轉(zhuǎn)基因水稻感染SRBSDV后對植株營養(yǎng)物質(zhì)的影響

何曉嬋，周小軍，朱麗燕，朱浩，呂仲賢，徐紅星*

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

南方水稻黑條矮縮病(southern rice black-streaked dwarf disease)是2001年在我國廣東首次發(fā)現(xiàn)的一種新的水稻病毒病，主要由白背飛虱(Sogatellafurcifera(Horvth))傳播[1-2]。2009—2011年，該病毒病在我國水稻產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生，造成水稻減產(chǎn)，甚至絕收[3]。受臺風(fēng)和降雨等影響，該病毒病的介體昆蟲白背飛虱會隨著降雨和暖濕氣流遷飛、定居及蔓延，造成南方黑條矮縮病的流行。明確病毒是否對寄主植物的營養(yǎng)物質(zhì)等產(chǎn)生影響，是直觀解釋介體昆蟲寄主選擇偏好的基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步理解病毒的傳播機(jī)制，從而為培育抗蟲作物品種或制定綜合防治策略提供理論基礎(chǔ)。

已有研究表明，病毒的侵染會改變寄主植株的形態(tài)。如受玉米粗縮病毒(MRDV)侵染的玉米葉肉細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量減少，細(xì)胞器發(fā)生病變以及液泡膜也明顯內(nèi)陷[4]。水稻感染SRBSDV后植株明顯矮縮，分蘗增加，葉片深綠褶皺，后期莖稈上出現(xiàn)瘤狀突起[5]。植物病毒能夠引起植物營養(yǎng)狀況(氨基酸、可溶性糖含量等)的改變，從而影響媒介昆蟲的寄主適應(yīng)性。研究證明，木薯花葉病毒(cassava mosaic virus，CMV)侵染能夠顯著提高木薯植株韌皮部汁液中氨基酸的含量，有利于媒介昆蟲煙粉虱的種群增長[6]；Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，感染SRBSDV的水稻植株體內(nèi)的總氨基酸含量較健康植株提高了31.13%，可溶性糖含量幾乎是健康植株的3倍。而西葫蘆感染黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，CMV)后，韌皮部和葉片的糖分、氨基酸比例均顯著下降，從而降低蚜蟲的種群適應(yīng)性[8-9]；張澤龍等[10]研究表明，黃瓜被瓜類褪綠黃化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV)侵染后葉片中防御物質(zhì)總酚、單寧的含量降低，同時可溶性糖和游離氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量也顯著降低。

目前已開展了不少關(guān)于病毒感染對寄主植株的影響研究，但關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻感染病毒的影響研究鮮有報道。因此，本研究以白背飛虱傳播的SRBSDV及轉(zhuǎn)基因水稻(MH63、T1C-19、T2A-1)為研究對象，考察病毒對不同品種轉(zhuǎn)基因水稻株高、可溶性糖、碳氮含量、氨基酸含量等物質(zhì)的影響，從而為病毒對同一生境的昆蟲產(chǎn)生定位寄主趨向和取食趨向的原因提供例證，同時為闡明農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的植物病毒傳播發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種：Bt水稻品系T1C-19(含cry1C基因)、T2A-1(含cry2A基因)和常規(guī)對照水稻品種明恢63(MH63)均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 方法

1.2.1 SRBSDV病株的獲得

將無毒白背飛虱低齡若蟲置于墊有濕濾紙的燒杯中，饑餓2 h后轉(zhuǎn)移至SRBSDV病株上進(jìn)行飼毒2～3 d，后轉(zhuǎn)移至健康水稻苗上飼養(yǎng)以度過循回期，最后把攜帶SRBSDV的白背飛虱分別接到2葉1心期的T1C-19(含cry1C基因)、T2A-1(含cry2A基因)和常規(guī)對照水稻品種明恢63(MH63)上，進(jìn)行接毒，檢測后供試驗用。

1.2.2 水稻株高

分別選T1C-19、T2A-1、MH63的正常水稻植株和感SRBSDV病株，每處理隨機(jī)取15株，從根部起依次測量水稻植株地上部分的自然高度。

1.2.3 可溶性糖含量測定

經(jīng)溫度處理后的水稻葉片烘干，用粉碎機(jī)粉碎均勻后待測。稱取烘干磨碎的樣品0.05 g，置于離心管中，加入1 mL 80%乙醇，85 ℃下保溫水浴30 min，然后3 000 r·min-1離心5 min，將上清液倒入大試管中，將殘渣反復(fù)提取2次，所有上清并入試管，加活性炭吸附色素，之后過濾定容待測。采用蒽酮比色法，取稀釋后糖提取液20 μL，加入700 μL蒽酮試劑，立即搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確加熱10 min，迅速冷卻至室溫，然后放置于暗處10 min后，取200 μL于酶標(biāo)板中測D630值。

1.2.4 碳氮含量測定

經(jīng)溫度處理后的水稻葉片烘干，用粉碎機(jī)粉碎均勻后，用EURO元素分析儀測定碳氮含量。

1.2.5 稻株氨基酸含量測定

分別取SRBSDV病株和健康稻株的葉鞘，于110 ℃殺青1 h后，60 ℃烘干至恒重。稱取1 g磨成粉末，加0.1%的HCl定容至25 mL，充分溶解后過濾。取2 mL上清液加4 mL 0.1% TFA溶液快速搖勻，用SEP-PAK 柱純化后在Sykam S433D氨基酸分析儀上測定氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用t檢驗進(jìn)行差異顯著性檢驗，描述性統(tǒng)計值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著水平設(shè)置為ɑ=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻株高的影響

由表1可知，MH63、T1C-19、T2A-1水稻植株感染SRBSDV 后株高分別為107.33、98.83、109.83 cm，均顯著低于正常水稻植株。

表1 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻株高的影響Table 1 Effect of SRBSDV-infected plants on plant height of transgenic rice

2.2 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株可溶性糖含量的影響

正常水稻植株可溶性糖含量分別為2.10%、2.12%、1.89%，而轉(zhuǎn)基因水稻MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后可溶性糖含量分別為1.90%、2.09%、2.19%(表2)，與正常水稻可溶性糖含量均無顯著性差異。

表2 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株可溶性糖含量的影響Table 2 Effect of SRBSDV-infected plants on soluble sugar contents of transgenic rice

2.3 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株碳氮含量的影響

由表3可知，不同水稻品種感染SRBSDV后對水稻碳氮含量的影響是不同的。正常MH63水稻感染SRBSDV后氮含量顯著提高，碳含量無顯著性差異；T2A-1水稻感染SRBSDV后氮含量降低，碳含量顯著提高；TIC-19水稻感染SRBSDV后氮含量顯著提高，碳含量略有提高。

表3 SRBSDV對水稻植株碳氮含量的影響Table 3 Effects of SRBSDV-infected plants on carbon and nitrogen content of transgenic rice

2.4 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株氨基酸含量的影響

不同水稻品種感染SRBSDV后植株體內(nèi)氨基酸含量變化見表4～6。轉(zhuǎn)基因水稻MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后植株體內(nèi)各種氨基酸及總氨基酸含量均提高。

表4 MH63感染SRBSDV后植株內(nèi)氨基酸含量的變化Table 4 Changes in amino acid contents in SRBSDV-infected rice plants of MH63

MH63感染SRBSDV后其體內(nèi)天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸含量分別增加了0.46百分點、0.15百分點、0.17百分點、0.40百分點、0.13百分點、0.12百分點、0.15百分點、0.06百分點、0.16百分點、0.15百分點、0.18百分點、0.17百分點，總氨基酸含量提高了2.80百分點，均高于正常水稻植株的各種氨基酸含量及總氨基酸含量(表4)。

T1C-19感染SRBSDV后除蛋氨酸含量略微下降，其他15種氨基酸含量均有提高，且除脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸與正常水稻植株含量無顯著差異，其他12種氨基酸含量均顯著高于正常水稻植株(P<0.05)，總氨基酸含量較正常植株提高了0.84百分點，也顯著高于正常水稻植株氨基酸含量(P<0.05)(表5)。

表5 T1C-19感染SRBSDV后植株內(nèi)氨基酸含量的變化Table 5 Changes in amino acid contents in SRBSDV-infected rice plants of T1C-19

T2A-1感染SRBSDV后天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、總氨基酸含量均顯著高于正常水稻植株氨基酸含量(P<0.05)，其他氨基酸含量與正常水稻植株氨基酸含量均無顯著性差異(表6)。

表6 T2A-1感染SRBSDV后植株內(nèi)氨基酸含量的變化Table 6 Changes in amino acid contents in SRBSDV-infected rice plants of T2A-1

3 討論

寄主與病毒的侵染是一個相互競爭的過程，植物利用細(xì)胞壁的物理屏障、RNA干擾等多種方式抵御病毒的侵入，相反，病毒則借助機(jī)械損傷或媒介昆蟲完成侵染，且經(jīng)過病毒原質(zhì)體、裝配病毒粒子和編碼沉默抑制子的形成來確保病毒 RNA不被寄主降解。因此，病毒的生命活動過程，通常與宿主蛋白相互作用，從而直接或間接導(dǎo)致易感寄主產(chǎn)生癥狀[11]。如貝殼杉烯氧化酶與RDV互作，抑制 GA 的合成，導(dǎo)致水稻產(chǎn)生矮縮癥狀[12]，生長素調(diào)節(jié)因子(PAP1)與TMV RdRp 互作干擾生長素的合成，使植株產(chǎn)生矮化的癥狀[13]。本研究結(jié)果與前人研究一致，試驗結(jié)果表明，MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后植株高度顯著下降，呈明顯矮縮狀。另外，病毒還使植株呈花葉、皺縮等癥狀，影響作物光合作用，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[14]。

游離氨基酸、可溶性糖是植物體內(nèi)基礎(chǔ)的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而影響媒介昆蟲的生長發(fā)育和生殖能力等生物學(xué)特性[15]。已有研究表明，當(dāng)植物遭受病原物的侵染時，會誘導(dǎo)體內(nèi)可溶性糖、氨基酸以及碳水化合物含量的變化，其中氨基酸含量的變化會直接影響到植食性昆蟲的取食[16-18]。本研究結(jié)果表明，MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV 后可溶性糖含量與正常水稻無顯著性差異。與丁天波等[19]的研究結(jié)果一致，該研究表明番茄感染ToCV后總糖含量與正常植株無顯著性差異。而閆慧娟等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，感病品種的三葉期玉米植株接種矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus，MDMV)后，葉片可溶性糖含量下降。陳茜等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CMV侵染的煙草葉片中總糖含量較健康煙草略有降低。筆者早期研究發(fā)現(xiàn)，水稻嘉優(yōu)8號在感染RBSDV后植株體內(nèi)的可溶性糖含量則是正常稻株的3倍[22]，與本試驗的結(jié)論均不一致。所以筆者推測可能是由于水稻品種、病毒種類不同等原因造成的。

病毒侵染寄主后也會對寄主植物的碳氮代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致媒介昆蟲生物學(xué)特性的改變。如大豆花葉病毒(SMV)侵染大豆后，病毒明顯地抑制寄主碳水化合物代謝，促進(jìn)寄主氮化物的代謝，從而有利于病毒的復(fù)制和增殖[23]。本試驗的研究結(jié)果表明，不同品種的轉(zhuǎn)基因水稻感染SRBSDV后碳氮含量影響不一致，MH63、T1C-19感染SRBSDV后水稻植株的氮含量顯著提高，T2A-1水稻感染SRBSDV后碳含量則顯著提高(P<0.05)。

丁天波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，感染ToMV的番茄植株與正常植株總氨基酸及游離氨基酸含量均未達(dá)到顯著性差異。而陳茜等[24]研究發(fā)現(xiàn)，CMV侵染的葉片中游離氨基酸的含量顯著升高[21]，PVY 的侵染導(dǎo)致煙草體內(nèi)氨基酸含量增加。本研究發(fā)現(xiàn) MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后植株體內(nèi)各種氨基酸及總氨基酸含量均提高。這與楊熙彬等[25]、何嘵嬋等[22]的研究一致。因此，可以推斷病毒侵染誘導(dǎo)植株營養(yǎng)物質(zhì)的變化趨勢是多樣的，不同傳播方式的病毒，其介體獲毒所需的時間、持毒和傳毒時間均不相同，因此，病毒通過改變寄主植物的營養(yǎng)物質(zhì)、次生物質(zhì)等來調(diào)整介體昆蟲的“去留”以最大限度地把病毒傳播下去。