PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)冬黑麥生理指標(biāo)的影響

烏日力嘎，鄧宇*，孫墨可

(1.長(zhǎng)春大學(xué) 園林學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 白城 137099)

黑麥(SecalecerealeL.)是禾本科黑麥屬栽培作物，有春黑麥和冬黑麥之分，冬黑麥可以在東北地區(qū)種植且越冬生長(zhǎng)[1]，抗逆性較強(qiáng)，廣泛種植冬黑麥可以提高冬季地表覆蓋，對(duì)提高糧食單產(chǎn)和保證糧食安全均有一定的積極作用[2]。冬黑麥富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸等生理活性成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在人類生活中具有重要意義[3]。干旱是嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的非生物脅迫之一，并且影響廣泛而深遠(yuǎn)。中國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，在世界上屬于水資源短缺的國(guó)家之一，再受全球氣候變暖的影響，旱災(zāi)更是頻繁發(fā)生，水資源短缺的矛盾也日益突出，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害，甚至?xí)苯游：Φ郊Z食安全問題[4]。干旱脅迫下，植物會(huì)產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的代謝紊亂，損壞細(xì)胞功能，使細(xì)胞保水能力下降，導(dǎo)致植物無法正常生長(zhǎng)發(fā)育甚至死亡。通過測(cè)定冬黑麥葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)可以反映出其在干旱脅迫條件下的生長(zhǎng)規(guī)律等。目前，科研人員對(duì)冬黑麥研究多以抗寒為主，采用PEG-6000模擬干旱脅迫及分子生物學(xué)水平研究較少，因此，本試驗(yàn)以俄羅斯冬黑麥BK01為研究對(duì)象，采用15% PEG-6000對(duì)水培冬黑麥模擬干旱脅迫，測(cè)定各脅迫時(shí)期冬黑麥葉片多項(xiàng)生理指標(biāo)，明確干旱脅迫下冬黑麥的生理特性，為進(jìn)一步干旱脅迫下冬黑麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究及探究其抗旱分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

俄羅斯冬黑麥BK01由吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冬黑麥脅迫處理

選擇健康、顆粒飽滿的冬黑麥種子，用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡消毒15 min，將消毒后的種子平鋪于培養(yǎng)皿中濕潤(rùn)的濾紙上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d至種子發(fā)芽。將發(fā)芽的冬黑麥種子轉(zhuǎn)入含1 L霍格蘭德營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)盤中并移至光照培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)(25 ℃，光照16 h，黑暗8 h)，營(yíng)養(yǎng)液每天更換1次。將冬黑麥水培至三葉一心后，利用15% PEG-6000模擬干旱脅迫，處理時(shí)間為0(CK)、3、6、9、12和24 h，每組處理重復(fù)3次，收集冬黑麥葉片，用于生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 冬黑麥生理指標(biāo)的測(cè)定

分別采用烘干稱重法測(cè)定相對(duì)含水率(RWC)，采用TBA法測(cè)定丙二醛(MDA)含量[5]，采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖(SS)含量[6]，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白(SP)含量[6]，采用比色法測(cè)定脯氨酸(Pro)含量[7]，采用可見光法測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性[8]，采用比色法測(cè)定過氧化物酶(POD)活性[9]，采用羥胺法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片相對(duì)含水率的影響

相對(duì)含水率通常能夠直觀地表現(xiàn)出植物的有效含水量。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)冬黑麥葉片的相對(duì)含水率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與0 h相比，冬黑麥葉片在干旱脅迫3、6、9、12、24 h的RWC極顯著降低，在脅迫24 h時(shí)RWC達(dá)最低，為59.028%(圖1)。因此，干旱脅迫導(dǎo)致冬黑麥葉片失水，相對(duì)含水率下降，對(duì)植物造成損害。

“**”表示差異極顯著(P<0.01)。圖1 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片相對(duì)含水率的影響Fig.1 Effects of drought stress on RWC content of winter rye leaves

2.2 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片丙二醛含量的影響

丙二醛含量能夠反映出膜脂過氧化的程度，也能間接反映抗旱能力的強(qiáng)弱。在15%PEG-6000模擬干旱脅迫下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)冬黑麥葉片的丙二醛含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在干旱脅迫時(shí)間達(dá)24 h時(shí)，冬黑麥葉片丙二醛含量最高，為7.741 μmol·g-1，且9、12、24 h的丙二醛含量與0 h相比極顯著升高，6 h的丙二醛含量與0 h相比顯著升高(圖2)。隨著干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，冬黑麥葉片丙二醛含量的累積，使膜脂過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，透性增強(qiáng)。

“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。圖3～8同。圖2 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of drought stress on MDA content of winter rye leaves

2.3 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片可溶性糖含量的影響

在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片可溶性糖含量變化呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)9 h時(shí)，冬黑麥葉片可溶性糖含量最高，為8.536 μg·g-1。冬黑麥葉片在干旱脅迫3、12 h的可溶性糖含量與0 h相比顯著升高，脅迫6和9 h葉片的可溶性糖含量與0 h相比極顯著升高(圖3)。干旱導(dǎo)致冬黑麥葉片細(xì)胞失水，可溶性糖含量升高能夠降低細(xì)胞失水性，維持新陳代謝正常進(jìn)行。

圖3 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片可溶性糖含量的影響Fig.3 Effects of drought stress on soluble sugar content in winter rye leaves

2.4 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白與可溶性糖是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫中起到提高植物保水能力的作用。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下，冬黑麥葉片可溶性蛋白含量變化，呈先上升后下降的趨勢(shì)。冬黑麥葉片在干旱脅迫處理3、6 h的可溶性蛋白含量與0 h相比顯著上升，9、12、24 h的可溶性蛋白含量與0 h相比極顯著上升。當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)9 h時(shí)冬黑麥葉片可溶性蛋白含量達(dá)最高，為17.702 mg·g-1(圖4)。冬黑麥葉片可溶性蛋白含量的增加能夠提高細(xì)胞保水能力，增強(qiáng)抗旱性。

圖4 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effects of drought stress on soluble protein content in winter rye leaves

2.5 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫中會(huì)主動(dòng)積累。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片脯氨酸含量呈上升趨勢(shì)，在24 h達(dá)到最高，為66.985 μg·g-1。冬黑麥葉片在干旱脅迫處理6、9 h的脯氨酸含量顯著高于0 h，12、24 h的脯氨酸含量與0 h相比極顯著上升(圖5)。隨著干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，冬黑麥葉片脯氨酸含量逐漸升高，能夠減緩葉片組織失水。

圖5 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片脯氨酸含量的影響Fig.5 Effects of drought stress on proline content in winter rye leaves

2.6 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片酶活性的影響

在干旱脅迫條件下植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，保護(hù)性酶可以有效地清除積累的自由基，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。在干旱條件下CAT和POD活性的作用是分解代謝中產(chǎn)生的H2O2，以避免H2O2積累對(duì)細(xì)胞的氧化破壞作用。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片CAT活性隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈先上升后下降趨勢(shì)，9、12、24 h的CAT活性與0 h相比極顯著上升，且干旱脅迫處理9 h時(shí)冬黑麥葉片CAT活性達(dá)到最高，為9.109 U·mg-1，6 h的CAT活性與0 h相比顯著上升(圖6)。

圖6 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片過氧化氫酶活性的影響Fig.6 Effect of drought stress on CAT activity in winter rye leaves

在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下，冬黑麥葉片POD活性變化，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，冬黑麥葉片POD活性呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)脅迫12 h時(shí)，冬黑麥葉片POD活性達(dá)到最大值，9、12、24 h時(shí)的POD活性與0 h相比顯著上升(圖7)。

圖7 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片過氧化物酶活性的影響Fig.7 Effect of drought stress on POD activity in winter rye leaves

在逆境脅迫條件下，SOD可以有效地清除植物的自由基，減少活性氧的含量，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片SOD活性變化，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，冬黑麥葉片SOD活性呈先上升后下降趨勢(shì)，脅迫處理9、12、24 h的SOD活性與0 h相比極顯著升高，在9 h時(shí)冬黑麥葉片SOD活性達(dá)到最高。冬黑麥葉片脅迫6 h的SOD活性與0 h相比顯著上升(圖8)。干旱脅迫導(dǎo)致冬黑麥葉片細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，SOD能夠減少活性氧積累。

圖8 干旱脅迫對(duì)冬黑麥葉片超氧化物歧化酶活性的影響Fig.8 Effect of drought stress on SOD activity in winter rye leaves

3 討論

干旱脅迫下相對(duì)含水率能夠表明植物的水分狀況的生理意義，能夠表現(xiàn)出植物的有效水分含量。劉碩等[11]以甘蔗為實(shí)驗(yàn)材料探索抗旱品種選育，發(fā)現(xiàn)干旱1 d時(shí)葉片相對(duì)含水率變化不明顯，但隨著干旱加劇，葉片相對(duì)含水率顯著降低，干旱9 d時(shí)云蔗05-51和粵糖93-159的葉片相對(duì)含水率僅為11.64%和8.89%，復(fù)水10 d后雖有所回升，但仍顯著低于對(duì)照。一些研究[12]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫期間，細(xì)胞的膨脹壓力降低，這減少了芽長(zhǎng)、生物量和植物生長(zhǎng)。干旱會(huì)導(dǎo)致葉片枯萎，植物生長(zhǎng)減少，花蕾形成減少，葉和葉面積減少，Rollins等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫是植物鮮重和干重、葉片數(shù)、總?cè)~面積、相對(duì)含水量、氣孔大小和頻率降低的原因。本研究中冬黑麥相對(duì)含水率呈逐漸下降趨勢(shì)，在干旱脅迫0 h時(shí)達(dá)最高，24 h時(shí)最低，與上述結(jié)果相似。

干旱脅迫時(shí)，膜脂過氧化導(dǎo)致MDA積累，使蛋白質(zhì)和核酸變性，導(dǎo)致膜脂流動(dòng)性降低，透性增強(qiáng)。MDA含量的高低在一定程度上能反映膜脂過氧化作用水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度，MDA含量越高品種抗旱能力越弱[7]。王曉雪等[7]研究表明，燕麥生長(zhǎng)早期根系抗氧化酶活性和脯氨酸含量隨干旱脅迫程度增加而增加。張翠梅等[15]研究干旱脅迫對(duì)不同抗旱苜蓿品種根系生長(zhǎng)特征及生理特性的影響發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫顯著增加了供試苜蓿根系的MDA含量和質(zhì)膜相對(duì)透性，說明供試苜蓿的膜脂過氧化水平均隨干旱脅迫程度增加而顯著增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果相似，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，在24 h時(shí)葉片MDA含量達(dá)到最高值，在干旱脅迫下葉片受到傷害，反映了干旱脅迫下冬黑麥葉片逆境損傷，產(chǎn)生了大量的MDA。

可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，在干旱脅迫中，可溶性糖類是參與滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)[16]?？扇苄蕴呛颗c植物葉片生理代謝調(diào)節(jié)能力和光合作用有關(guān)，葉片中可溶性糖含量隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，抗旱品種的可溶性糖含量高。蘇瑋娟等[17]研究表明，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性糖含量總體呈上升趨勢(shì)，在脅迫72 h時(shí)達(dá)到峰值，青引1號(hào)和定燕2號(hào)的可溶性糖含量較高，甜燕麥的可溶性糖含量最低。隨著脅迫時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，脅迫96 h時(shí)可溶性糖含量稍微降低。本研究中，冬黑麥可溶性糖含量呈先上升后下降趨勢(shì)，9 h時(shí)可溶性糖含量達(dá)最高，通過升高細(xì)胞液的滲透勢(shì)吸收水分，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性糖含量開始下降，自我調(diào)節(jié)能力下降。可溶性糖含量升高說明干旱脅迫下，冬黑麥通過可溶性糖含量的增加，降低細(xì)胞失水性，使自身新陳代謝能夠正常進(jìn)行。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在干旱脅迫中，可溶性蛋白的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。在干旱脅迫下可以通過植物中可溶性蛋白含量這一指標(biāo)來反映植物的抗旱性。很多研究證明，可溶性蛋白含量的變化與干旱強(qiáng)度有直接關(guān)系，隨著干旱脅迫強(qiáng)度的增加可溶性蛋白的含量表現(xiàn)為先增強(qiáng)后減弱；干旱脅迫對(duì)蛋白含量的影響各異，抗旱性強(qiáng)的品種能誘導(dǎo)基因更強(qiáng)的表達(dá)以適應(yīng)干旱脅迫，而抗旱性較弱的品種可能減弱或喪失其自我調(diào)節(jié)能力[6]。本實(shí)驗(yàn)冬黑麥葉片可溶性蛋白含量9 h最高，自我調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)，隨著脅迫時(shí)間調(diào)節(jié)能力下降，表明冬黑麥葉片細(xì)胞通過增加可溶性蛋白含量使細(xì)胞保水能力提高，使得適應(yīng)性增強(qiáng)，這與上述結(jié)果相似。

脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境條件下脯氨酸會(huì)主動(dòng)積累，受干旱脅迫的植物在植物的葉子、芽和根尖等區(qū)域表現(xiàn)出較高的脯氨酸濃度。植物中脯氨酸的積累可引起細(xì)胞滲透勢(shì)下降，提高細(xì)胞的吸水能力或使水分外滲，有助于細(xì)胞和組織的持水，使植物能夠吸收水分進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝[18]。Nasrin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，水稻品種BRRI Dhan-24在干旱脅迫下脯氨酸積累量增加。許多抗旱研究將脯氨酸含量的積累量作為植物抗旱指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)中冬黑麥的脯氨酸含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升的趨勢(shì)，24 h時(shí)達(dá)最高，與上述研究相似。脯氨酸含量升高說明了干旱脅迫下冬黑麥細(xì)胞通過增加脯氨酸的含量，使細(xì)胞滲透勢(shì)降低，阻止水分喪失，使自身新陳代謝能夠正常進(jìn)行，響應(yīng)了干旱脅迫。

逆境條件下植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過氧化物，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)代謝紊亂，損壞細(xì)胞功能。此時(shí)植物會(huì)產(chǎn)生CAT、POD、SOD、APX等保護(hù)酶，減少活性氧的含量，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。蘇瑋娟等[17]研究表明，除甜燕麥的SOD活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)一直上升外，其余材料的CAT、POD及SOD活性均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中冬黑麥葉片的3個(gè)酶活性隨脅迫的加劇均呈先上升后下降趨勢(shì)。其中，CAT與SOD活性在9 h時(shí)達(dá)到最高，POD活性在12 h時(shí)達(dá)到最高，與上述研究結(jié)果相似。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，在干旱脅迫初期葉片內(nèi)的過氧化物被CAT、POD和SOD活性分解或清除，緩解氧化的速度，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)冬黑麥葉片活性氧清除功能逐漸降低。