林麝腸道中乳酸菌的分離篩選及益生特性

訾 靜，王 琰，李亮亮，張 琨，萬 一,*

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.陜西省科學(xué)院，秦嶺天然產(chǎn)物工程中心，陜西 西安 710043；3.西安理工大學(xué)理學(xué)院，陜西 西安 710054）

林麝是珍貴的野生藥用資源動(dòng)物，已被列為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[1]。隨著人類對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞及對(duì)林麝的過度捕殺，野麝資源瀕臨滅絕，人工養(yǎng)麝是保護(hù)野生麝資源的有效途徑，因此，做好圈養(yǎng)麝的疾病防治十分重要[2]。在林麝養(yǎng)殖群體中，高發(fā)病率和死亡率的化膿性疾病和腸炎性疾病一直是人工養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大的重要制約因素[3]。通過對(duì)患有化膿病林麝個(gè)體的膿液進(jìn)行病原菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體體內(nèi)膿液病原菌主要包括化膿隱秘桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌等，尤其是化膿隱秘桿菌陽性檢出率高達(dá)60%以上[4-5]。抗生素經(jīng)常被用來治療這類疾病。然而，抗生素的過度使用可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腸道微生物組產(chǎn)生耐藥性[6]。因此，本研究通過從健康的林麝腸道中分離乳酸菌用于開發(fā)益生菌制劑，以期預(yù)防疾病和改善林麝健康狀況。

乳酸菌可以顯著改善動(dòng)物胃腸道的微生物群落生態(tài)系統(tǒng)平衡，能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)（如有機(jī)酸、細(xì)菌素等）和抗菌活性而被廣泛用于食品工業(yè)，用于改善動(dòng)物和人類健康[7-8]。根據(jù)前人研究報(bào)道，從健康動(dòng)物腸道中分離出的乳酸菌能抑制多種致病菌的生長，包括產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、福氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等[9-10]。乳酸菌是否能作為益生菌，需要根據(jù)現(xiàn)有益生菌選擇標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)規(guī)程對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估，包括對(duì)胃腸道環(huán)境的酸耐受性和膽鹽耐受性；可黏附定植于腸道上皮；對(duì)常見病原菌具有一定的抑制能力；對(duì)抗生素的耐藥性以及不能攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥基因等[11]。

目前國內(nèi)外關(guān)于林麝腸道中乳酸菌分離及益生特性的報(bào)道較少，僅有四川農(nóng)業(yè)大學(xué)Luo Yan等[12]從健康林麝糞便中分離乳酸菌，進(jìn)行耐酸耐膽鹽、抗生素耐藥性及抑菌活性研究。針對(duì)林麝腸道中乳酸菌的菌體表面特性、抗藥性基因型分析以及生長特性的研究鮮見報(bào)道。本研究從健康林麝糞便中分離鑒定乳酸菌，以商品化副干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）L22為陽性對(duì)照，測(cè)試分離株的耐酸和耐膽鹽、抗菌活性、自聚集和疏水性、抗生素敏感性，進(jìn)一步對(duì)篩選的分離株進(jìn)行抗性基因分析和生長曲線測(cè)定。另外，本研究檢測(cè)了分離株對(duì)一株化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）LSN3（從林麝腸道化膿樣本中分離，GenBank登錄號(hào)OQ179914）的拮抗活性，以期篩選出具有良好抗菌活性的菌株，為開發(fā)適合林麝專用的益生菌制劑提供理論基礎(chǔ)和可靠的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的新鮮健康林麝糞便均在陜西鳳縣林麝繁育中心采集。共收集55 頭不同年齡的林麝糞便樣品，麝齡為0.5～10.5 歲。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus saureus）ATCC 25923、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）ATCC 13076均購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；化膿隱秘桿菌（A.pyogenes）LSN3、商品化副干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）L22由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

改良MRS培養(yǎng)基：在MRS肉湯培養(yǎng)基礎(chǔ)上，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%半胱氨酸鹽酸鹽和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4% LiCl。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；牛膽鹽 上海麥克林生化科技有限公司；抗生素藥敏試紙杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1510型分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技有限公司；1580R高速冷凍離心機(jī) 基因科技（上海）有限公司；LDZM-80KCS-II型全自動(dòng)滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；GHP-9080型隔水式培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T100型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)、純化及分離

取健康林麝的新鮮糞便5 g接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將富集菌液用無菌生理鹽水稀釋，分別吸取100 μL稀釋梯度為10-4、10-5和10-6的稀釋液涂布于改良MRS固體平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h至長出單菌落，挑選具有乳酸菌形態(tài)的單菌落，連續(xù)轉(zhuǎn)接于改良MRS固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)3 次后，挑取純的單菌落于MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶反應(yīng)測(cè)定。將純化后的菌株加入體積分?jǐn)?shù)30%的滅菌甘油中，于-80 ℃保藏備用。

1.3.2 16S rDNA基因擴(kuò)增及序列分析

取甘油菌20 μL 接種至9 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中充分活化，取1 mL 菌液6 000×g離心5 min，收集菌體，根據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒方法提取菌體DNA。以提取的DNA 為模板，利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA序列，選用16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqMaster Mix (Dye Plus)25 μL、上下游引物各1.5 μL、DNA模板（20 ng/μL）2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并下載相似性最高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列對(duì)比，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹（No.of Bootstrap Replications＝1 000），初步確定菌株分類地位。

1.3.3 菌株耐酸和耐膽鹽能力測(cè)定

耐酸和耐膽鹽測(cè)定參照Manzoor等[13]方法。將活化后的菌液（108CFU/mL）按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，6 000×g離心5 min，收集菌體，用滅菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L、pH 7.2）將菌體洗滌2 次后重懸于PBS中。取1 mL菌懸液分別接種至9 mL的MRS培養(yǎng)基（用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別為2、3和4；或者加入牛膽鹽分別至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%和1.0%），37 ℃培養(yǎng)4 h，分別在0 h和4 h用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，存活率計(jì)算公式如下：

式中：N0和Nt分別代表菌株處理前（0 h）和處理后（4 h）的菌落數(shù)。

1.3.4 菌株上清液抑菌能力測(cè)定

菌株上清液對(duì)致病菌的抑制作用采用牛津杯法[14]。取甘油菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16 h，10 000×g離心10 min，上清液經(jīng)濾膜（0.22 μm）過濾收集。病原菌選取大腸埃希氏桿菌（E.coli）ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（S.saureus）ATCC 25923、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）PAO1、腸炎沙門氏菌（S.enterica）ATCC 13076和化膿隱秘桿菌（A.pyogenes）LSN3，在平板底部?jī)A倒薄層水瓊脂，將致病菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16 h，取0.1 mL的菌液（108CFU/mL）涂布于LB固體培養(yǎng)基表面。在平板中均勻地放置滅菌的牛津杯，吸取0.1 mL待測(cè)菌上清液于牛津杯中，室溫靜置3～5 h，然后37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小。

1.3.5 菌株自聚集能力測(cè)定

菌株自聚集能力的測(cè)定參考Polak-Berecka等[15]方法。將活化后的菌液（108CFU/mL）接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，6 000×g離心10 min，沉淀用無菌PBS（pH 7.2）洗滌2 次后重懸于無菌PBS中，調(diào)整菌懸液的OD600在0.50±0.05范圍內(nèi)。吸取4 mL已調(diào)整OD600的菌懸液加入試管中，靜置于室溫下6 h測(cè)定該菌懸液的OD600。自聚集率計(jì)算公式如下：

式中：OD0為0 h的OD600值；OD1為靜置6 h的OD600值。

1.3.6 菌株表面疏水性測(cè)定

采用Crow等[16]描述的方法，以氯仿為有機(jī)溶劑測(cè)定菌株表面疏水性。將活化后的菌液（108CFU/mL）接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，6 000×g離心10 min，沉淀用無菌PBS（pH 7.2）洗滌2 次后重懸于無菌PBS中，調(diào)整菌懸液的OD600在0.50±0.05范圍內(nèi)。吸取3 mL已調(diào)整OD600的菌懸液與1 mL氯仿渦旋混合30 s，停頓10 s后振蕩30 s，并于室溫靜置30 min。取上層水相，以PBS為空白對(duì)照，在波長600 nm處測(cè)量OD值。表面疏水率計(jì)算公式如下：

式中：OD0為0 h的吸光度；OD1為靜置30 min后的OD600值。

1.3.7 菌株對(duì)抗生素耐藥性測(cè)定

分離株對(duì)抗生素的耐藥性檢測(cè)采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法[17]。取9 種抗生素包括哌拉西林（100 μg）、氨芐西林（10 μg）、頭孢曲松（30 μg）、鏈霉素（10 μg）、四環(huán)素（30 μg）、氯霉素（30 μg）、紅霉素（15 μg）、環(huán)丙沙星（5 μg）和萬古霉素（30 μg）。吸取0.1 mL菌懸液（108CFU/mL）涂布到MRS瓊脂培養(yǎng)基表面，待完全吸收后，將藥敏紙片貼放表面，于37 ℃培養(yǎng)24 h，然后測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑大小將每個(gè)分離株的耐藥性分為耐藥（R）、敏感（S）或中介（I），評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（2014年）進(jìn)行[18]。

1.3.8 乳酸菌抗藥性的基因型分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸菌常見抗生素抗性基因特異性引物，對(duì)篩選出的6 株乳酸菌的抗藥性基因：環(huán)丙沙星抗性基因gyrA、parC；萬古霉素抗性基因vanE、vanA、vanX；鏈霉素抗性基因ant6、aadA和aadE進(jìn)行PCR擴(kuò)增并分析，所使用的引物序列及退火溫度見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 抗藥性基因特異性引物及PCR條件Table 1 Specific primers and PCR conditions for amplification of antibiotic resistance genes

1.3.9 菌株生長曲線測(cè)定

將活化后的菌液（108CFU/mL）按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種于50 mL MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的OD600。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。同時(shí)測(cè)定24 h后的菌液pH值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。全部實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)和鑒定結(jié)果

從健康林麝糞便樣品中分離菌株，經(jīng)純化后在MRS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈白色且表面光滑。經(jīng)革蘭氏染色后，得到12 株革蘭氏陽性菌，所有菌株過氧化氫酶反應(yīng)均呈陰性。菌株經(jīng)過16S rDNA序列測(cè)序后，提交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，申請(qǐng)基因登錄號(hào)（表2）。使用MEGA 6.0軟件對(duì)菌株16S rDNA序列和模式株序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖1。結(jié)果表明，12 株菌經(jīng)序列比對(duì)可明確分為6 種，其中SX129、SX130、SX137、SX140和SX141與植物乳植桿菌（L.plantarum）親緣關(guān)系最近；SX115、SX61和SX142與屎腸球菌（Enterococcus faecium）親緣關(guān)系最近；SX45、SX100、SX78和SX131分別與耐久腸球菌（E.durans）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和短乳桿菌（L.brevis）的親緣關(guān)系最近，序列相似性均高于99%。

圖1 基于菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strains based on the 16S rDNA gene sequences

表2 篩選出的12 株乳酸菌屬16S rDNA序列相似性比對(duì)Table 2 Similarity analysis of bacterial 16S rDNA sequences of12 lactic acid bacterial isolates

2.2 菌株耐酸和耐膽鹽能力

12 株乳酸菌在不同pH值條件下的存活率結(jié)果見圖2A。隨著pH值的降低，菌株的存活率也隨之降低。所有菌株均能在pH 4條件下生長，5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌存活率達(dá)88.5%以上；在pH 3條件下，該6 株菌存活率達(dá)84%以上；在pH 2條件下，僅6 株菌存活率在33%～37%之間，其余均在30%以下。所有菌株在pH 4和pH 3（除SX100以外）條件下，存活率與對(duì)照菌相比無顯著性差異，在pH 2條件下，有2 株菌（SX61和SX78）存活率與對(duì)照菌相比有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 不同條件下乳酸菌株的存活率Fig.2 Survival rates of lactic acid bacterial strains under different conditions

12 株乳酸菌在不同膽鹽環(huán)境中的存活率結(jié)果見圖2B。所有菌株能耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%的膽鹽環(huán)境。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%膽鹽環(huán)境中，5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌存活率在87%以上。所有菌株中SX140存活率最高，達(dá)91.3%，SX61存活率最低為81.2%。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%膽鹽環(huán)境中，有6 株菌的存活率在80%以上，其中植物乳植桿菌存活率較高，在86.0%～89.5%之間，SX45存活率最低，為70%。所有菌株在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%膽鹽環(huán)境中，存活率與對(duì)照菌相比無顯著性差異（P＞0.05），在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%膽鹽環(huán)境中，4 株菌（SX78、SX100、SX142和SX45）存活率與對(duì)照菌相比有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 菌株上清液抑菌能力

12 株乳酸菌對(duì)常見病原菌的抑菌活性檢測(cè)結(jié)果見表3。5 株植物乳植桿菌和乳酸片球菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和腸炎沙門氏菌表現(xiàn)出較好的拮抗活性（抑菌圈直徑17.20～20.19 mm），對(duì)化膿隱秘桿菌LSN 3 的抑菌活性（抑菌圈直徑14.23～15.53 mm）優(yōu)于對(duì)照菌株L22（抑菌圈直徑10.05 mm）。其他6 株分離菌對(duì)銅綠假單胞菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑為12.88～14.98 mm，對(duì)腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和化膿隱秘桿菌的抑菌圈直徑為9.05～12.46 mm。

表3 12 株乳酸菌對(duì)病原指示菌抑菌活性測(cè)定Table 3 Inhibitory activities of 12 lactic acid bacterial isolates against pathogenic indicators

2.4 菌株自聚集能力和表面疏水性

12 株乳酸菌自聚集性以及對(duì)氯仿的表面疏水性檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。9 株分離株自聚集率在50.9%～56.8%之間，其中5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌自聚集率在53.1%～56.2%之間；其余3 株菌自聚集率在39.1%～48.9%之間。所有分離株自聚集能力與對(duì)照菌相比無顯著性差異（P＞0.05），表現(xiàn)出與對(duì)照菌相當(dāng)?shù)淖跃奂浴?2 株分離株中有7 株表面疏水率在52.4%～56.0%之間，其中植物乳植桿菌和乳酸片球菌表面疏水率在52.9%～ 56.0%之間。表面疏水率最高的是SX140（56.0%），最低的是SX100（25.9%），3 株菌（SX131、SX45和SX100）表面疏水性與對(duì)照菌相比差異顯著（P＜0.05）。

圖3 12 株乳酸菌的自聚集率和表面疏水率Fig.3 Auto-aggregation capacity and surface hydrophobicity of12 lactic acid bacterial strains

2.5 菌株對(duì)抗生素耐藥性

12 株乳酸菌對(duì)9 種常用抗生素的耐藥性檢測(cè)結(jié)果見表4。所有菌株對(duì)鏈霉素耐藥，11 株菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，9 株菌對(duì)萬古霉素耐藥。植物乳植桿菌和乳酸片球菌分別對(duì)6 種和5 種抗生素敏感或中度耐藥。有4 株菌對(duì)哌拉西林耐藥。耐久腸球菌對(duì)9 種抗生素耐藥，對(duì)頭孢曲松和紅霉素中度耐藥。

表4 12 株乳酸菌對(duì)不同抗生素的敏感性Table 4 Susceptibility of 12 lactic acid bacterial strains to different antibiotics

2.6 乳酸菌抗藥性的基因型分析

根據(jù)特異性引物利用PCR技術(shù)對(duì)篩選獲得的6 株乳酸菌的抗生素抗性基因進(jìn)行分析，雖然所有菌株表現(xiàn)為環(huán)丙沙星和鏈霉素抗性，但這些菌株都不攜帶這兩種抗生素的抗性基因。6 株乳酸菌中均檢測(cè)出對(duì)萬古霉素的抗藥性基因vanX，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。

圖4 PCR擴(kuò)增植物乳植桿菌和乳酸片球菌中萬古霉素的抗藥性基因vanXFig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified vanX gene from selected L.plantarum and P.acidilactici isolates

2.7 菌株生長曲線

根據(jù)益生特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)益生潛力最大的6 株菌的生長曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖5。5 株植物乳植桿菌生長情況相似，培養(yǎng)基OD600值皆于接種后4 h快速上升，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。接種后10 h進(jìn)入細(xì)菌生長穩(wěn)定期，24 h后的OD600達(dá)9.0～9.7。乳酸片球菌SX78在接種4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)至12 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，24 h后的OD600達(dá)7.1。

圖5 植物乳植桿菌和乳酸片球菌生長曲線Fig.5 Growth curves of the selected L.plantarum and P.acidilactici isolates

3 討論

本研究從林麝糞便樣品中篩選獲得12 株乳酸菌，通過細(xì)胞個(gè)體形態(tài)特征和16S rDNA序列分析鑒定，包括4 個(gè)屬、6 個(gè)種，其中植物乳植桿菌5 株，屎腸球菌3 株，乳酸片球菌、腸膜明串珠菌、耐久腸球菌和短乳桿菌各1 株，隨后對(duì)分離株進(jìn)行體外益生性能評(píng)價(jià)，包括耐受性、抗病原菌活性、抗生素敏感性和菌體表面特性（菌體自聚集能力和表面疏水性）。

潛在益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)之一是能適應(yīng)胃腸道中的苛刻環(huán)境（胃酸的低pH值以及小腸膽鹽形成的高滲透壓環(huán)境），這迫使益生菌必須具有耐酸和耐膽鹽能力才能在腸道中存活[25]。許多研究認(rèn)為pH 2～3是研究益生菌菌株耐酸性的最適pH值[26]。動(dòng)物膽汁濃度是不恒定和不可預(yù)測(cè)的，往往隨著飲食的改變而改變，一般選擇膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.3%～1.0%范圍內(nèi)[27]。結(jié)合Luo Yan等[12]對(duì)林麝乳酸菌的研究報(bào)道，本研究采用pH 2、3和4考察菌株的耐酸能力，采用膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%作為考察菌株耐膽鹽的指標(biāo)。結(jié)果表明，所有乳酸菌對(duì)低pH值（pH 3和pH 4）和膽鹽（0.5%和1.0%）均具有良好的耐受性，表現(xiàn)出不同的存活率，說明乳酸菌的耐受能力具有菌株特異性[28]。植物乳植桿菌和乳酸片球菌在pH 3的環(huán)境中，存活率分別最高達(dá)90.5%和89.5%。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%膽鹽環(huán)境中，存活率分別最高達(dá)89.5%和73.5%，高于之前報(bào)道的乳酸菌在相同條件下的存活率[12,25,28-29]。所有分離株在pH 2的環(huán)境下存活率大幅下降，這與前人報(bào)道的“許多益生菌在pH 2或更低的條件下，菌株的存活率顯著下降”這一結(jié)果[29]相似。

體外對(duì)致病菌的抗菌活性被認(rèn)為是益生菌的重要益生特性。本研究評(píng)價(jià)12 株乳酸菌對(duì)常見腸道病原菌的抑菌活性。植物乳植桿菌和乳酸片球菌上清液對(duì)5 種病原菌均表現(xiàn)出抗菌作用，其中對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌性（抑菌圈直徑＞16 mm）優(yōu)于先前的報(bào)道[12,25,30]。短乳桿菌、腸球菌和腸膜明串珠菌對(duì)病原菌的抗菌活性較弱，或者無抑菌活性。所有的菌株上清液被中和后（pH 6），抗菌活性大幅降低（數(shù)據(jù)沒有列出），說明分離株的抑制特性主要?dú)w因于有機(jī)酸的產(chǎn)生。本研究首次報(bào)道了植物乳植桿菌和乳酸片球菌對(duì)林麝源化膿隱秘桿菌具有一定程度的抑制作用，抑制效果優(yōu)于其他菌株，這可能與其發(fā)酵pH值有關(guān)。植物乳植桿菌和乳酸片球菌在培養(yǎng)24 h后pH值在3.8～3.9，其他幾株分離株pH值在4.0～4.5。Luo Yan等[12]研究報(bào)道乳酸菌的抑菌活性與其發(fā)酵pH值有關(guān)，其發(fā)酵pH值越低，抑菌活性越強(qiáng)。

細(xì)菌的黏附能力被認(rèn)為是益生菌選擇的重要標(biāo)準(zhǔn)[31]。盡管在本研究中沒有直接探究乳酸菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附能力，但通過自聚集能力和疏水特性來間接評(píng)估其黏附能力。益生菌的自聚集能力影響其對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附[32]。本研究測(cè)定植物乳植桿菌、腸球菌和乳酸片球菌在6 h后，自聚集率達(dá)到了50.9%～56.8%，與之前報(bào)道的結(jié)果[10]相似。疏水性使得益生菌與宿主上皮細(xì)胞之間的相互作用增加[31]。本研究通過與氯仿的相互作用模擬黏附于腸上皮細(xì)胞的能力。參照Lu Youyou等[33]報(bào)道對(duì)疏水性程度的劃分標(biāo)準(zhǔn)，12 株分離菌中有7 株表面疏水率在52.4%～56.0%之間，表明它們可能具有較高的黏附性，這是菌株能夠發(fā)揮其潛在功能的重要前提。其中植物乳植桿菌的疏水率最高達(dá)56%，其次為屎腸球菌（53.5%）和乳酸片球菌（52.9%），這與之前文獻(xiàn)報(bào)道乳酸菌的疏水率在60%[33]結(jié)果相似。結(jié)合自聚集能力評(píng)估結(jié)果，推斷植物乳植桿菌、屎腸球菌和乳酸片球菌可能具有較高的黏附活性，易黏附于腸道細(xì)胞發(fā)揮益生作用。

益生菌的一個(gè)重要安全要求就是不可攜帶可轉(zhuǎn)移抗性基因，因此益生菌的候選菌株必須鑒定其抗生素敏感性，并有必要進(jìn)行抗性基因的測(cè)定和可轉(zhuǎn)移性分析[34]。本研究評(píng)價(jià)了12 株乳酸菌對(duì)9 種抗生素的耐藥性。大部分菌株表現(xiàn)出對(duì)鏈霉素、環(huán)丙沙星和萬古霉素高耐藥性，這與之前報(bào)道的結(jié)果[10,29]相似。4 株腸球菌對(duì)6 種抗生素的敏感性存在較大差異，說明腸球菌對(duì)抗菌藥物的敏感性具有種屬依賴性[12]。先前研究表明，屎腸球菌對(duì)萬古霉素具有高耐藥性[12]，但本研究測(cè)試的3 株屎腸球菌對(duì)萬古霉素呈現(xiàn)中度耐藥。結(jié)合體外益生菌評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究篩選出具有良好益生潛力的5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌作為益生菌候選菌株，進(jìn)一步對(duì)這6 株乳酸菌進(jìn)行抗藥性基因分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性表型與基因型差異很大，盡管菌株表現(xiàn)出對(duì)環(huán)丙沙星和鏈霉素的抗性，但是沒有擴(kuò)增到環(huán)丙沙星和鏈霉素的抗性基因，說明這些乳酸菌表現(xiàn)出的抗性屬于固有抗性，其抗性產(chǎn)生可能與細(xì)胞膜對(duì)該抗生素的低滲透性有關(guān)[30,33]，一般這類抗性是安全的，不發(fā)生基因轉(zhuǎn)移。此外，篩選出的6 株乳酸菌均檢測(cè)出萬古霉素抗性基因vanX，這與之前報(bào)道的vanX基因廣泛存在于乳酸菌中結(jié)論一致[35]。有研究表明，vanX基因負(fù)責(zé)編碼蛋白D,D-二肽酶，導(dǎo)致肽聚糖前體的合成終止于D-丙氨酸-D-乳酸而不是D-丙氨酸-D-丙氨酸，從而消除藥物靶點(diǎn)[36]。這種耐藥性通常是染色體編碼的，被認(rèn)為是固有耐藥，它們的基因已經(jīng)被證明是不可轉(zhuǎn)移的[37]。

此外，對(duì)篩選出的6 株乳酸菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，乳酸菌在接種4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，10～12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，這與前人報(bào)道[38]基本一致。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的植物乳植桿菌和乳酸片球菌在培養(yǎng)24 h后的OD600分別達(dá)9.0和7.1左右，高于文獻(xiàn)報(bào)道的從其他動(dòng)物腸道中分離的乳酸菌生長OD600值（3.0～4.0）[39-40]，這可能和菌株來源不同有關(guān)，說明林麝腸道中的植物乳植桿菌和乳酸片球菌具有快速生長的特點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究從林麝糞便中分離篩選出12 株乳酸菌，采用16S rDNA測(cè)序?qū)θ樗峋M(jìn)行種水平鑒定。以現(xiàn)有的商品化益生菌作為對(duì)照，通過耐酸耐膽鹽能力、抗生素敏感性、拮抗活性、自聚集能力和細(xì)胞表面疏水性等益生特性研究，篩選出5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌，它們具有較好的益生特性和快速生長的特點(diǎn)，但還需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究證實(shí)其應(yīng)用潛力。本研究揭示了從林麝腸道中收集的乳酸菌分離株的益生特性，為研制出能夠充分適應(yīng)林麝腸道環(huán)境、改善林麝健康狀況的益生菌制劑提拱了可靠的菌種來源。