循環(huán)血微小RNA-132和微小RNA-195在慢性阻塞性肺疾病相關(guān)肺動脈高壓患者中的表達及意義

朱殷慧 蔡茜 楊密

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是因肺泡和(或)氣道異常而發(fā)生的以氣流受限和持續(xù)呼吸道癥狀為特征的一種疾病,常因長期暴露于有害氣體或顆粒中所致[1]。COPD發(fā)病率呈逐年增長,而肺動脈高壓(PH)是其常見并發(fā)癥[2],其中50%～60% COPD會繼發(fā)PH[3]。右心導管檢查是診斷PH的金標準,但該方法操作復雜,并存在潛在并發(fā)癥。因此,尋找COPD相關(guān)PH診斷的新指標日益受到重視。微小RNA(miRNA,miR)是近年來的研究熱點,參與腫瘤、免疫及炎癥等多種疾病的發(fā)病過程[4-6]。研究發(fā)現(xiàn),多種miRNA在COPD中異常表達[7]。miR-132和miR-195是重要的miRNA,研究發(fā)現(xiàn)其參與呼吸系統(tǒng)疾病的諸多過程[8]?；诖?本研究主要探討循環(huán)血miR-132和miR-195在COPD相關(guān)PH患者中的表達及意義。

對象與方法

1.對象:納入2020年9月～2022年2月于我院就診的COPD相關(guān)PH患者108例作為觀察組,其中男63例,女45例,年齡45～74歲,平均年齡(64.87±6.92)歲,平均BMI(22.31±2.87)kg/m2;吸煙史46例;高血壓24例,糖尿病20例。另納入同期于我院就診的COPD但無COPD相關(guān)PH患者97例作為對照組,其中男58例,女39例,年齡42～75歲,平均年齡(65.07±5.62)歲,平均BMI(22.16±3.25)kg/m2;吸煙史42例;高血壓20例,糖尿病15例。兩組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。COPD的診斷參照《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2021年修訂版)》[9];PH的診斷參照歐洲呼吸學會和歐洲心臟病學會聯(lián)合制定的關(guān)于PH的診斷標準[10]。排除標準:(1)伴間質(zhì)性肺疾病、支氣管擴張及支氣管哮喘;(2)伴肺炎或其他部位急性感染;(3)伴心臟瓣膜病、先天性心臟病、肺栓塞及特發(fā)性PH引起的PH;(4)嚴重精神疾病;(5)近3個月有手術(shù)史;(6)肝腎功能不全。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準,所有患者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)循環(huán)血miR-132和miR-195相對表達水平檢測:抽取患者外周靜脈血6 ml,置于肝素鈉抗凝管中,混勻備用,外周血單個核細胞(PBMC)以Ficoll淋巴細胞分離液提取。PBMC總RNA按照Trizol試劑(昆山遠慕生物科技有限公司)說明書提取,再以焦碳酸二乙酯處理過的蒸餾水溶解。采用分光光度儀測定總RNA濃度和質(zhì)量。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄成互補DNA,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-70 ℃冰箱待用。采用SYBR法進行實時熒光定量定量PCR(qRT-PCR)檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成,見表1?？偡磻w系20 μl:包括10 μl RNase-free H2O、2.0 μl cDNA、0.4μl PCR reverse primer、0.4 μl DYE I、0.4 μl PCR forward primer、6.8 μl SYBER GREEN,將上述物質(zhì)混勻后行qRT-PCR擴增。反應條件:95 ℃預變性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min,共40個循環(huán),每個樣品設(shè)置3個復孔,以U6作為內(nèi)參。采用2-△△Ct法計算miR-132和miR-195相對表達水平,△CT=CT目的基因-CTU6;△△CT=△CT觀察組-△CT對照組。

表1 引物序列

(2)肺功能測定:采用德國耶格肺功能儀測定第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力呼氣容積(FVC)、FEV1占預計值的百分比(FEV1%)。

(3)肺動脈壓測定:采用三尖瓣最大反流流速估測右心室收縮壓(RVSP),在無右心室流出道梗阻且無心內(nèi)分流時,RVSP近似于肺動脈收縮壓(sPAP)。sPAP=RVSP=4VTR(三尖瓣反流最大速度)+右心房壓力(RAP)。

結(jié) 果

1.兩組患者臨床資料比較:觀察組患者循環(huán)血miR-132相對表達水平及sPAP均高于對照組,循環(huán)血miR-195相對表達水平及FEV1%、FEV1/FVC均低于對照組(P<0.001)。見表2。

表2 兩組患者臨床資料比較

2.循環(huán)血miR-132和miR-195對COPD相關(guān)PH的預測價值:ROC曲線分析結(jié)果顯示,循環(huán)血miR-132預測COPD相關(guān)PH的ROC曲線下面積(AUC)為0.894(95%CI0.863～0.947),最佳截斷值為1.98,對應的敏感度和特異度分別為77.81%、82.63%;循環(huán)血miR-195預測COPD相關(guān)PH的AUC為0.912(95%CI0.882～0.955),最佳截斷值為0.65,對應的敏感度和特異度分別為83.31%、78.72%。

3.COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-132和miR-195與FEV1%、FEV1/FVC及sPAP的相關(guān)性:Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-132與FEV1%、FEV1/FVC均呈負相關(guān)(r=-0.517,P<0.001;r=-0.628,P<0.001),與sPAP呈正相關(guān)(r=0.564,P<0.001);COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-195與FEV1%、FEV1/FVC均呈正相關(guān)(r=0.586,r=0.521,P均<0.001),與sPAP呈負相關(guān)(r=-0.507,P<0.001)。

4.COPD相關(guān)PH的影響因素分析:多元logistic回歸分析結(jié)果顯示,循環(huán)血miR-132和miR-195均為COPD相關(guān)PH的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 COPD相關(guān)PH影響因素的多元logistic回歸分析

討 論

COPD是一種慢性氣道疾病,其患病率逐漸上升,且存在較高的致死率[11]。而PH是COPD的重要并發(fā)癥之一,研究發(fā)現(xiàn)PH是促使COPD進展至肺心病的重要環(huán)節(jié)[12]。當COPD造成氣道阻塞,則會使肺血管和肺實質(zhì)受到損害,致使肺小動脈管壁增厚、纖維化或管腔狹窄,從而導致肺血管阻力增加,以此造成PH發(fā)生及肺循環(huán)血管重塑[13]。由于COPD相關(guān)PH是不可逆的病理變化,長期低氧造成低氧性肺血管收縮,血管舒張因子分泌紊亂,肺血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞增殖,以此形成不可逆的肺血管重構(gòu),惡性循環(huán)進而引起PH[14-15]。COPD相關(guān)PH發(fā)病機制尚未完全明確,包括環(huán)境因素、表觀遺傳因素等,各種類型PH存在一些共同的病理改變,如肺動脈平滑肌細胞增殖與遷移、肺動脈內(nèi)皮細胞損傷等[16-17]。及時有效地準確評估COPD相關(guān)PH尤為關(guān)鍵。

miRNA在多種組織和器官中廣泛表達,參與腫瘤遷移和侵襲等病理生理過程,并且在多種疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn),miRNA異常表達與PH發(fā)病關(guān)系緊密,并在PH血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[18]。多種miRNA在炎癥性肺疾病中異常表達,并發(fā)現(xiàn)其作用的靶點,參與了炎癥、免疫的調(diào)節(jié)。持續(xù)性慢性炎癥可造成某些miRNA表達失調(diào)、組織重建和修復,進而導致PH形成。miR-132主要通過抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1發(fā)揮促炎作用。miR-195不僅參與細胞缺氧的調(diào)控,并且參與機體固有免疫的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示,觀察組患者循環(huán)血miR-132相對表達水平高于對照組,miR-195相對表達水平低于對照組;循環(huán)血miR-132預測COPD相關(guān)PH的敏感度和特異度分別為77.81%、82.63%,循環(huán)血miR-195預測COPD相關(guān)PH的敏感度和特異度分別為83.31%、78.72%;COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-132與FEV1%、FEV1/FVC均呈負相關(guān),與sPAP呈正相關(guān),COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-195與FEV1%、FEV1/FVC均呈正相關(guān),與sPAP呈負相關(guān);循環(huán)血miR-132和miR-195為COPD相關(guān)PH的獨立危險因素,表明COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-132呈高表達而miR-195呈低表達,循環(huán)血miR-132和miR-195對COPD相關(guān)PH的預測價值良好,COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-132與肺功能呈負相關(guān)而與sPAP呈正相關(guān),而COPD相關(guān)PH循環(huán)血miR-195與肺功能呈正相關(guān)而與sPAP呈負相關(guān),由此可見循環(huán)血miR-132和miR-195與COPD相關(guān)PH密切相關(guān),且與肺功能密切相關(guān),但其具體作用機制尚未完全明確,還需后續(xù)研究增加樣本量和觀察時間并進行多中心研究進一步證實,以期為臨床提供可靠參考依據(jù)。

綜上所述,COPD相關(guān)PH患者循環(huán)血miR-132呈高表達,而循環(huán)血miR-195呈低表達,且循環(huán)血miR-132和miR-195對COPD相關(guān)PH的預測價值良好,為COPD相關(guān)PH的獨立危險因素。