蕪菁多糖鐵配合物的合成工藝研究

阿曼妮薩·麥提如則, 吳美美, 王 鑫, 劉 瑾, 徐 茜, 海力茜·陶爾大洪

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院, 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830017)

新疆蕪菁(BrassicarapaL.)為十字花科屬種植物蕪菁的根莖,其主要化學(xué)成分為黃酮、多糖、生物堿、皂苷、揮發(fā)油等[1-2],具有抗衰老、抗輻射、預(yù)防心血管疾病的作用[3-4]。其中的多糖具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞等作用[5-7]。多糖鐵配合物(Polysaccharide-iron complex,PIC)是生物多糖與鐵離子通過三氯化鐵共熱法復(fù)合而成的一種多糖和鐵元素的配合物,用作補鐵劑時,不僅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、溶解性好、對胃腸道刺激性小,還具有鐵螯合能力強、生物利用度廣等優(yōu)點,補鐵的同時,還能起到促進(jìn)血液循環(huán)、降血糖、調(diào)節(jié)血壓等作用[8-9]。本研究采用蕪菁多糖與FeCl3共熱法建立BP-Fe(Ⅲ)配合物的最佳合成方法,測定鐵的含量,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥蕪菁干燥片(新疆艾力努爾有限公司);鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(北京嘉世玉禾化工技術(shù)研究院,083183);三氯化鐵(天津鑫伯特化工有限公司,20221108);枸櫞酸鈉(天津永晟精細(xì)化有限公司,20140416);1.10-菲啰啉(天津天新精細(xì)化工開發(fā)中心,20191102);氯化羥胺(天津天新精細(xì)化工開發(fā)中心,20140102);乙酸鈉(天津鑫伯特化工有限公司,202200706);無水乙醇(天津鑫鉑特化工有限公司,20211208);硫氰酸鉀(成都科隆化學(xué)品有限公司,2017050101);氫氧化鈉(天津盛奧化學(xué)試劑有限公司,20160307);95%乙醇(天津凱通化學(xué)試劑有限公司,20221125);冰乙酸(天津富宇精細(xì)化工有限公司,20120911)。

1.2 儀器800T型多功能粉碎機(永康敏業(yè)工貿(mào)有限公司);AB135-8型分析天平(常州幸運電子設(shè)備有限公司);N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司);SHB-lll型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);BY111-0-100酒精計(河北省武強縣滏陽儀表廠);UV-2700型紫外分光光度計(島津儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 蕪菁多糖的提取與除蛋白方法

1.3.1 蕪菁粗多糖的提取方法 取脫脂后的蕪菁100 g,加水3 L,在90℃溫度條件下回流提取提取3次,每次120 min,將提取液濃縮,加入無水乙醇至濃度為 80%(v/v),在4℃條件下放置12 h。抽濾溶液,將沉淀室溫下晾干后,用蒸餾水復(fù)溶,將溶液倒入7 000 Da分子量的透析袋,透析完畢后將袋內(nèi)溶液凍干,即得蕪菁粗多糖。

1.3.2 蕪菁粗多糖的除蛋白方法 采用AB-8大孔吸附樹脂濕法裝柱(柱床體積700 mL),吸取“1.3.1”項下蕪菁粗多糖上清液緩慢上樣,靜態(tài)吸附15 min,控制流速,收集流出液。用7 000 Da的透析袋透析,濃縮,冷凍干燥,即得到蕪菁多糖。

1.4 BP-Fe(Ⅲ)配合物的合成方法取“1.3.2”項下蕪菁多糖0.2 g和枸櫞酸鈉0.1 g于燒杯中,加入50 mL蒸餾水溶解,加入2 mol/L FeCl3溶液和20%的NaOH溶液,使溶液pH值為8,觀察反應(yīng)液,當(dāng)反應(yīng)液中生成的沉淀不再溶解時停止加FeCl3溶液和NaOH溶液,繼續(xù)反應(yīng)2 h。待反應(yīng)完全后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到離心管中,8 000 r/min離心25 min,棄去沉淀,將上清液用3倍體積的無水乙醇醇沉,在4℃條件下放置12 h。將醇沉混懸液至于離心管中,8 000 r/min離心5 min,棄去上清液,將沉淀物用無水乙醇洗滌,8 000 r/min離心3次,每次5 min。取出沉淀自然干燥,即得到BP-Fe(Ⅲ)配合物。用適量蒸餾水溶解BP-Fe(Ⅲ)配合物,充分溶解后,將所得溶液置于透析袋中除鹽,濃縮后冷凍干燥,即得BP-Fe(Ⅲ)配合物。

1.5 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成單因素實驗設(shè)計考察不同時間、溫度、反應(yīng)液pH值、枸櫞酸鈉和蕪菁多糖質(zhì)量比(m1/m2)對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響,單因素實驗設(shè)計見表1。

表1 單因素實驗設(shè)計表

1.6 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成工藝的正交實驗設(shè)計根據(jù)“1.5”項下所得結(jié)果,對BP-Fe(Ⅲ)配合物的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化,正交實驗設(shè)計見表2。

表2 L9(34)正交實驗因素水平表

1.7 BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的測定吸取0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(10 μg/mL)至50 mL容量瓶中,分別加入1.0 mL 10%氯化羥胺溶液,混合均勻,放置5min后,加入0.15%1.10-菲啰啉2.0 mL,1.0 mol/L的乙酸鈉溶液5.0 mL ,加蒸餾水定容至刻度,混勻,靜置顯色20 min,測定510 nm處A值[10],以鐵的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=0.195 3X+0.000 7,R2=0.999 9。配制300 μg/mL的樣品溶液,從中移取5 mL,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行相同操作,將測得結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計算BP-Fe(Ⅲ)配合物中的鐵含量。鐵含量/%=MFeM多糖鐵×100%。

1.8 方法學(xué)考察

1.8.1 精密度實驗 量取“1.7”項下標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液5 mL按照“1.7”項下方法,連續(xù)測定510 nm處A值5次,計算RSD值。

1.8.2 穩(wěn)定性實驗 量取“1.7”項下供試品溶液5 mL按照“1.7”項下方法, 分別在0、 30、 60、 90、 120 min時在510 nm處A值,計算RSD值。

1.8.3 重現(xiàn)性實驗 將同一樣品溶液平行配置6份按“1.7”項下方法,測定510 nm處吸光度A值,計算RSD值。

1.8.4 加樣回收率實驗 取“1.7”項下樣品溶液(0.3 mg/mL)分別吸取9份溶液,每份0.2 mL,每3份1組,分別加鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01 mg/mL) 0.86、1.10、1.30 mL于3組溶液中,搖勻,加水至2.0 mL,按照“1.7”項下方法測定510 nm處的A值,計算RSD值。

1.9 鐵離子特征反應(yīng)分別配置10 mg/mL的BP-Fe(Ⅲ)配合物溶液和三氯化鐵溶液,分別取5 mL加1 mL 10%硫氰酸鉀,振蕩,觀察現(xiàn)象。

1.10 BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜測定采用溴化鉀壓片法,將干燥的BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖樣品分別與溴化鉀混合,磨粉壓片,在4 500～500 cm-1處掃描,掃描10次,測得BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜圖。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)pH值、時間、溫度和櫞酸鈉與多糖的質(zhì)量比對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當(dāng)反應(yīng)時間為2 h,反應(yīng)溫度為60℃,枸櫞酸鈉與多糖的質(zhì)量比為1∶2時,隨著pH增大,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量降低,當(dāng)pH為6時BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量最高為3.41%,見圖1。

圖1 pH值對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.2 反應(yīng)時間對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃,枸櫞酸鈉與多糖的質(zhì)量比為1∶2,pH值為8時,隨著反應(yīng)時間增長,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量降低,在1 h時BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量最大為1.6%,見圖2。

圖2 反應(yīng)時間對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.3 反應(yīng)溫度對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當(dāng)反應(yīng)時間為2 h,pH值為8,枸櫞酸鈉與多糖的質(zhì)量比為1∶2時,隨著反應(yīng)溫度升高,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量先升高后降低,當(dāng)溫度小于60℃時,隨溫度的升高BP-Fe(Ⅲ)配合物鐵含量逐漸升高,在60℃時鐵含量最高為3.89%。反應(yīng)溫度大于60℃時,鐵含量降低,見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.4 枸櫞酸鈉與多糖的質(zhì)量比對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當(dāng)反應(yīng)時間為2 h,pH值為8,反應(yīng)溫度為60℃時,隨著枸櫞酸鈉與多糖質(zhì)量比增加,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量升高,當(dāng)枸櫞酸鈉與多糖質(zhì)量比為2∶1時BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量最大為1.81%,見圖4。

圖4 枸櫞酸鈉與多糖的質(zhì)量比對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.5 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成正交實驗結(jié)果正交實驗結(jié)果顯示,影響B(tài)P-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量因素的順序為枸櫞酸鈉和蕪菁多糖質(zhì)量比(A)大于反應(yīng)液pH值(B)大于反應(yīng)時間(C)大于反應(yīng)溫度(D)。最優(yōu)合成工藝條件為A3B1C3D2,即枸櫞酸鈉和多糖質(zhì)量比2∶1,反應(yīng)時間3 h,反應(yīng)液pH=6,反應(yīng)溫度60℃為最佳工藝條件,見表3。

表3 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成正交實驗結(jié)果

2.6 方法學(xué)考察結(jié)果

2.6.1 精密度實驗 精密度實驗結(jié)果表明RSD為1.6%(n=6)<2.0%,表明儀器精密度良好,見表4。

表4 精密度實驗

2.6.2 穩(wěn)定性實驗 穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明RSD為1.8%(n=5)<2.0%,表明方法穩(wěn)定性良好,見表5。

表5 穩(wěn)定性實驗

2.6.3 重現(xiàn)性實驗 重現(xiàn)性試驗結(jié)果表明RSD為0.9%(n=6)<2.0%,表明方法重現(xiàn)性良好,見表6。

表6 重復(fù)性實驗

2.6.4 加樣回收率實驗 平均回收率為88.3%～104.7%,RSD在0.4%～1.4%之間,表明方法準(zhǔn)確可行,見表7。

表7 加樣回收率實驗

2.7 鐵離子特征反應(yīng)結(jié)果三氯化鐵溶液與硫氰酸鉀反應(yīng),顏色由黃色變?yōu)榘导t色;蕪菁多糖鐵溶液加入硫氰酸鉀之后沒有顏色變化,說明配合物中游離的Fe3+濃度很低,不能與硫氰酸鉀反應(yīng)生成有顏色的配合物,蕪菁多糖與鐵絡(luò)合成穩(wěn)定的配合物。鐵離子特征反應(yīng)結(jié)果見圖5。

(A:顯色反應(yīng)前;B:顯色反應(yīng)后)

2.8 BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜圖分析BP-Fe(Ⅲ)配合物主要基團特征吸收峰與蕪菁多糖相似,BP-Fe(Ⅲ)配合物在3 400～3 300 cm-1附近的羥基特征吸收峰較蕪菁多糖寬,最大吸收峰由3 379 cm-1變?yōu)? 387 cm-1。說明蕪菁多糖與Fe3+形成穩(wěn)定配合物后,基本結(jié)構(gòu)無較大變化;在BP-Fe(Ⅲ)配合物合成過程中,反應(yīng)物蕪菁多糖結(jié)構(gòu)中的的羰基和羥基參與配合反應(yīng),鐵離子具有吸電子作用,可增大羰基極化程度,使羰基振動偶極矩變大,可見1 620 cm-1處羰基伸縮振動強度增加,推斷BP-Fe(Ⅲ)中存在與FeOOH相似的結(jié)構(gòu),見圖6。

圖6 BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜圖

3 討論

缺鐵性貧血(Iron deficiency anemia,IDA)為營養(yǎng)缺乏性疾病,病因多為患者長期處于鐵攝入不足或患者自身鐵成分丟失過快,不足以為紅細(xì)胞提供所需鐵成分的狀態(tài),進(jìn)而引起的貧血癥狀[11]。目前臨床上主要應(yīng)用硫酸亞鐵、右旋糖酐鐵等口服補鐵劑進(jìn)行治療,但其穩(wěn)定性較差、不易吸收,并且容易引起惡心、便秘、胃腸道不適等不良反應(yīng)[12]。PIC作為新型補鐵劑,具有安全性高、不良反應(yīng)少、鐵元素更易于被人體吸收等優(yōu)勢,成為國內(nèi)外新型補鐵劑研究的熱點[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)制備多糖鐵的方法以FeCl3法、硫酸鐵銨法及模擬生物礦化法為主,其中FeCl3法工藝相對成熟,制作的周期短、產(chǎn)物的鐵含量高,成本低已成為現(xiàn)今制備多糖鐵的主要方法[15]。蕪菁作為一種藥食同源植物,栽培歷史悠久,產(chǎn)量較高、品質(zhì)優(yōu)良,耐儲藏,供應(yīng)時間長,多糖含量高,以蕪菁為原料制備多糖鐵配合物具有原料來源廣的特點[16]。

本實驗用FeCl3法,與蕪菁多糖合成BP-Fe(Ⅲ)配合物,通過正交實驗優(yōu)化得到最優(yōu)合成工藝,為開發(fā)新型口服補鐵劑提供參考。