生鮮乳及乳制品中乳鐵蛋白檢測方法的研究

蘇 霞,劉松雁,朱子晨,趙興鑫,王 昊,楊曉霞,苗新發(fā)

（1.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測中心 050041；2.石家莊市鹿泉區(qū)農(nóng)產(chǎn)品綜合質(zhì)檢站 050000；3.行唐縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 050000；4.行唐縣龍州鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心 050000）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種鐵結(jié)合糖蛋白，主要由中性粒細(xì)胞分泌，并廣泛存在于哺乳動(dòng)物的外分泌液中，如乳汁、唾液、淚液、精液和鼻液等。乳鐵蛋白分子質(zhì)量約為80 kDa，具有兩個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，因此具有很高的親鐵性。該蛋白質(zhì)在人和其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，主要包括：抗菌作用、抗炎作用、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)鐵的吸收和運(yùn)輸、抗氧化作用以及抗腫瘤[1]。

乳鐵蛋白在多種生物流體中的濃度變化與多種疾病的發(fā)展有著密切關(guān)系。例如，在感染、炎癥和腫瘤等疾病過程中，乳鐵蛋白水平的變化可以作為早期診斷和療效觀察的生物標(biāo)志物。同時(shí)，乳鐵蛋白也是營養(yǎng)學(xué)研究和食品工業(yè)中的重要組分，其含量直接影響到乳制品的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值[2]。因此，準(zhǔn)確、快速地檢測乳鐵蛋白對(duì)于臨床診斷、疾病預(yù)防、營養(yǎng)評(píng)估和食品安全控制具有重要意義。

1 乳鐵蛋白概述

乳鐵蛋白可以與細(xì)菌的鐵離子結(jié)合，限制其獲得鐵的能力，從而抑制細(xì)菌生長。此外，乳鐵蛋白還能直接與細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲的表面相互作用，干擾其生命周期。乳鐵蛋白能夠減輕炎癥，它可以通過抑制細(xì)菌生長來減少炎癥反應(yīng)，同時(shí)能減輕因病毒引發(fā)的炎癥反應(yīng)。乳鐵蛋白能夠影響T 和B 淋巴細(xì)胞的增殖和成熟，影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，并通過免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、免疫球蛋白的運(yùn)輸和組織再生等機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)。乳鐵蛋白能夠?qū)㈣F離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，并將鐵釋放給需要的蛋白質(zhì)如血紅蛋白等，從而在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)鐵離子的平衡。乳鐵蛋白具備捕捉自由基和減少氧化應(yīng)激的功能，有利于保護(hù)體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不受損害。部分研究表明，乳鐵蛋白能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，其抗腫瘤機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、影響腫瘤生長因子等有關(guān)。

2 常見乳鐵蛋白檢測方法

在乳鐵蛋白檢測過程中，由于乳制品和其他生物樣品中的蛋白質(zhì)和其他組分的復(fù)雜性可能會(huì)干擾乳鐵蛋白的檢測；不同樣品中乳鐵蛋白的濃度差異很大，需要檢測方法有較寬的量程和高的靈敏度；食品中的脂質(zhì)、糖類等雜質(zhì)也可能對(duì)檢測方法造成干擾。這些挑戰(zhàn)需要通過優(yōu)化和開發(fā)新的檢測方法來解決，包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、免疫熒光技術(shù)、質(zhì)譜分析以及新興的生物傳感器技術(shù)等。每種技術(shù)都有其特點(diǎn)和局限性，因此，在實(shí)際應(yīng)用中需要根據(jù)檢測的目的、樣品性質(zhì)以及可用資源來選擇最適合的方法。

2.1 免疫分析法

2.1.1 膠體金法

這種方法利用膠體金作為標(biāo)記物，通過毛細(xì)作用將樣品沿紙條移動(dòng)并與預(yù)先固定的抗體發(fā)生反應(yīng)，常常用于快速檢測。但這種方法的靈敏度和定量精度可能低于ELISA。井金苗等[3]建立一種能快速定量檢測乳制品中牛乳鐵蛋白含量的膠體金免疫層析方法，該方法重復(fù)性和線性良好且特異性強(qiáng)，為檢測樣品中的乳鐵蛋白提供了一種快速、靈敏、簡便的定量檢測方法。

2.1.2 酶聯(lián)免疫分析法

利用抗體的特異性結(jié)合原理，通過抗原-抗體的免疫反應(yīng)，并通過酶標(biāo)記的檢測來定量分析乳鐵蛋白。通過涂層對(duì)應(yīng)乳鐵蛋白的抗體，然后添加生鮮乳樣本，在洗滌后添加二次抗體和底物，通過顏色變化的強(qiáng)度來定量乳鐵蛋白含量。在乳鐵蛋白檢測中，這種方法具有高度的敏感性和特異性。薛輝等[4]建立乳鐵蛋白酶免疫分析法，檢測乳鐵蛋白在血清及乳汁中的水平，該方法穩(wěn)定、簡便、特異適于檢測人血清和乳汁中的乳鐵蛋白水平。

2.1.3 免疫擴(kuò)散法

龔廣予等[5]介紹了一種檢測乳鐵蛋白的方法-放射免疫擴(kuò)散法，乳鐵蛋白與抗血清具有特異的免疫反應(yīng)，經(jīng)過一系列染色、脫色和清洗后可以測量到反應(yīng)沉淀帶，該沉淀帶的直徑與參與反應(yīng)的抗原、抗體濃度成正比，利用該特性可檢測乳鐵蛋白的含量。這種方法簡便、成本低，但相比ELISA 和膠體金法，其靈敏度和分辨能力較低。

2.2 液相色譜法

液相色譜法（HPLC）能夠在復(fù)雜的樣品中分離個(gè)別分子，對(duì)于乳鐵蛋白等蛋白質(zhì)具有高分辨率。提供準(zhǔn)確的定量分析，可以使用外標(biāo)曲線法等進(jìn)行定量。需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如蛋白質(zhì)沉淀、脫脂等，以減少色譜柱的污染。相比凝膠電泳，HPLC 通常具有更快的分析速度，尤其是在高效液相色譜系統(tǒng)中。需要專業(yè)的設(shè)備和操作技術(shù)，操作人員需具備一定的專業(yè)知識(shí)。蘇昭侖等[6]對(duì)使用肝素親和柱-高效液相色譜法快速測定乳粉中乳鐵蛋白進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果：乳鐵蛋白在上述色譜條件下能完全分離。乳鐵蛋白線性范圍為5.54～110.9 μg/mL，相關(guān)系數(shù)r=0.999966，方法檢出限為12 mg/100 g，定量限為28.5 mg/100 g；平均回收率97.5%～101.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜3.0%。該方法操作簡便，精密度和回收率高，重復(fù)性好。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（Capillary Electrophoresis, CE）具有極高的分離效率，可以在短時(shí)間內(nèi)分離復(fù)雜樣品中的多個(gè)組分。由于毛細(xì)管的體積較小，因此樣品消耗量很少，適用于樣品量有限的情況下。通過調(diào)整電泳條件（如緩沖液pH、電壓等），可以分離不同的分子。毛細(xì)管電泳裝置一般具備自動(dòng)化操作，分析速度較快?？梢赃M(jìn)行定量分析，但可能需要較為復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)過程。路夢凡等[7]使用高通量毛細(xì)管凝膠電泳檢測不同來源乳中乳鐵蛋白含量，，對(duì)人源、羊源乳鐵蛋白的檢出限分別為11.74 μg/mL、3.53 μg /mL，同時(shí)也可作為其他特色生鮮乳(牠牛乳、駱駝乳、驢乳等)中乳鐵蛋白含量的一種通用性檢測方法。

2.4 凝膠電泳法

對(duì)蛋白質(zhì)等大分子生物分子具有良好分辨率。操作相對(duì)直接簡單，易于掌握，是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的分析方法之一。通過染色等手段，可直接在凝膠上觀察分析結(jié)果。與HPLC 和CE 相比，設(shè)備和試劑成本較低，適合普通實(shí)驗(yàn)室條件。需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如使用SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離分析時(shí)，需加入SDS 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性。李珊珊等[8]采用凝膠成像系統(tǒng)SDSPAGE 法測定乳及乳制品中乳鐵蛋白，建立了包括分離膠濃度、濃縮膠電壓、分離膠電壓、染色、點(diǎn)樣量等操作條件，結(jié)果準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好。

2.5 質(zhì)譜分析法

2.5.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法

該方法結(jié)合了液相色譜（LC）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS）技術(shù)，作為一種高效靈敏的分析方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物樣品中蛋白質(zhì)和肽段的檢測。LC-MS/MS 可以精確地分離和檢測生鮮乳中的乳鐵蛋白，并且具有高度的靈敏度和選擇性，能夠在不同化合物具有相似的分子量或化學(xué)結(jié)構(gòu)時(shí)，準(zhǔn)確鑒定和定量乳鐵蛋白的含量。首先需要對(duì)生鮮乳樣品中的乳鐵蛋白進(jìn)行提取和富集。提取的混合物樣品經(jīng)過液相色譜分離，以將目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜質(zhì)物質(zhì)進(jìn)行有效分離。分離的乳鐵蛋白經(jīng)過質(zhì)譜檢測，電噴霧離子源（ESI）或者大氣壓化學(xué)電離源（APCI）被用于將樣品中的分子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子，質(zhì)譜法檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的特征離子。最后，通過分析LCMS/MS 數(shù)據(jù)，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或其他定量方法來計(jì)算含量。

2.5.2 液相色譜高分辨質(zhì)譜連用法

該方法結(jié)合了液相色譜 （LC）和高分辨率質(zhì)譜（HRMS）技術(shù)，具有更高的分辨率和檢測靈敏度，能夠在不同樣品中更準(zhǔn)確地鑒別和定量乳鐵蛋白，并且可以鑒定可能存在的雜質(zhì)和同分異構(gòu)體。與LC-MS/MS方法相似，首先需要將乳樣制備成適合LC-HRMS 分析的樣品，包括提取乳鐵蛋白，去除干擾物質(zhì)，并將其準(zhǔn)備成適合質(zhì)譜分析的溶液。之后使用液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，這一步驟可以有效地分離乳鐵蛋白和其他可能存在于乳液中的成分。分離后的化合物被送入高分辨質(zhì)譜中進(jìn)行檢測和定量，質(zhì)譜儀可以提供非常精準(zhǔn)的質(zhì)量測定，以確定乳鐵蛋白的存在和含量。最后，通過對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以確定乳鐵蛋白的存在和含量，一般通過比較樣品中的乳鐵蛋白與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)或數(shù)據(jù)庫中的已知數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。

2.6 光譜分析法

通過測定樣品的吸收、發(fā)射或散射光譜，可以定性和定量分析乳鐵蛋白。光譜分析法具有快速、簡單、無需樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)，可以用于快速篩查和檢測乳鐵蛋白。分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)特定波長的光吸收、透射或發(fā)射的特性進(jìn)行定量和定性分析的一種方法。在檢測生鮮乳中乳鐵蛋白時(shí)，分光光度法可以作為一種可行的定量分析方法。其工作原理是利用乳鐵蛋白在特定波長的光下的吸光度與其濃度成正比的關(guān)系。具體地，對(duì)于生鮮乳樣品中乳鐵蛋白的檢測，首先需要準(zhǔn)備一定濃度的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后通過將標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品一同置于分光光度計(jì)中進(jìn)行測量。在特定波長下，分光光度計(jì)會(huì)記錄標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品的吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或其他定量分析方法，能夠推導(dǎo)出待測樣品中乳鐵蛋白的濃度。研究表明，分光光度法在生鮮乳中乳鐵蛋白的檢測中具有成本低、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，并且也可用于大批量檢測。但需要注意的是，由于生鮮乳中乳鐵蛋白含量較低，可能需要一定的前處理步驟和高靈敏度的儀器來進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

2.7 生物傳感器檢測技術(shù)

生物傳感器是一種能夠?qū)⑸飳W(xué)事件轉(zhuǎn)化為可測量的信號(hào)的裝置，常用于檢測和監(jiān)測生物分子、細(xì)胞和微生物。在乳鐵蛋白檢測中，生物傳感器具有高靈敏度、快速檢測、實(shí)時(shí)監(jiān)測和易于操作的特點(diǎn)。生物傳感器能夠以非常低的濃度檢測乳鐵蛋白，即使在微量水平，也能夠?qū)崿F(xiàn)高度靈敏度和特異性的檢測。具有實(shí)時(shí)監(jiān)測的能力，可以快速響應(yīng)乳鐵蛋白的變化，適用于生產(chǎn)線上對(duì)乳鐵蛋白含量的連續(xù)監(jiān)測。利用生物傳感器的特點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)乳鐵蛋白的檢測，有助于迅速獲得生鮮乳產(chǎn)品的質(zhì)量信息。生物傳感器技術(shù)可以被集成到便攜式檢測設(shè)備中，因此能夠在現(xiàn)場、農(nóng)場或者生產(chǎn)線上進(jìn)行快速檢測，實(shí)現(xiàn)迅速的質(zhì)量控制。李琪等[9]利用高特異性抗原-抗體免疫反應(yīng)，結(jié)合磁納米技術(shù)構(gòu)建了一種能夠高效分離檢測乳粉體系中的乳鐵蛋白的生物傳感器。并對(duì)市售嬰兒乳粉中乳鐵蛋白含量進(jìn)行測定，結(jié)果與用高效液相色譜法檢測結(jié)果相差不大。

3 結(jié)論

乳鐵蛋白不僅作為一種生物活性物質(zhì)在人體健康中扮演重要角色，而且是乳制品質(zhì)量控制和商品價(jià)值評(píng)估的重要指標(biāo)。由于生鮮乳和乳制品中乳鐵蛋白濃度較低，且矩陣復(fù)雜，存在大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他小分子物質(zhì)，這些都會(huì)干擾乳鐵蛋白的檢測。因此，要求檢測方法具有高選擇性和靈敏度。目前方法主要存在的問題是操作復(fù)雜、成本高、檢測時(shí)間長或靈敏度和特異性不夠。未來的研究可能會(huì)集中在簡化檢測流程、降低成本和提高檢測速度方面。納米技術(shù)和生物傳感器的開發(fā)將有助于實(shí)現(xiàn)高靈敏度和高特異性的快速檢測。同時(shí)，將傳統(tǒng)分析技術(shù)與高通量技術(shù)結(jié)合，比如微流控芯片和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），可能是未來檢測方法發(fā)展的重要方向之一?？偟膩碚f，隨著新型高通量、高精度的分析儀器和技術(shù)的發(fā)展，乳鐵蛋白的檢測方法將趨向于快速、簡便、低成本和高準(zhǔn)確性，以滿足現(xiàn)代乳業(yè)和公共衛(wèi)生的需求。