)前處理

樣品制備:準(zhǔn)確稱取噁唑禾草靈標(biāo)準(zhǔn)品,以甲醇作為溶劑,配置成標(biāo)準(zhǔn)品原液,逐級(jí)稀釋成所需樣品濃度,并采用微孔濾膜(0.22 μm)過濾備用。

緩沖液制備:準(zhǔn)確稱取適量乙酸銨,將其溶于超純水,加三乙胺/乙酸調(diào)節(jié)緩沖液pH值。

流動(dòng)相前處理:流動(dòng)相均采用微孔濾膜(0.22 μm)過濾,并進(jìn)行超聲脫氣處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 傅里葉紅外光譜表征

使用Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀分別對(duì)β-環(huán)糊精、間羧基苯磺酰氯和β-環(huán)糊精摻雜間羧基苯磺酰氯金屬有機(jī)骨架材料(β-CD-MOF-P20)進(jìn)行表征,如圖1A所示。β-CD-MOF-P20譜圖中的3 417 cm-1處的吸收峰為β-CD結(jié)構(gòu)中-OH的伸縮振動(dòng)吸收,相對(duì)于β-CD上-OH的伸縮振動(dòng)吸收而言,其吸收強(qiáng)度降低,可能是由鉀離子與電離的-OH進(jìn)行配位而導(dǎo)致的;2 923 cm-1處的吸收峰為β-CD結(jié)構(gòu)中-CH的伸縮振動(dòng)吸收;1 654 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于間羧基苯磺酰氯中C═O的伸縮振動(dòng)吸收;1 600 cm-1附近的吸收帶是由芳環(huán)上C═C的伸縮振動(dòng)引起的,β-CD-MOF-P20的譜圖同時(shí)包含有β-環(huán)糊精和間羧基苯磺酰氯的特征吸收峰,部分吸收峰發(fā)生偏移,初步說明β-CD-MOF-P20的成功合成。

(a)傅里葉紅外光譜圖;(B)紫外-可見吸收光譜圖;(C)X-射線粉末衍射譜圖;(a)β-環(huán)糊精;(b)間羧基苯磺酰氯;(c)β-CD-MOF-P20。

2.1.2 紫外可見吸收光譜表征

采用Agilent Cary 5000紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)分別測(cè)定了2.1.1中三種材料的固體紫外可見吸收光譜,結(jié)果如圖1B所示。間羧基苯磺酰氯在218和284 nm處有吸收峰,分別對(duì)應(yīng)苯環(huán)的K吸收帶和E吸收帶;β-CD-MOF-P20的光譜圖顯示,在233和274 nm出現(xiàn)兩處吸收峰,應(yīng)是由間羧基苯磺酰氯引入導(dǎo)致的,間羧基苯磺酰氯中苯環(huán)的K和E吸收帶引起了吸收峰吸收強(qiáng)度的變化且發(fā)生了位移,說明β-環(huán)糊精和間羧基苯磺酰氯共同參與了β-CD-MOF-P20材料的合成。

2.1.3 X-射線粉末衍射表征

采用HITACHI SU8010 X-射線衍射儀分別對(duì)上述三種材料進(jìn)行表征,如圖1C所示。從圖中信息可以看出,β-CD-MOF-P20在6.7°,9.6°,11.0°,12.9°,13.5°,18.3°處有明顯衍射峰,β-環(huán)糊精中包含相近的衍射峰,β-CD-MOF-P20的X-射線衍射譜圖與β-環(huán)糊精、間羧基苯磺酰氯有不同之處,衍射峰大于20°后其未見明顯吸收峰,說明β-CD-MOF-P20形成了新的晶型,進(jìn)一步說明β-CD-MOF-P20的成功合成。

2.1.4 掃描電子顯微鏡表征

采用Bruker D8場發(fā)射電鏡分別對(duì)二氧化硅微球、β-CD-MOF-P20和β-CD-MOF-P20@SiO2進(jìn)行表征,如圖2所示,其中圖2a為二氧化硅微球裸珠,表面光滑;圖2b為β-CD-MOF-P20@SiO2,與二氧化硅微球裸珠相比,表面粗糙,表面顆粒粒徑變大且生長均勻,說明β-CD-MOF-P20是成功生長在二氧化硅微球表面的MOF材料。

(a)SiO2裸珠;(b)β-CD-MOF-P20@SiO2。

2.2 分離噁唑禾草靈對(duì)映體的色譜條件探究

選擇色譜條件:柱溫箱溫度T=25 ℃;檢測(cè)波長λ=254 nm;進(jìn)樣體積V=20 μL。

2.2.1 流動(dòng)相配比的影響

以乙酸銨-乙酸(c=20 mmol/L,pH值4.40)和乙腈作為流動(dòng)相,通過改變流動(dòng)相配比,探究流動(dòng)相配比對(duì)FE對(duì)映體分離的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(a)所示。隨著乙腈占比的下降,R-FE峰型逐漸尖銳,峰高升高,保留時(shí)間變化不大;而S-FE峰型逐漸展寬,峰高降低,保留時(shí)間增加;分離度逐漸升高,即緩沖液占比的上升有利于FE對(duì)映體的分離。手性色譜柱選擇性地保留S-FE,說明緩沖液有利于FE進(jìn)入β-CD衍生物空腔,形成包埋復(fù)合物,而β-CD衍生物與S-FE形成的包埋復(fù)合物更加穩(wěn)定,進(jìn)而影響S-FE的洗脫。

(a)流動(dòng)相不同比例;(b)乙酸銨-乙酸不同pH值;(c)乙酸-三乙胺不同pH值;(d)緩沖液不同濃度;(e)流動(dòng)相不同流速;(f)重現(xiàn)性試驗(yàn);(g)對(duì)照實(shí)驗(yàn);(h)線性相關(guān)性。

2.2.2 緩沖液pH值的影響

綜合考慮,選定緩沖液和乙腈的體積比為53∶47作為流動(dòng)相配比,其他色譜條件不變,通過改變緩沖液pH值,探究緩沖液pH值對(duì)FE對(duì)映體分離的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(b)、(c)所示。緩沖液pH值范圍從酸性到堿性,分析物的保留時(shí)間、峰型和分離度均沒有明顯變化,說明在該緩沖液中,R,S-FE對(duì)映體分離在較寬的pH值范圍均能被拆分,pH值影響不大,可能是在此環(huán)境下FE的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,改變緩沖液pH值并未使其有大的變化。

2.2.3 緩沖液濃度的影響

選定緩沖液pH值為7.40,其他色譜條件不變,通過改變緩沖液濃度,探究緩沖液濃度對(duì)FE對(duì)映體分離的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(d)所示。隨著緩沖液濃度的升高,除了S-FE的保留時(shí)間呈下降趨勢(shì)外,其他前后峰的參數(shù)均未出現(xiàn)明顯的變化,結(jié)果導(dǎo)致分離度呈下降趨勢(shì),當(dāng)緩沖液濃度為20 mmol/L時(shí),分離度最佳,RS達(dá)9.09。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,緩沖液濃度在一定程度上影響了S-FE與β-CD衍生物之間形成的非對(duì)映體復(fù)合物的穩(wěn)定性。

2.2.4 流動(dòng)相流速的影響

選定緩沖液濃度為20 mmol/L,其他色譜條件不變,通過改變流動(dòng)相流速,探究其對(duì)FE對(duì)映體分離的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(e)所示。隨著流動(dòng)相流速的升高,前后峰的保留時(shí)間和峰面積逐漸減小,峰型逐漸尖銳,分離度先升后降,當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí),分離度最佳,RS達(dá)9.09。

2.2.5 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

在流動(dòng)相乙酸銨-三乙胺(20 mmol/L,pH值7.40)和乙腈配比為53∶47(體積比),溫度25 ℃,檢測(cè)波長254 nm,流速為0.5 mL/min的色譜條件下,分別測(cè)定了溶劑甲醇、R-FE和FE消旋體樣品,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(g)所示。通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)說明,溶劑甲醇對(duì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾不大,前峰對(duì)應(yīng)的對(duì)映體為R-FE,則后峰對(duì)應(yīng)的對(duì)映體為S-FE。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

以2.2.5同樣的色譜條件下,依次進(jìn)樣7次,通過確定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來評(píng)估該體系的重現(xiàn)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(f)所示。R-FE的保留時(shí)間、峰高、峰面積的RSD值分別為0.09%,0.77%和0.68%,S-FE的保留時(shí)間、峰高、峰面積的RSD值分別0.59%,1.32%,1.53%,分離度的RSD值為0.91%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該體系分離FE對(duì)映體具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.2.7 線性相關(guān)性

以2.2.5同樣的色譜條件下,在FE消旋體標(biāo)準(zhǔn)品濃度在6.20×10-6～2.99×10-4mol/L范圍內(nèi)分別分離了8個(gè)不同濃度的試樣,依次進(jìn)樣,將FE兩個(gè)對(duì)映體的峰高和峰面積分別與樣品濃度進(jìn)行線性擬合,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(h)所示。S-FE的峰高和峰面積與樣品濃度的線性方程分別為:y=1.255 9x-0.305 5(r=0.996 2)和y=0.481 7x+0.082 9(r=0.999 6),R-FE的峰高和峰面積與樣品濃度的線性方程分別為:y=11.563 9x+0.122 1(r=0.996 7)和y=4.670 2x-0.538 9(r=0.999 9)。結(jié)果表明,FE兩個(gè)對(duì)映體的峰高和峰面積與樣品濃度(6.20×10-6～2.99×10-4mol/L)線性相關(guān)性好(r=0.996 2～0.999 9),線性范圍寬。

3 結(jié)論

采用以β-CD衍生物為手性源的CD-MOF手性HPLC固定相,開發(fā)了一種分離R,S-FE對(duì)映體的反相色譜方法,通過優(yōu)化色譜條件,得到了流動(dòng)相乙酸銨-三乙胺(20 mmol/L,pH值7.40)和乙腈配比為53∶47(體積比),溫度25 ℃,檢測(cè)波長254 nm,流速0.5 mL/min的色譜條件下獲得了好的FE對(duì)映體分離,與已有報(bào)道的比,該材料對(duì)R,S-FE對(duì)映體的分離具有更大的分離度和更快速的優(yōu)勢(shì),該工作對(duì)更好地評(píng)估FE手性農(nóng)藥的環(huán)境和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有一定意義,也會(huì)促進(jìn)相關(guān)研究的發(fā)展。