ODC1基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞PC-3 LncRNA表達(dá)影響的初步觀察與分析

宋尖卓, 馬 健, 陳 鵬

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿科, 烏魯木齊 830011)

轉(zhuǎn)錄因子鳥氨酸脫羧酶1(ODC1)是多胺生物合成中的限速酶,通過將鳥氨酸脫羧轉(zhuǎn)化為腐胺,有助于生產(chǎn)多胺(包括腐胺、亞精胺、精胺等)[1]。多胺是活細(xì)胞的關(guān)鍵組成部分,在細(xì)胞增殖和凋亡、衰老和生殖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮多種作用[2]。ODC1在多種腫瘤的增生性組織中表達(dá)上調(diào),在轉(zhuǎn)錄因子MYC基因擴(kuò)增的腫瘤中發(fā)生失調(diào),例如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌[3-5]。已有研究表明,ODC1基因在前列腺癌中高表達(dá),并與臨床前列腺特異性抗原(PSA)表達(dá)水平相關(guān),癌腺體周圍良性上皮中ODC1的表達(dá)水平隨著PSA的增加呈對數(shù)降低,ODC1抑制劑可選擇性阻斷睪酮對前列腺腫瘤發(fā)展的促進(jìn)作用[6-8]。對ODC1影響調(diào)控前列腺癌的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索,本實(shí)驗(yàn)擬通過高通量測序等方法和生物信息數(shù)據(jù)分析,從其對中長鏈非編碼RNA(lncRNA)表達(dá)影響的角度進(jìn)行初步觀察和探索,以期為進(jìn)一步研究其作用及調(diào)控機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和線索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)(普諾賽公司)。試劑包括:Ham′s F-12K(Procell公司)、0.25%胰酶(Gibco公司)、lipofectamine max(Invitrogen公司)、DMSO(MP公司)、質(zhì)粒小提試劑盒(Omega公司)、胎牛血清(Gibco公司)等。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建細(xì)胞模型 實(shí)驗(yàn)組采用三種敲低序列降低實(shí)驗(yàn)誤差,分別采用siRNA ODC1-homo-1006(編號si-1)5′-GGUUGGUUUCAGCAUGUAUTT-3′(正義鏈)、5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(反義鏈), ODC1-homo-1156(編號si-2)5′-GCCCGGCAGAUACUAUGUUTT-3′(正義鏈)、5′- AACAUAGUAUCUGCCGGGCTT -3′(反義鏈),ODC1-homo-1440(編號si-3)5′-GCUGUGACCUGCCUG-AAAUTT-3′(正義鏈)、5′-AUUUCAGGCAGGUCACAGCTT-3′(反義鏈)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,得到基因敲低組Si-1、Si-2 和Si-3。對照組NC采用siRNA siNC 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(正義鏈)、5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(反義鏈)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)染siRNA用量為160 pmol/孔(12孔板)、Lipo 4 μL/孔、無血清培養(yǎng)基(μL/孔)50×2。轉(zhuǎn)染具體如下:(1)取160 pmol轉(zhuǎn)染量siRNA,加入50×2 μL稀釋體積的無血清培養(yǎng)基,孵育5 min;(2)同時(shí)取4 μL LipofectamineTMmax Transfection Reagent,加入無血清培養(yǎng)基,孵育5 min;(3)將步驟(1)加入到步驟(2)中,孵育20 min;(4)將上述混合物均勻加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,置于5% CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h,隨后更換對應(yīng)的新鮮完全培養(yǎng)基,置于5% CO2,37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,收集樣品。NC組和Si組均生物學(xué)重復(fù)6次,對照組采用無關(guān)序列轉(zhuǎn)染篩選出NC-1、NC-2、NC-3,實(shí)驗(yàn)組采用上述三種敲低序列轉(zhuǎn)染篩選出Si 1-1、Si 1-2、Si 1-3,Si 2-1、Si 2-2、Si 2-3,Si 3-1、Si 3-2、Si 3-3。

1.2.2 驗(yàn)證細(xì)胞模型 Trizol法提取上述轉(zhuǎn)染48 h的樣品細(xì)胞RNA,利用引物Hum GAPDH 5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′(正義鏈)、5′-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3′(反義鏈)和引物ODC1 5′-CCGAAGTAGAGGAACAGGAT-3′(正義鏈)、5′-TTAATACTAGCCGAAGCACAG-3′(反義鏈),進(jìn)行qRT-PCR檢測分析不同樣本之間的相對表達(dá)量,檢測ODC1基因在mRNA水平上的表達(dá)量。WB檢測ODC1蛋白在敲低ODC1基因的PC-3細(xì)胞模型中的表達(dá)情況。取1 μg檢測合格的總RNA進(jìn)行RNA-seq文庫的制備。RNA-seq文庫制備后使用Illumina Novaseq 6000(武漢瑞興生物科技有限公司),采用PE150模式進(jìn)行高通量測序。在獲得原始序列之后,去掉測序中低質(zhì)量的片段。使用FastQC(版本0.9.5)對fastq格式的質(zhì)量過濾后片段進(jìn)行質(zhì)量檢測。然后,用TopHat2軟件把經(jīng)過篩選的序列比對到人GRCH38基因組上面,容許不超過4個(gè)堿基錯(cuò)配。刪除能夠與多個(gè)基因組位置匹配的序列,僅保留具有唯一基因組位置的序列,進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)處理與生信分析 采用SPSS18.0軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),各組之間差異采用單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)組和對照組中l(wèi)ncRNA表達(dá)量變化采用Fisher檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用目前應(yīng)用最廣泛的編碼潛能分析方法(CPC分析、CNCI分析、CPAT分析、LGC分析)對候選lncRNA進(jìn)行判定篩選,使用DESeq2軟件對篩選基因進(jìn)行差異表達(dá)分析,然后估計(jì)基因離散度,再擬合負(fù)二項(xiàng)分布模型,采用Wald或似然比假設(shè)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)變化的絕對比值fold change(FC≥2 or ≤1/2)和假設(shè)幾率(P<0.05),篩選出表達(dá)顯著上調(diào)基因和表達(dá)顯著下調(diào)基因,作圖分析軟件采用Cluster3.0。對所有差異表達(dá)的lncRNA和所有差異表達(dá)的基因進(jìn)行共表達(dá)分析,同時(shí)計(jì)算差異表達(dá)的lncRNA表達(dá)基因之間的皮爾森相關(guān)系數(shù),篩選滿足相關(guān)系數(shù)絕對值>0.6且P<0.01的關(guān)系對。得到差異基因后,分析lncRNA順式作用靶標(biāo),再對靶標(biāo)進(jìn)行GO分類富集性分析和KEGG分析解析其功能。首先綜合GO和KEGG數(shù)據(jù)庫資源向各個(gè)通路映射,統(tǒng)計(jì)每個(gè)通路中的基因數(shù),然后用超幾何分布檢驗(yàn),以全基因組的GO和KEGG注釋情況為背景,得到待分析基因顯著富集的通路。最終展示排名前十的通路。

1.2.4 基因驗(yàn)證 qRT-PCR檢測驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)中各樣本lncRNA的表達(dá)量改變。針對基因序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)INC00973-F 5′-GGCTTCATCAATAAGGTATTCC-3′、LINC00973-R 5′-GAATAATTGTCCTTGCCTCAGA-3′。TERC-F 5′-CTAGAATGAA-CGGTGGAAGGC-3′、TERC-R 5′-TAACTGAGA-AGGGCGTAGGC-3′。LINC00638-F 5′- GACCC-GTCCCTTTGAGGAT-3′、LINC00638-R 5′-AGCGA-GGATGGTGTCTGAG-3′。具體采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R323-01,諾唯贊,中國),在thermocycle儀器(T100,Bio-Rad,USA)上進(jìn)行cDNA合成,反轉(zhuǎn)錄條件為42℃,5 min,37℃,15 min,85℃,5 s。然后,在ABI QuantStudio 5儀器上進(jìn)行q-PCR反應(yīng),設(shè)置的程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火延伸1 min,變性和延伸執(zhí)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。接下來計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄本mRNA的相對表達(dá)量,使用GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,采用2- ΔΔCT方法進(jìn)行分析[9]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞模型構(gòu)建及ODC1基因敲低后lncRNAs差異分析

2.1.1 qRT-PCR結(jié)果 NC組mRNA表達(dá)量分別為1、0.793、1.03。實(shí)驗(yàn)組Si-1組mRNA表達(dá)量分別為0.112、0.113、0.123。實(shí)驗(yàn)組Si-2組mRNA表達(dá)量分別為0.079、0.106、0.124。實(shí)驗(yàn)組Si-3組mRNA表達(dá)量為0.112、0.112、0.13。各組取平均值后mRNA表達(dá)量分別為NC組0.941,Si-1組0.116,Si-2組0.103,Si-3組0.118。與NC組相比,Si組mRNA表達(dá)水平顯著降低。WB結(jié)果顯示,ODC1分子量為51 KDa,實(shí)際檢測分子量為50 KDa,在70 KDa存在很亮的雜帶;從WB圖條帶來看,NC組與Si組相比,NC組有條帶,Si組無條帶,敲低效率較高,見圖1。從mRNA和蛋白水平提示PC3敲低ODC1成功。

圖1 ODC1在實(shí)驗(yàn)組和對照組中的表達(dá)

2.1.2 lncRNA預(yù)測 對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分組,使用StringTie對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝并預(yù)測轉(zhuǎn)錄本,CPC、CNCI、CPAT、LGC這4種分析方法取交集后篩選的新預(yù)測lncRNA有341個(gè),結(jié)果見圖2。

注： 藍(lán)色部分表示采用編碼潛能分析方法CNCI篩選出的lncRNA數(shù)量;黃色表示采用CPC分析方法篩選出的lncRNA數(shù)量;紫色表示采用LGC分析方法篩選出的lncRNA;綠色表示采用CPAT分析方法篩選出的lncRNA。圓圈重疊的部分表示2種及2種以上分析方法篩選出的共有的非編碼RNA數(shù)量。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞間lncRNA差異分析 采用標(biāo)準(zhǔn)DElncRNA比較不同樣本,獲得差異表達(dá)lncRNA。實(shí)驗(yàn)組顯著上調(diào)表達(dá)lncRNA有154個(gè),前10的有LINC00638、LINC00871、LINC02714、LINC00992、LINC01252、LINC00461、LINC01238、LINC01812、LINC01844、LINC00957等。下調(diào)表達(dá)的lncRNA有128個(gè),前10的有TERC、LINC00973、LINC00592、LINC02454、LINC01444、LINC00997、LINC02085、LINC01089、LINC01285、LINC02029;差異lncRNA聚類分析揭示實(shí)驗(yàn)組與對照組對比鮮明,樣本一致性好,見圖3、4。

圖3 lncRNA差異分析火山圖

圖4 差異表達(dá)lncRNA熱圖

2.1.4 lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)分析 在反式調(diào)控的關(guān)系對中將co-location的閾值設(shè)定為lncRNA上下游100 kb,后續(xù)通過對co-location的lncRNA和mRNA之間計(jì)算皮爾森相關(guān)系數(shù)進(jìn)行共表達(dá)(co-expression)分析,篩選滿足相關(guān)系數(shù)絕對值>0.6且P<0.01的lncRNA-target關(guān)系對,再對co-location和co-expression兩個(gè)數(shù)據(jù)集取交集,得到lncRNA的順式作用靶標(biāo)。lncRNA與所有表達(dá)基因的共表達(dá)順式調(diào)控靶標(biāo)數(shù)目789個(gè),差異lncRNA與所有表達(dá)基因的順式調(diào)控靶標(biāo)數(shù)目為142個(gè),差異lncRNA與差異表達(dá)基因共表達(dá)的順式調(diào)控靶標(biāo)數(shù)目為38個(gè),結(jié)果見表1。

表1 lncRNA的順式作用靶標(biāo)數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

2.2 lncRNA靶標(biāo)GO和KEGG Pathway富集分析通過基因功能富集分析、生物學(xué)過程富集分析和KEGG基因通路富集分析,lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)基因參與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路(PI3K-Akt信號通路)、Ras等信號通路并與腫瘤血管生成、細(xì)胞群增殖和正調(diào)控細(xì)胞分裂等密切相關(guān)。如LINC00638、PRLR、NRAS、PDGFRB等參與PI3K-Akt信號通路及Ras信號通路;TERC、CDKN1A、CASP3、LINC00973等也與腫瘤信號通路相關(guān)。這些生物學(xué)功能表明lncRNA順式靶標(biāo)基因與腫瘤形成進(jìn)展等聯(lián)系密切,見圖5～7。

圖5 lncRNA靶標(biāo)GO功能(F)富集分析結(jié)果、基因功能及結(jié)合受體情況

圖6 lncRNA靶標(biāo)GO生物學(xué)過程(P)富集分析結(jié)果

圖7 lncRNA靶標(biāo)KEGG Pathway基因通路富集分析

2.3 驗(yàn)證GO和KEGG富集分析得到的功能lncRNA基因進(jìn)行LncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)GO和KEGG通路富集分析后,得到LncRNA LINC00973、TERC、LINC00638。

補(bǔ)充驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組Si-1、Si-2、Si-3中LINC00973和TERC的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1);與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組LINC00638表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。q-PCR結(jié)果顯示,LINC00973、TERC表達(dá)顯著下調(diào)、LINC00638表達(dá)顯著上調(diào),與GO和KEGG富集分析得到的lncRNA差異表達(dá)情況一致,見表3。

表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組中LINC00973、TERC和LINC00638表達(dá)的比較

表3 q-PCR結(jié)果展示

3 討論

ODC1基因在前列腺癌細(xì)胞中顯著高表達(dá),且與患者預(yù)后相關(guān)[6]。ODC1影響調(diào)控前列腺癌的機(jī)制可能與雄激素相關(guān)通路有關(guān),但詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索,本實(shí)驗(yàn)通過高通量測序方法探索ODC1基因?qū)χ虚L鏈非編碼RNA(lncRNA)表達(dá)的影響,以期從這一角度為研究其影響調(diào)控前列腺癌的機(jī)制提供一些可能的依據(jù)。我們在體外實(shí)驗(yàn)PC-3細(xì)胞中敲低ODC1后,觀察到眾多l(xiāng)ncRNAs基因隨之差異表達(dá),選擇部分文獻(xiàn)已有報(bào)道與腫瘤相關(guān)、特別是和前列腺癌相關(guān)的lncRNAs進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與LncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)GO和KEGG通路富集分析預(yù)期結(jié)果一致,提示從這一角度繼續(xù)深入研究是可行的。

lncRNAs不同于編碼蛋白基因,當(dāng)受到干擾時(shí),lncRNAs的錯(cuò)誤調(diào)控會導(dǎo)致基因組應(yīng)激[10],已有研究表明,lncRNAs與包括前列腺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證的lncRNA TERC、LINC00973、LINC00638,在既往的研究中發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用[13],本實(shí)驗(yàn)富集通路結(jié)果顯示,這三個(gè)lncRNA與多個(gè)腫瘤信號通路相關(guān)。TERC基因在端粒酶依賴的端粒延伸和維持中起著重要作用[13],文獻(xiàn)表明,TERC突變可以激活前列腺癌細(xì)胞LAPC4的端粒延長代替機(jī)制,并導(dǎo)致癌細(xì)胞繼續(xù)長期增殖[14]。有研究報(bào)道,LINC00973在結(jié)腸癌、腎透明細(xì)胞癌及非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)[15-17],它通過結(jié)合糖酵解關(guān)鍵酶LDHA(乳酸脫氫酶A)并增強(qiáng)酶活性,進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解,最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,敲低該RNA的表達(dá),能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[18],根據(jù)本研究結(jié)果可以推測,LINC00973的高表達(dá)也是通過加速了前列腺腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解過程,以此促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。還有研究顯示,非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)LINC00638,通過調(diào)控IRS1/磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號通路促進(jìn)腫瘤增殖、生長、遷移和侵襲,抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡,miR-541-3p可能是LINC00638的潛在靶點(diǎn)[19],在肝細(xì)胞癌中,LINC00638參與LINC00638/miR-4732-3p/ULBP1軸,通過PD-L1促進(jìn)肝細(xì)胞癌的免疫逃逸,導(dǎo)致肝細(xì)胞癌進(jìn)展[20],在前列腺癌中LINC00638是否也是參與PI3K/Akt信號通路而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展也需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

本實(shí)驗(yàn)只挑選了以上三個(gè)已知重要的lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證,可能對全面解釋調(diào)控機(jī)制來說不夠充分。另外,本實(shí)驗(yàn)是采用人前列腺癌PC-3細(xì)胞作為研究基礎(chǔ)的,后續(xù)我們還將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證ODC1高表達(dá)是否足以驅(qū)動(dòng)前列腺癌進(jìn)展。再者,lncRNA與其他物質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物是否參與調(diào)控后續(xù)生物學(xué)進(jìn)程,還需要進(jìn)一步通過諸如RNA pull-down、ChlRP、RIP、CHIP-s等技術(shù)對候選lncRNA的作用機(jī)制作進(jìn)一步研究,這也是我們后續(xù)深入研究的方向。

本次的研究結(jié)果提示了ODC1基因通過調(diào)控致癌lncRNAs參與前列腺癌的發(fā)生或進(jìn)展的新線索,及其作為治療干預(yù)靶點(diǎn)的潛在意義,為進(jìn)一步研究ODC1基因在前列腺癌中的作用及調(diào)控機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。