腸道菌群通過去乙?；?激活單磷酸腺苷活化的蛋白激酶/雷帕霉素信號通路對膿毒癥心肌炎和心肌細胞線粒體損傷的影響

林爽 翟京宇 羅彬

膿毒癥心肌炎是由膿毒癥引起的心肌炎癥反應,可造成嚴重的心肌功能損傷,其特征是左心室射血分數(shù)降低和左心室擴張受限[1-4]。研究表明,線粒體損傷與膿毒癥心肌炎密切相關[5]。去乙酰化酶3(SIRT3)主要表達于線粒體,其調(diào)控的單磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素(mTOR)信號通路不僅可改善線粒體損傷,也能修復膿毒癥中的炎癥損傷[6-7]。但在膿毒癥心肌炎中,SIRT3調(diào)控的AMPK/mTOR信號通路對線粒體損傷的調(diào)控作用尚不清楚。實驗表明,腸道糞菌移植(FMT)是改善膿毒癥心肌炎的一種有效工具[8],該治療可減輕膿毒癥中的炎癥反應和氧化損傷[9],表明其在治療膿毒癥方面具有很大的潛力。然而,腸道菌群對膿毒癥心肌炎和心肌細胞線粒體損傷的具體調(diào)控作用并不清楚。本研究探討正常腸道FMT對膿毒癥心肌炎和心肌細胞線粒體損傷的改善作用與機制。

材料與方法

1.材料:10周齡的雄性SD大鼠40只(219.5g～242.8g)購于新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院實驗動物中心。SIRT3、AMPK、mTOR、磷酸化AMPK(p-AMPK)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)、IL-1β、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗均購自于英國Abcam公司;SIRT3的抑制劑3-TYP(HY-108331)購于美國MCE公司;IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的ELISA試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。

2.方法

(1)分組及手術方式:40只SD大鼠在控溫環(huán)境(21 ℃～23 ℃)進行飼養(yǎng),12 h光/12 h暗交替循環(huán),并自由攝取標準鼠糧和自來水。將其隨機分為盲腸結扎穿孔術(CLP)建立的膿毒癥模型組(CLP組)、假手術對照組(sham組)、FMT治療組(CLP+FMT組)及FMT聯(lián)合SIRT3抑制劑(3-TYP)治療組(CLP+FMT+3-TYP組),每組各10只。所有大鼠均接受腹腔注射4%戊巴比妥(0.2 ml/kg)麻醉,CLP組大鼠在手術剖腹后,先用不可吸收的縫線在第一個盲腸上進行結扎,再用50 ml注射器針制造兩對小孔,部分腸內(nèi)內(nèi)容物被擠出,返回腹腔,傷口閉合。sham組大鼠進行開腹和閉腹術,未行CLP。在無菌環(huán)境下收集大鼠正常糞便標本,糞便標本用0.9%生理鹽水均勻化(200 mg/ml),然后以2 000 rpm轉速離心10 min后收集上清液作為正常菌群菌液。CLP+FMT組大鼠在CLP術前30 min用滅菌導管經(jīng)肛門插入深約5 cm后緩慢注入5 ml上述方法收集的菌液,然后將大鼠倒置3～5 min,其余步驟同CLP組,并在CLP術后1～8天,每天繼續(xù)注入菌液1次。CLP+FMT+3-TYP組同CLP+FMT組的操作并在術后立即尾靜脈注射3-TYP(30 mg/kg),且在CLP術后1～8天,每天注射1次3-TYP(30 mg/kg)。8天后收集所有大鼠新鮮血液和心肌組織,并用福爾馬林固定心肌組織,用于石蠟切片和電鏡觀察。新鮮的心肌組織保存于-80 ℃冰箱中。本實驗所有大鼠的研究均經(jīng)過新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過。

(2)HE染色:采用HE染色觀察sham組和CLP組大鼠心肌組織的病理變化,包括形態(tài)變化和炎性細胞浸潤情況。

(3)ELISA:采用ELISA法對4組大鼠血液中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平進行檢測。

(4)Western blot:將大鼠新鮮心肌組織勻漿后取總蛋白,采用Western blot檢測IL-1β、NLRP3、SIRT3、AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR的表達水平。

(5)透射電鏡:使用HT7700日立顯微鏡對大鼠心肌組織進行透射電鏡檢測。大鼠新鮮心肌組織剪碎經(jīng)胰酶消化后,以1 500 rpm離心5 min。用4%多聚甲醛孵育后固定于聚醋酸甲基乙烯脂-鎳網(wǎng)上。1 min后,滴加1%磷鎢酸溶液10 μl,靜置1 min,然后用濾紙將多余的液體從網(wǎng)邊緣吸去。得到的樣品在室溫空氣中干燥10 min,最后用透射電鏡觀察心肌細胞線粒體形態(tài)。

(6)流式細胞術:用胰酶消化4組大鼠的心肌組織,以1 500 rpm離心5 min,在0.5 ml細胞培養(yǎng)液中重懸,然后用10 nmol/L熒光陽離子染料TMRM在37 ℃下培養(yǎng)30 min。采用流式細胞儀檢測熒光水平,分析各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位變化。

結 果

1.膿毒癥心肌炎大鼠模型建立情況:與sham組比較,CLP組大鼠心肌組織出現(xiàn)顯著的炎性細胞浸潤,且心肌組織IL-1β[(11.27±2.02)比(1.00±0.03)]和NLRP3[(5.59±0.58)比(1.00±0.01)]表達水平均顯著升高(P<0.05),表明CLP誘導的膿毒癥心肌炎大鼠模型建立成功。見圖1。

圖1 sham組和CLP組大鼠心肌組織(A:sham組;B:CLP組,箭頭所示為炎性細胞;HE染色,×200)

2.4組大鼠心肌組織與血液中相關指標比較:與sham組比較,CLP組、CLP+FMT組、CLP+FMT+3-TYP組心肌組織SIRT3和p-mTOR表達水平均顯著降低,而心肌組織p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平均顯著增加(P<0.05)。與CLP組比較,CLP+FMT組心肌組織SIRT3和p-mTOR的表達水平均顯著增加,而心肌組織p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平均顯著降低(P<0.05)。與CLP+FMT組比較,CLP+FMT+3-TYP組心肌組織SIRT3和p-mTOR的表達水平均顯著降低,而心肌組織中p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平均顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠心肌組織與血液中相關指標比較

3.4組大鼠心肌細胞線粒體損傷情況比較:sham組、CLP組、CLP+FMT組與CLP+FMT+3-TYP組大鼠紅/綠熒光強度比值分別為0.24±0.04、0.07±0.01、0.19±0.03、0.10±0.02,4組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=86.335,P=0.021)。與sham組比較,CLP組心肌細胞線粒體發(fā)生腫脹、線粒體膜發(fā)生了嚴重裂解,而且線粒體膜電位的紅/綠熒光強度比值顯著下降;與CLP組比較,CLP+FMT組心肌細胞線粒體也發(fā)生了腫脹但線粒體膜是完整的,且線粒體膜電位的紅/綠熒光強度比值顯著增加;與CLP+FMT組比較,CLP+FMT+3-TYP組中心肌細胞線粒體發(fā)生膨脹和線粒體膜的完整性降低,且線粒體膜電位的紅/綠熒光強度比值顯著下降(P<0.05)。見圖2。

圖2 4組大鼠心肌組織線粒體損傷情況(A、E:sham組;B、F:CLP組;C、G:CLP+FMT組;D、H:CLP+FMT+3-TYP組;A、B、C、D:橫截面;E、F、G、H:縱切面;黑色箭頭:線粒體膜破裂;白色箭頭:線粒體膜少量破裂;×10 000)

討 論

本文采用CLP建立膿毒癥心肌炎大鼠模型,觀察到CLP可顯著誘導大鼠膿毒癥心肌炎和心肌細胞的線粒體損傷,而FMT治療對線粒體損傷和心肌炎有明顯的改善作用。此外,正常腸道菌群的治療作用依賴于SIRT3激活的AMPK/mTOR信號通路,而抑制SIRT3后導致AMPK/mTOR信號通路失活可減弱腸道菌群對線粒體功能和心肌炎的改善作用。因此,正常腸道菌群可通過SIRT3激活AMPK/mTOR信號通路對膿毒癥心肌炎和心肌細胞線粒體損傷均有改善作用。癥心肌炎和線粒體損傷。

已知SIRT3可通過減少氧化損傷和炎癥反應,對線粒體損傷起保護作用[10],且SIRT3通過增加AMPK/mTOR介導的自噬對膿毒癥誘導的腎損傷起改善作用[11]。本研究結果發(fā)現(xiàn)CLP術后SIRT3表達降低,提示SIRT3可能在此過程中扮演重要角色。研究證實,SIRT3的激活尤其是對下游信號AMPK/mTOR的激活促進了細胞自噬[12]。本研究同樣證實上調(diào)SIRT3可顯著促進AMPK/mTOR信號軸激活,且當抑制SIRT3后p-mTOR水平顯著降低,表明SIRT3也可能對膿毒癥導致的心臟功能損傷有修復作用,這些作用伴隨著p-AMPK上調(diào)和p-mTOR下調(diào)。這些結果強調(diào)了在膿毒癥心肌炎模型中,干預SIRT3從而調(diào)控AMPK/mTOR信號通路對炎癥和線粒體損傷改善作用的重要性。

細胞線粒體損傷由mTOR作為主要途徑進行調(diào)節(jié)[13]。在有害刺激下,維持心功能正常的關鍵因素是維持細胞能量和代謝穩(wěn)定。而mTOR信號被認為是代謝應激條件下細胞能量的主要調(diào)節(jié)因子,因其可通過抑制ATP消耗的合成代謝通路和激活分解代謝通路來建立ATP穩(wěn)態(tài)[14]。本研究使用腸道菌群治療模型大鼠,觀察到正常腸道FMT可明顯激活AMPK/mTOR信號通路,并顯著減少心肌組織中NLRP3和IL-1β及血液中炎癥因子水平,此外我們通過透射電鏡平臺觀察到正常腸道FMT可顯著保護線粒體膜并防止其破裂。而當使用SIRT3特異性抑制劑后腸道菌群對線粒體的保護作用和對促炎反應的抑制作用均顯著減弱。Zhao等[11]的研究也表明,SIRT3對線粒體具有保護作用,當敲除SIRT3后膿毒癥明顯加重,而當重新激活AMPK/mTOR信號通路后SIRT3的保護作用顯著恢復,該研究支持了我們的結果?；诖?本實驗表明,正常腸道FMT可改善膿毒癥心肌炎和減緩線粒體損傷,其關鍵機制是SIRT3-AMPK/mTOR通路激活。本研究存在一些局限性:首先,對動物模型分離的心肌組織和心肌組織酶解后的細胞進行了分析,但缺乏具體的體外細胞實驗結果的驗證;其次,樣本數(shù)量仍較少,需進一步擴大樣本進行體內(nèi)外研究。

綜上所述,腸道菌群通過SIRT3激活AMPK/mTOR信號通路改善膿毒癥心肌炎和心肌細胞線粒體損傷。腸道菌群可能是極具潛力的膿毒癥心肌炎和線粒體損傷的保護策略,SIRT3-AMPK/mTOR信號軸是潛在抑制膿毒癥心肌損傷、炎癥反應和線粒體損傷的關鍵治療靶點。