不同高靜壓的壓力處理對豌豆7S、11S球蛋白形成凝膠的影響

王雪艷，李開鑫，李家豪，馬玲君，陳 芳，胡小松，季俊夫

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083）

凝膠化是豌豆球蛋白重要的功能特性之一，可以充分地應(yīng)用在改變食品質(zhì)地等方面。豌豆球蛋白根據(jù)沉降系數(shù)被劃分為7S球蛋白和11S球蛋白兩種，7S是分子質(zhì)量在170 kDa的三聚體，缺乏半胱氨酸殘基；11S是由6 個(gè)亞基對（由一個(gè)酸性亞基和一個(gè)堿性亞基組成）通過非共價(jià)作用組成的六聚體，分子質(zhì)量在320～380 kDa，11S含有比7S更多的含硫氨基酸[1]。由于7S和11S球蛋白在結(jié)構(gòu)上存在差異，導(dǎo)致二者具有不同的凝膠能力。已有研究表明，在熱誘導(dǎo)和酸誘導(dǎo)凝膠時(shí)，7S相比11S球蛋白表現(xiàn)出更強(qiáng)的凝膠性能[2]。如果將7S與11S球蛋白按照不同比例混合，可以有效地調(diào)控凝膠的機(jī)械性能，使其滿足在不同食品中的質(zhì)地要求。

前人已經(jīng)對熱誘導(dǎo)的豌豆球蛋白凝膠進(jìn)行了大量的研究，但由于加熱工藝會加速化學(xué)反應(yīng)，對營養(yǎng)成分的破壞限制了其在功能性食品中的應(yīng)用，通過冷誘導(dǎo)形成凝膠原則上不會加速化學(xué)反應(yīng)，而是在微觀和/或宏觀上誘導(dǎo)分子發(fā)生物理變化，因此研究豌豆球蛋白的冷誘導(dǎo)凝膠成為了一大熱點(diǎn)[3]。冷誘導(dǎo)中，高靜壓技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注，在高靜壓處理下，較大的分子鏈（如蛋白質(zhì)鏈）在降低到正常壓力后被延長。這種延長是由處理壓力的改變引起的，這表明較大分子鏈的3D結(jié)構(gòu)會被部分或全部破壞，從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[4]。因此高靜壓誘導(dǎo)處理可以更好地控制蛋白質(zhì)所形成凝膠的形狀、結(jié)構(gòu)和質(zhì)地，可以作為優(yōu)秀的凝膠誘導(dǎo)方式[5-6]。高靜壓誘導(dǎo)凝膠產(chǎn)生是根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和施加壓力的條件不同從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或聚集，其原理是通過高靜壓使蛋白質(zhì)變性解折疊，暴露內(nèi)部疏水殘基，蛋白質(zhì)之間相互作用、連接、形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在釋壓的過程中，蛋白質(zhì)聚集形成凝膠[7-8]。不同壓強(qiáng)引起的蛋白質(zhì)變性程度不同，因此會形成不同特性的凝膠。Matsumoto等[9]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)蛋白凝膠化至少需要300 MPa的壓力并作用10～30 min。Kajiyama等[10]的研究表明，豆?jié){在500 MPa條件下處理30 min后會從液體變?yōu)楣腆w；然而在較短的處理時(shí)間（10 min）或較低的壓力下，發(fā)現(xiàn)豆?jié){保持液態(tài)，但乳化活性和穩(wěn)定性得到改善。Olsen等[11]在減壓后和在24 ℃條件下儲存5 h后立即檢測β-乳球蛋白的聚集狀態(tài)和凝膠特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)施加150 MPa的壓力30 min，或施加高于300 MPa的壓力30 min，都能導(dǎo)致可溶性聚集體的形成。當(dāng)持續(xù)施壓30 min時(shí)，450 MPa的壓力引起β-乳球蛋白溶液的凝膠化。因此，高靜壓在誘導(dǎo)不同特性的豌豆球蛋白凝膠方面具有可行性和潛力。

本研究將豌豆7S和11S球蛋白以及二者按照不同比例（質(zhì)量比分別為1∶2、1∶1、2∶1）混合的蛋白進(jìn)行高靜壓作用，設(shè)置了100、300、500 MPa 3 個(gè)壓強(qiáng)水平分別作用10 min以形成凝膠。通過對其外觀和微觀結(jié)構(gòu)觀察、流變特性測量、質(zhì)構(gòu)分析以及持水力分析判定其是否形成凝膠和所形成凝膠的結(jié)構(gòu)和特性。通過將凝膠溶解在不同溶劑中確定維持凝膠的主要相互作用力。通過對比不同蛋白形成凝膠的特性分析7S和11S在高靜壓誘導(dǎo)形成凝膠方面的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆 山西東方亮生命科技有限公司；正己烷上海泰坦科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳液（Tris-Gly，Powder）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×，含巰基乙醇）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×，不含巰基乙醇）、BeyoGel? Plus PAGE預(yù)制膠（Tris-Gly，4%～20%，15 孔）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PageRuler預(yù)染蛋白Marker 賽默飛世爾科技有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SDS 北京索萊寶科技有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、5×G250染色液 美國西格瑪-奧德里奇公司；2.5%戊二醛 北京酷來搏科技有限公司；除單獨(dú)說明外，所有其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RCTdigital2.07磁力攪拌器 德國IKA公司；CF16RXII高速冷凍離心機(jī)、SU3500掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日立（中國）有限公司；LGJ-25C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)福瑞科儀公司；KN620自動凱氏定氮儀 濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS ZEN3700納米粒度和Zeta電位分析儀英國馬爾文公司；FS5熒光分光光度計(jì) 英國愛丁堡公司；CQC30L-600高靜壓設(shè)備 北京速原中天科技股份有限公司；DHR-2流變儀 美國TA公司；CT3物性分析儀 美國博勒飛公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆7S、11S球蛋白的提取

參考Diedericks等[12]的方法提取豌豆球蛋白。首先將豌豆磨粉獲得生豌豆粉并進(jìn)行脫脂，自然風(fēng)干后得到脫脂豌豆粉。

脫脂豌豆粉中加入0.5 mol/L NaCl溶液，料液比為1∶10（g/mL）。室溫?cái)嚢? h后10 000×g離心15 min，收集上清液A。按料液比為1∶5（g/mL）向沉淀中加入0.5 mol/L NaCl溶液，調(diào)節(jié)pH值到7.8左右后室溫?cái)嚢? h并離心（10 000×g、15 min），收集上清液B。合并上清液A、B，加入冰醋酸調(diào)pH 4.8，攪拌30 min后離心。沉淀（11S）研磨后加超純水溶解并調(diào)pH值到7.8后透析，上清液（7S與白蛋白）直接透析，透析條件為4 ℃、48 h。透析完成后11S樣品直接冷凍干燥。7S樣品離心得到沉淀，加水溶解后調(diào)至pH值為7.8再進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥后的蛋白研磨成粉末，得到7S、11S蛋白。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量（干基）的測定

蛋白質(zhì)含量（干基）通過凱氏定氮法測定。

1.3.3 水分含量的測定

水分含量通過烘箱干燥法進(jìn)行測定。稱量玻璃平皿的質(zhì)量為m1/g，加入一定量的樣品粉末，稱量總質(zhì)量為m2/g。105 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量后稱量總質(zhì)量（m3/g）。按式（1）計(jì)算水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)W：

1.3.4 SDS-PAGE

參考Mession等[2]的方法進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)。7S、11S蛋白質(zhì)粉末分別溶于蒸餾水中，分別與1×SDS上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）按照1∶1（V/V）混合，或與5×SDS上樣緩沖液（不含β-巰基乙醇）按照4∶1（V/V）混合，最終使混合液中的蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL。將預(yù)制膠安在架子上，放進(jìn)電泳槽，加入SDS-PAGE電泳液。向上樣孔中分別加入15 μL樣品和5 μL的Marker。初始設(shè)置電壓為70 V，當(dāng)樣品跑到電泳膠的1/5處，加壓到130 V，直至樣品跑到電泳膠底部結(jié)束加壓。將凝膠用考馬斯亮藍(lán)快速染色液染色，之后用體積分?jǐn)?shù)5%乙酸溶液和體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液進(jìn)行脫色，染色后的凝膠用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.5 蛋白質(zhì)溶解度的測定

蛋白質(zhì)溶解度通過測定可溶性固形物的方法進(jìn)行測定。取蛋白質(zhì)粉末樣品25 mg，溶于25 mL蒸餾水中，攪拌2 h使其溶解完全。離心取上清液用于烘干。稱量玻璃平皿的質(zhì)量為m4/mg，加入一定體積（V/mL）的蛋白上清液，105 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量后稱量總質(zhì)量（m5/mg）。按式（2）計(jì)算蛋白質(zhì)溶解度S：

1.3.6 粒徑、聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）和Zeta電位測定

將10 mg的7S或11S蛋白質(zhì)粉末溶于1 mL蒸餾水中，離心后將上清液稀釋50 倍體積，用于測定粒徑、PDI和Zeta電位。通過動態(tài)光散射測量可溶性蛋白聚集體的體積加權(quán)平均直徑。在25 ℃條件下進(jìn)行測定，并且根據(jù)水設(shè)定液體黏度和折射率，分別為0.933和1.333。

1.3.7 游離巰基含量測定

游離巰基含量測定參考Ellman方法[13]。將4 mg的5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶于1 mL的Tris甘氨酸緩沖液（pH 8.0）中配制Ellman’s試劑。取15 mg蛋白粉末溶解于含5 mL 8 mol/L UREA（尿素）的上述Tris甘氨酸緩沖液中，向其中加入Ellman’s試劑，于室溫條件下反應(yīng)60 min，以對應(yīng)的緩沖溶液作為空白對照，用分光光度計(jì)測定樣品在412 nm波長處的吸光度。樣品的游離巰基含量通過式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：SH為游離巰基含量/（μmol/g）；A412為412 nm波長處的吸光度；C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；73.53＝106/（1.36×104），其中1.36×104為摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））。

1.3.8 表面疏水性測定

蛋白的表面疏水性利用熒光探針和熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測定。激發(fā)波長固定在390 nm，發(fā)射光譜記錄在430～500 nm之間。熒光探針溶液（8 mmol/L）在磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L、pH 7.0）中制備，并在黑暗中保存。將30 μL 8 mmol/L的熒光探針溶液添加到6 mL的混合物中，在25 ℃避光靜置反應(yīng)5 min后測定熒光強(qiáng)度。在過量的熒光探針條件下，通過線性回歸分析評估蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度與濃度，線性回歸方程的斜率即為表面疏水性。

1.3.9 高靜水壓力預(yù)處理

取1.3.1節(jié)制備的7S、11S蛋白，以及二者以不同比例（質(zhì)量比1∶2、1∶1、2∶1）配比得到的混合蛋白，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%溶于蒸餾水中，使用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌后用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，再繼續(xù)攪拌3 h后置于4 ℃冰箱過夜，取出繼續(xù)攪拌4 h后，將蛋白溶液倒入真空包裝袋中，用手壓式封口機(jī)封口。之后將樣品分別以100、300 MPa和500 MPa高靜壓在25 ℃處理10 min。處理的樣品置于4 ℃冰箱中過夜，形成的凝膠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.10 流變特性測定

采用DHR-2流變儀，采用直徑為40 mm、夾角為2°的錐板，測量在1%的恒定應(yīng)變下進(jìn)行，屬于線性黏彈區(qū)域，間隙為150 μm，頻率掃描范圍為0.1～100 rad/s，每個(gè)數(shù)量級取5 個(gè)點(diǎn)。

1.3.11 質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）

用物性分析儀進(jìn)行TPA，TPA是在自立凝膠的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，300 MPa時(shí)蛋白形成了凝膠，但凝膠結(jié)構(gòu)較弱無法分析。使用TA5探頭進(jìn)行測定，凝膠樣品高度為4 mm、長寬為1 cm，測定參數(shù)如下：測試速率0.5 mm/s、壓縮程度50%、觸發(fā)值0.5 N。

1.3.12 持水力測定

參考Ayadi等[14]的方法，取5 mL離心管稱量其質(zhì)量，記為m0/g，裝入適量凝膠樣品，稱量樣品和離心管總質(zhì)量，記為m1/g，離心（10 000 r/min、20 min、4 ℃）后倒轉(zhuǎn)排水，稱量排水后的樣品和離心管的總質(zhì)量，記為m2/g。按式（4）計(jì)算凝膠持水力：

1.3.13 凝膠中的分子相互作用測定

參考Speroni等[15]的方法，將凝膠樣品以1∶5（m/m）的比例（確保樣品充分溶解）分散在pH 8.0的鹽水緩沖液（saline buffer，SB）（0.032 5 mol/L K2HPO4、0.002 6 mol/L KH2PO4和0.4 mol/L NaCl混合液）、SB+10 g/L SDS、SB+6 mol/L UREA和SB+40 mmol/L DTT溶液中，勻漿后反應(yīng)30 min，離心、取上清液。SB、SB+SDS、SB+UREA組用BCA法測上清液中蛋白濃度，SB+DTT組用考馬斯亮藍(lán)法測上清液中蛋白濃度，用凱氏定氮法確定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即得到蛋白溶解度，以溶解度判斷凝膠中的主要作用力。

1.3.14 SEM觀察

參考Wan Yangling等[16]的方法，將樣品浸在4 ℃、2.5%戊二醛溶液中24 h，然后用去離子水洗3 次。之后用梯度乙醇溶液對凝膠脫水，并進(jìn)行干燥。干燥后的樣品粘在導(dǎo)電膠上噴金，然后通過場發(fā)射SEM使用15 kV的加速電壓對樣品進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆7S、11S球蛋白的成分分析及表征

通過測定蛋白質(zhì)、水分含量以及SDS-PAGE對提取的7S和11S蛋白進(jìn)行成分分析。如表1所示，7S和11S樣品中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為86.34%和93.12%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.67%和3.34%。7S的粒徑為（114.69±0.28）nm、Zeta 電位為（-18.80±0.10）mV，而11 S 粒徑高于7 S，為（121.14±1.58）nm，Zeta 電位為（-25.30±0.40）mV，由于在提取兩種豌豆球蛋白的過程中存在步驟上的差異，導(dǎo)致7S與11S樣品溶于蒸餾水后的pH值、離子強(qiáng)度不同，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面帶電基團(tuán)也有所不同[17]。此外，結(jié)果表明11S的游離巰基是7S的2 倍，這是因?yàn)?1S含有更多的半胱氨酸，提供了更多的游離巰基。vicilin是不含半胱氨酸的7S球蛋白，而convicilin含有一個(gè)半胱氨酸。因此7S球蛋白的游離巰基由convicilin提供。表面疏水性方面，7S球蛋白略高于11S球蛋白，這是由于7S和11S在氨基酸組成、疏水性殘基的暴露程度方面存在一定差異，7S球蛋白有更多的疏水基團(tuán)暴露在表面，這為蛋白形成凝膠提供了一定的優(yōu)勢。

表1 豌豆7S、11S球蛋白的蛋白質(zhì)、水分含量與理化性質(zhì)表征Table 1 Protein and moisture contents and physicochemical characteristics of pea 7S and 11S globulins

通過SDS-PAGE確定所提取蛋白樣品中的7S和11S的種類及純度。如圖1所示，泳道1和2分別為7S、11S的變性非還原態(tài)譜帶（不含β-巰基乙醇），泳道3和4分別是7S、11S的變性還原態(tài)譜帶（含β-巰基乙醇）。分子質(zhì)量54 kDa附近的條帶為11S球蛋白的亞基Lαβ，該條帶只存在于泳道2中，這是因?yàn)樵谧冃苑沁€原電泳中，SDS破壞了亞基之間的疏水鍵，因此泳道中含有亞基的條帶。11S的亞基由一條酸性α鏈和一條堿性β鏈通過二硫鍵連接而成，在泳道4中，由于上樣緩沖液中的β-巰基乙醇破壞了亞基中的二硫鍵，因此亞基解離成了Lα（37 kDa附近）和Lβ（17 kDa附近）兩條多肽鏈，這與前人研究結(jié)果[18]相似。在泳道1和3中幾乎沒有Lαβ、Lα和Lβ的條帶，可以說明7S樣品幾乎不含11S球蛋白。在泳道1中還含有分子質(zhì)量在50 kDa和35 kDa的條帶，它們分別為未裂解的vicilin亞基（Vi1）和裂解后的vicilin亞基（Vi2）[2]。由于vicilin中不含二硫鍵，因此在含有β-巰基乙醇的環(huán)境下沒有被還原成多條鏈的狀態(tài)，泳道3與泳道1中的條帶分布一致。除此之外，還觀察到在泳道2和4中含有少量Vi1和Vi2條帶，說明11S樣品含有少量vicilin雜質(zhì)。

圖1 7S、11S球蛋白的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of 7S and 11S globulins

2.2 不同高靜壓誘導(dǎo)7S、11S蛋白形成凝膠的形態(tài)觀察

觀察高靜壓后的樣品形態(tài)，根據(jù)樣品能否形成固體或半固體初步判斷蛋白是否形成凝膠。如圖2所示，在100 MPa壓力誘導(dǎo)下5 組樣品均未形成凝膠，因此樣品呈現(xiàn)圓形水滴狀，但7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為2∶1）已經(jīng)具有形成半固體凝膠的趨勢。300 MPa的條件下，所有樣品中只有11S蛋白沒有形成固體或半固體。500 MPa條件下，5 組蛋白均體現(xiàn)出了固體的狀態(tài)。結(jié)果說明隨著壓強(qiáng)的升高，蛋白逐漸從溶液轉(zhuǎn)變成了凝膠。這是因?yàn)楦哽o壓可以使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)展開并暴露內(nèi)部結(jié)構(gòu)，暴露的基團(tuán)越多，越有利于三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。7S和11S之間存在結(jié)構(gòu)上的差異性，因此在形成凝膠的能力上存在不同。由于7S球蛋白中不含有半胱氨酸，沒有分子間的二硫鍵產(chǎn)生，凝膠的形成主要靠氫鍵維持，因此7S球蛋白形成的凝膠柔性更高，其凝膠化性能更好[19]。當(dāng)7S與11S混合后，它們的凝膠性能基本上都比單獨(dú)的7S和11S好，或接近于單獨(dú)7S的凝膠性能。這可能是因?yàn)?S和11S在形成凝膠時(shí)發(fā)揮的作用不同，7S作為凝膠網(wǎng)絡(luò)的骨架，而11S因其較低的表面疏水性更容易與水發(fā)生結(jié)合，所以可以留在網(wǎng)絡(luò)間隙中攔截水。

圖2 不同壓力的高靜壓誘導(dǎo)7S、11S蛋白形成凝膠或非凝膠的形態(tài)Fig.2 Gel or non-gel forms of 7S and 11S induced by different high hydrostatic pressures

2.3 高靜壓誘導(dǎo)7S、11S凝膠的流變性質(zhì)

通過流變分析評估蛋白是否形成凝膠以及凝膠強(qiáng)度等特性。不同高靜壓條件下的蛋白質(zhì)樣品在線性黏彈范圍內(nèi)的頻率掃描如圖3所示。圖3A為100 MPa條件下的樣品，在此壓強(qiáng)下，除了7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為2∶1），其他各組基本都表現(xiàn)為初始時(shí)彈性模量G’值低于黏性模量G”值，后段變?yōu)镚’值高于G”值，因此樣品表現(xiàn)為溶液。圖3B顯示，在300 MPa的高靜壓下，所有的蛋白樣品在全頻率范圍內(nèi)都始終滿足G’值高于G”值，說明樣品表現(xiàn)為凝膠。當(dāng)壓強(qiáng)升高到500 MPa時(shí)，由圖3C可以看出，所有樣品仍舊表現(xiàn)為凝膠狀態(tài)，并且G’和G”相對于100、300 MPa條件都有不同程度的升高?？偟貋碚f，隨著壓強(qiáng)的升高，樣品逐漸從溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，并且G’和G”逐漸升高。7S/11S混合后形成的凝膠模量高于二者單獨(dú)形成的凝膠，可能是由于在施壓過程中，蛋白質(zhì)單體的構(gòu)象發(fā)生變化，并在壓力釋放過程中蛋白亞基發(fā)生重排，形成新的聚合，在王苑等[20]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。此外，11S凝膠的G’和G”增大的范圍不如其他4 組樣品，這說明11S蛋白在高靜壓條件下可暴露的基團(tuán)已經(jīng)過早達(dá)到了最高值，并且由于11S球蛋白不易展開的特性，能夠暴露并發(fā)生相互作用的基團(tuán)數(shù)目也受到限制。

圖3 不同壓力的高靜壓誘導(dǎo)的7S、11S凝膠的G’和G”隨角頻率的變化Fig.3 Changes in G’ and G”of 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures as a function of angular frequency

使用1 rad/s時(shí)的tanδ和G’值進(jìn)行樣品之間的直接比較（圖4）。tanδ為G”與G’的比值，tanδ越小說明凝膠結(jié)構(gòu)越強(qiáng)。100 MPa條件下的所有蛋白樣品的tanδ1rad/s都在0.5～1.1之間時(shí)，表明為弱相關(guān)的濃縮分散體。300 MPa和500 MPa條件下的所有樣品tanδ1rad/s都在0.2～0.4之間，表明為較強(qiáng)的凝膠狀結(jié)構(gòu)。G’1rad/s可以直接作為凝膠強(qiáng)度的指示值[21]。與頻率掃描的流變分析結(jié)果一致，隨著壓強(qiáng)的升高，所有蛋白樣品的G’1rad/s都逐漸升高，11S蛋白樣品在任何高壓下的G’1rad/s都低于其他4 組，混合蛋白樣品的G’1rad/s幾乎與7S蛋白樣品相近或略高。

圖4 不同高靜壓誘導(dǎo)的7S、11S凝膠的tan δ1rad/s（A）與G’1rad/s（B）Fig.4 tan δ1rad/s (A) and G’1rad/s (B) in 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures

2.4 高靜壓誘導(dǎo)7S、11S凝膠的質(zhì)構(gòu)特性

TPA是在自立凝膠的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，在300 MPa的壓強(qiáng)下，雖然蛋白形成了凝膠，但凝膠結(jié)構(gòu)較弱，無法分析。500 MPa的壓強(qiáng)下凝膠的TPA結(jié)果如表2所示。硬度指凝膠抵抗變形的能力，即斷裂所需的最大力[22]。結(jié)果顯示，5 組樣品的硬度之間均具有顯著性差異。硬度最大的為7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為2∶1），剩余樣品由大到小排列依次為7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為1∶1）、7S蛋白、7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為1∶2）和11S蛋白，11S蛋白凝膠的硬度低至0.06 N。硬度的結(jié)果與流變特性的模量之間具有完全一致的對應(yīng)關(guān)系。

表2 500 MPa高靜壓誘導(dǎo)7S、11S凝膠的質(zhì)構(gòu)分析Table 2 Textural analysis of 7S and 11S gels induced by high hydrostatic pressure at 500 MPa

彈性為第一次壓縮后恢復(fù)的高度，代表了凝膠在被壓縮后恢復(fù)原來狀態(tài)的能力[23]。從彈性數(shù)據(jù)結(jié)果來看，11S蛋白凝膠的彈性（-0.08 mm）最差，與其他4 組凝膠之間存在顯著性差異。彈性值最大的樣品為7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為2∶1），可能因?yàn)?1S蛋白對于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的填充作用，使得凝膠彈性增強(qiáng)。

內(nèi)聚性為兩次循環(huán)壓縮所做的正功之比，代表了凝膠在外力下保持內(nèi)部結(jié)構(gòu)的能力[24]。內(nèi)聚性結(jié)果與彈性結(jié)果基本一致，即11S凝膠顯著低于其他4 組，且為負(fù)值。3 組混合蛋白凝膠樣品中，隨著7S蛋白含量的提高，其內(nèi)聚性逐漸提高。影響彈性和內(nèi)聚性的因素主要是凝膠分子之間的交聯(lián)程度。由此說明，7S凝膠比11S凝膠的交聯(lián)程度更強(qiáng)。而二者經(jīng)過混合后的蛋白凝膠比單獨(dú)的任何一種蛋白形成的凝膠的交聯(lián)程度都強(qiáng)，說明7S與11S之間的相互結(jié)合會更加有利于形成強(qiáng)的凝膠。

咀嚼性是硬度、彈性和內(nèi)聚性3 種指標(biāo)的乘積，可以代表凝膠質(zhì)構(gòu)特性的整體變化趨勢。結(jié)果表明，11S蛋白凝膠的咀嚼性顯著低于其他4 組蛋白，7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為2∶1）凝膠的咀嚼性高于其他4 組蛋白。通過TPA可以得到各方面特性都比較弱的凝膠為11S蛋白凝膠，都比較強(qiáng)的為7S-11S混合蛋白（質(zhì)量比為2∶1）凝膠，TPA的大小趨勢與流變特性趨勢完全一致。

2.5 高靜壓誘導(dǎo)7S、11S凝膠的持水力

由于蛋白質(zhì)的分子間交聯(lián)和聚集形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)可以攔截水，凝膠的持水力是凝膠保留水分能力的指標(biāo)[25-27]。持水力受多種因素的影響，包括凝膠孔的大小和蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，這些因素參與凝膠的形成[28]。具有高持水力的凝膠是保持食品質(zhì)地的理想選擇。圖5為各個(gè)條件下形成凝膠的持水力。結(jié)果顯示，隨著壓強(qiáng)的升高，所有的蛋白質(zhì)凝膠的持水力均顯著提高。這是因?yàn)閴簭?qiáng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)展開，促進(jìn)了水結(jié)合能力。高靜壓處理產(chǎn)生的未折疊構(gòu)象能在柔性網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)基團(tuán)之間形成連接以捕獲水分子。代曉凝等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性程度增加、活性基團(tuán)暴露于分子表面時(shí)，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，使凝膠和水分子結(jié)合的能力越強(qiáng)，就可以保持更多的水分子不易流失。此外也可能因?yàn)榻庹郫B后產(chǎn)生的新的親水殘基與水發(fā)生了結(jié)合。300 MPa條件下，持水力基本上隨著11S蛋白的占比增大而升高。500 MPa條件下的11S蛋白凝膠的持水力最高，達(dá)到100%，與其他4 種蛋白之間具有顯著性差異。同時(shí)與7S相比，11S可能需要更高的壓力才能達(dá)到完全變性[30]，因此在相同壓力下（500 MPa），11S很難形成較好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這也導(dǎo)致了11S凝膠的流變特性模量以及質(zhì)構(gòu)特性都為最低。

圖5 不同高靜壓誘導(dǎo)的7S、11S凝膠的持水力Fig.5 Water-holding capacity of 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures

2.6 高靜壓誘導(dǎo)7S、11S形成凝膠的作用力

對500 MPa形成的凝膠用不同的溶劑進(jìn)行溶解，可以判斷維持凝膠三維結(jié)構(gòu)的主要作用力（圖6）。SB主要用來提取未結(jié)合或通過靜電結(jié)合的蛋白質(zhì)。所有的凝膠在SB中都表現(xiàn)出非常低的溶解度（小于30%），這表明大多數(shù)蛋白質(zhì)參與了三維網(wǎng)絡(luò)的形成。在SB中，7S蛋白凝膠的溶解度最高，11S蛋白的溶解度最低，混合蛋白凝膠中，隨著7S蛋白比例的升高，在其中的溶解度越高。

圖6 維持高靜壓（500 MPa）誘導(dǎo)的7S、11S球蛋白凝膠的不同作用力Fig.6 Different forces maintaining high hydrostatic pressure(500 MPa) induced 7S and 11S globulin gels

SDS用于破壞疏水相互作用，因此SDS緩沖液可以用來破壞凝膠中的靜電相互作用和疏水相互作用。在該溶液中，所有蛋白凝膠的溶解度都有很大程度的提高。有65%左右的7S蛋白凝膠可以溶于其中，11S蛋白凝膠的溶解度也比SB中的溶解度升高很多，而混合蛋白凝膠的溶解度依舊介于11S和7S蛋白凝膠之間，各種蛋白凝膠之間存在顯著性差異。該結(jié)果表明，疏水相互作用也是維持凝膠結(jié)構(gòu)的相互作用力，并且發(fā)揮很重要的作用。

UREA改變水的結(jié)構(gòu)，允許疏水斑塊的水合作用，并且還直接與多肽的極性基團(tuán)相互作用，因此UREA緩沖液主要通過破壞疏水相互作用和氫鍵溶解蛋白質(zhì)[31]。凝膠在UREA緩沖液中的溶解度也有了很大提升，說明氫鍵也是維持凝膠結(jié)構(gòu)重要的相互作用力。凝膠在SB和SDS緩沖液之間以及在SB和UREA緩沖液之間的差異表明，這些樣品中的主要相互作用力是氫鍵[32]。Li Zhiyu等[31]提出生物聚合物之間的疏水相互作用、氫鍵以及二硫鍵是三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的原因，而大分子以及水分子之間的氫鍵和靜電相互作用在凝膠化過程中對基體中自由水的截留起著關(guān)鍵作用。因此可以推斷凝膠在500 MPa條件下的持水力高主要是氫鍵與靜電相互作用發(fā)揮著作用。

綜合凝膠在SB、SDS和UREA中溶解度的結(jié)果，可以說明維持凝膠的作用力主要是非共價(jià)鍵。然而之前的研究也曾多次報(bào)道，凝膠的主要結(jié)構(gòu)是通過疏水相互作用和二硫鍵穩(wěn)定的[33-34]。因此通過探究凝膠在DTT中的溶解度判斷二硫鍵存在的情況。結(jié)果顯示，相比于SB中的溶解度，DTT中的溶解度僅有略微的上升，說明在凝膠中蛋白質(zhì)之間存在二硫鍵。之前的一些研究曾報(bào)道過，由于巰基的反應(yīng)性增加，二硫鍵在高靜壓誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集中起重要作用[35]。因此雖然二硫鍵的數(shù)目不多，但由于二硫鍵作為共價(jià)相互作用力，具有更高的鍵能，因此在維持凝膠結(jié)構(gòu)方面也提供了很大的幫助。

2.7 高靜壓誘導(dǎo)7S、11S形成凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

蛋白凝膠在不同壓強(qiáng)下形成的溶液或凝膠的SEM圖像如圖7所示。蛋白聚集體參與了凝膠的網(wǎng)絡(luò)形成。在100 MPa條件下，所有的蛋白聚集體都呈現(xiàn)連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但孔徑較大，聚集體較小，且主要表現(xiàn)為絲狀聚集體。說明在該壓強(qiáng)下，蛋白有形成凝膠的趨勢，但由于聚集體之間的連接不夠緊密，結(jié)構(gòu)較為松散，無法在孔隙中攔截水分子，于是便呈現(xiàn)為溶液的狀態(tài)。

圖7 不同高靜壓誘導(dǎo)的7S、11S凝膠的SEM圖像Fig.7 SEM images of 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures

當(dāng)壓強(qiáng)升高到300 MPa時(shí)，蛋白開始逐漸形成球狀聚集體，孔隙也逐漸變小，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加致密。7S凝膠雖然形成了大量的聚集體，但具有較大的孔洞，因此凝膠的結(jié)構(gòu)相對松散，持水力較差。11S蛋白凝膠中含有大量的孔洞，這不利于水分的保持，但聚集體連接緊密，因此相比于7S凝膠具有較好的持水力。

500 MPa時(shí)，所有的蛋白均體現(xiàn)為球狀聚集體，孔徑降為最小，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊湊且致密。這種致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以有效地將水保持在體系中，因此能夠產(chǎn)生具有理想機(jī)械性能的凝膠[36]。11S蛋白凝膠雖然沒有形成較大直徑的聚集體，但孔徑最小，因此有利于與水分子通過氫鍵或靜電相互作用進(jìn)行緊密的結(jié)合，具有最強(qiáng)的持水力。相對于7S蛋白，混合蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)更加均勻有序，聚集體大小也保持一致，因此機(jī)械性能要比7S蛋白凝膠更加優(yōu)秀。

3 結(jié)論

隨著壓力從100 MPa升高到500 MPa，豌豆球蛋白逐漸由溶液轉(zhuǎn)變?yōu)榉亲粤⒛z，再轉(zhuǎn)變?yōu)樽粤⒛z。蛋白凝膠的G’逐漸升高，質(zhì)地變強(qiáng)，持水力提高。蛋白結(jié)構(gòu)逐漸由絲狀聚集體轉(zhuǎn)變?yōu)榍驙罹奂w，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸致密均勻，孔隙逐漸變小。維持高靜壓誘導(dǎo)豌豆球蛋白凝膠的作用力主要是氫鍵和疏水相互作用，其次為二硫鍵和靜電相互作用。當(dāng)7S-11S混合蛋白的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，經(jīng)過500 MPa壓力誘導(dǎo)形成的凝膠在流變特性、凝膠剛性、質(zhì)構(gòu)特性以及持水力等方面都有顯著的提高。因此，7S、11S蛋白按不同比例制備凝膠可以擴(kuò)大可調(diào)控的凝膠強(qiáng)度范圍。