肌骨共生相關(guān)信號(hào)通路研究進(jìn)展

劉晏?hào)|，鄧 強(qiáng)，張彥軍，李中鋒，彭冉東，郭鐵峰，王雨榕，陳 博

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730030 2甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病。而肌少癥(sarcopenia，SP)是以進(jìn)行性全身肌量減少和功能減退為主要特征的綜合征，可導(dǎo)致患者身體殘疾、生活質(zhì)量下降及死亡等不良后果?；诙吖餐牟±砩頇C(jī)制及密切相關(guān)性，逐漸衍生出“肌少-骨質(zhì)疏松癥(osteosarcopenia，OS)”這一概念，以描述肌肉與骨骼同時(shí)發(fā)生衰減的現(xiàn)象[1]。肌肉與骨骼在位置上毗鄰，既可互相釋放機(jī)械信號(hào)以協(xié)調(diào)骨密度和肌質(zhì)量，又可分泌如肌抑素、鳶尾素、骨鈣素和骨保護(hù)素等生化因子相互調(diào)節(jié)[2]，信號(hào)通路作為肌肉與骨骼之間重要的信號(hào)傳遞途徑，如發(fā)生異常，則會(huì)導(dǎo)致OS的發(fā)生[3]。因此，本文就Hedgehog(Hh)、Hippo、mTOR和MAPK等成骨與成肌相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行綜述，以期為OS的靶向治療提供新思路。

1 Hh信號(hào)通路

Hh信號(hào)通路是一種高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要由Hh配體、貼片受體(patched，Ptch)、平滑受體(smoothened receptor，Smo)、融合抑制因子(suppressor of fused homolog，Sufu)和轉(zhuǎn)錄因子(glioma-associated oncogene homolog，Gli)構(gòu)成[4]。

1.1 成肌方面

Hh信號(hào)通路是肌肉早期發(fā)育必需的通路之一，且靶向不同的肌纖維群。Hayes等[5]通過使用環(huán)巴胺阻斷Hh信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)被阻斷Hh信號(hào)傳導(dǎo)的快速肌肉細(xì)胞在胚胎中停止生長(zhǎng)，說明Hh信號(hào)通路對(duì)正常肌球蛋白鏈的表達(dá)至關(guān)重要，此外，Hh信號(hào)通路傳導(dǎo)和層粘連蛋白γa1能夠維持肌球蛋白MF20和F310的正常表達(dá)，在肌纖維生長(zhǎng)過程中協(xié)同作用，二者同時(shí)缺乏則會(huì)引起胚胎中肌肉分化異常。Shh(Sonic hedgehog)是Hh家族成員之一，可與Wnt通路共同參與成肌過程，包括肌源性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)、肌譜系細(xì)胞發(fā)育、存活和增殖以及肌纖維類型的選擇[6]。但目前尚無針對(duì)兩條信號(hào)通路之間相互作用的機(jī)制研究。Hamilton等[7]研究發(fā)現(xiàn)，成人骨骼肌再生期間Shh表達(dá)上調(diào)，其受體和靶基因Ptc1在再生肌肉中顯著增多；若Shh表達(dá)受抑制，則會(huì)影響肌源性調(diào)節(jié)因子 Myf-5 和 MyoD 的活化，降低胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)表達(dá)水平和衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量，最終導(dǎo)致肌肉萎縮。此外，Vicario等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Shh與MAPK/ERK和PI3K/AKT通路的協(xié)同作用對(duì)肌肉細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，并以類似于IGF-1的方式影響這些途徑。Hh信號(hào)通路可促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)，但由于相關(guān)研究有限，激活Hh信號(hào)通路尚存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hh信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控并非易事。

1.2 成骨方面

Hh信號(hào)通路在成骨方面同樣具有重要作用。首先，Hh信號(hào)通路可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化。Ohba等[9]研究發(fā)現(xiàn)，重組N末端Shh(shhN)可促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨分化，增強(qiáng)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、成骨相關(guān)基因表達(dá)和基質(zhì)礦化。Hou等[10]研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可通過激活Hh信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T1-E1的增殖和分化，并抑制由血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，Hh信號(hào)通路在骨發(fā)育和骨修復(fù)過程中可與其他信號(hào)級(jí)聯(lián)(Wnt、BMP和PTHrP)協(xié)同起效，但具體機(jī)制目前尚不明確。Zhang等[11]通過敲除小鼠體內(nèi)Osx-Cre靶向的骨祖細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中Smo(Hh通路的關(guān)鍵分子)以滅活Hh信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)，小鼠的骨形成減少，骨髓脂肪增多，且Hh信號(hào)通路可通過上調(diào)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞的分化。在干預(yù)方面，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)作為成骨細(xì)胞分化的啟動(dòng)因子，可在成骨細(xì)胞分化過程中增強(qiáng)ALP活性和Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ protein，COL1)表達(dá)，并上調(diào)Shh表達(dá)水平[12]。辛伐他汀可增強(qiáng)成骨分化能力，Hh信號(hào)通路也參與辛伐他汀誘導(dǎo)的BMSCs骨分化過程，表現(xiàn)為COL1、ALP和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的表達(dá)上調(diào)以及ALP活性增加[13]。此外，多種miRNA也參與由Hh信號(hào)通路介導(dǎo)的成骨過程，例如，miR-342-3p已被確定為OP治療劑，可通過下調(diào)Sufu以激活Shh信號(hào)加速人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)的成骨分化[14]。這些研究表明Hh信號(hào)通路主要通過介導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖，然而尚無明確證據(jù)顯示Hh通路對(duì)破骨細(xì)胞具有抑制作用。

2 Hippo信號(hào)通路

Hippo信號(hào)通路是一種進(jìn)化信號(hào)通路，主要由STE20樣激酶(mammalian sterile20-like kinase，MST)1/2、腫瘤抑制因子(serine/threonine protein kinase，LATS)1/2、重組人WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白 (recombin-ant human WW domain-binding protein，WBP)1、MOB激酶激活劑(recombinant human MOB kinase activator，MOBA)1、Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein，Yap)、具有PDZ結(jié)合基序轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)以及TEA結(jié)構(gòu)域(TEA domain family member，TEAD)家族成員組成[15]。

2.1 成肌方面

雖然已在體內(nèi)外肌源性細(xì)胞中鑒定出多種Hippo成分，但其在肌肉質(zhì)量調(diào)節(jié)中的作用研究較少。但可以明確的是，Hippo信號(hào)通路在肌源性細(xì)胞及衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化及死亡等不同生物過程中發(fā)揮重要作用。阮凌等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠C2C12細(xì)胞增殖過程中，Yap Ser127磷酸化較低且Yap定位于細(xì)胞核，而在細(xì)胞分化后，Yap Ser127磷酸化增加約20倍并由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)。這說明Hippo信號(hào)通路的核心效應(yīng)因子Yap的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)在肌源性細(xì)胞增殖期間上調(diào)，在其分化期間下降。Setiawan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Yap活性增加可促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞活化并擴(kuò)大衛(wèi)星細(xì)胞衍生的成肌細(xì)胞池，也可與TEAD共同激活成肌細(xì)胞中的肌特異性胞苷-腺苷-胸苷元素以促進(jìn)肌肉再生。此外，TAZ對(duì)骨骼肌的促進(jìn)功能雖弱于Yap，但其可通過刺激蛋白質(zhì)合成來預(yù)防藥物導(dǎo)致的肌肉萎縮。除單獨(dú)作用外，Hippo信號(hào)通路還可與其他信號(hào)通路協(xié)同作用調(diào)節(jié)骨骼肌質(zhì)量，包括TGF-β途徑、Wnt途徑、Sonic-Hedgehog途徑及Akt-mTOR途徑[18]。這表明Hippo信號(hào)通路在體外肌肉生成及體內(nèi)肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，未來可針對(duì)如何實(shí)現(xiàn)Hippo信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控及調(diào)控程度開展進(jìn)一步研究。

2.2 成骨方面

Yap/TAZ作為Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和抑制破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)。但Yap/TAZ在破骨細(xì)胞中的作用尚未明確。Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Yap/TAZ敲除小鼠破骨細(xì)胞過度增殖會(huì)加速骨量減少。另有研究表明，敲除Yap和TAZ的轉(zhuǎn)基因小鼠由于成骨細(xì)胞形成減少以及破骨細(xì)胞數(shù)量增加導(dǎo)致OP[20]。這說明Hippo信號(hào)通路可抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活動(dòng)，相反，若Hippo信號(hào)通路缺失可導(dǎo)致OP發(fā)生。而Hippo信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制可能是Yap/TAZ與TGF激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)結(jié)合后共同抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。Yap/TAZ在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化方面同樣具有重要作用，Zarka等[21]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中Yap/TAZ的高表達(dá)可增加骨量，而成骨細(xì)胞中的Yap/TAZ敲除則會(huì)導(dǎo)致OP發(fā)生。Yu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼干細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(peroxi-some proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)缺失小鼠會(huì)導(dǎo)致TAZ的表達(dá)水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致成骨細(xì)胞的數(shù)量和功能降低。此外，TAZ還可與Runx2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。而TAZ和細(xì)胞內(nèi)散亂蛋白(dishevelled，DVL)的相互作用可阻止酪蛋白激酶介導(dǎo)的DVL磷酸化對(duì)Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，源于BMSCs的外泌體可通過Hippo信號(hào)通路轉(zhuǎn)移miR-186以促進(jìn)去勢(shì)大鼠的成骨作用，這說明Hippo信號(hào)通路對(duì)雌激素也有一定的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，Hippo信號(hào)通路在成骨過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但Hippo信號(hào)通路在諸多類型的細(xì)胞中均有影響，因此可能會(huì)對(duì)其他細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生干擾。目前該通路信號(hào)傳導(dǎo)的具體機(jī)制仍不完善，從而限制了該通路在治療肌骨衰減中的應(yīng)用，后續(xù)仍有待進(jìn)一步研究。

3 mTOR信號(hào)通路

mTOR信號(hào)通路是一種合成代謝通路，可對(duì)肌骨再生發(fā)揮正向作用，mTOR擁有兩個(gè)不同的催化亞基，即mTORC1和mTORC2[24]。

3.1 成肌方面

肌肉生長(zhǎng)受多種因素調(diào)節(jié)，如機(jī)械負(fù)荷、營(yíng)養(yǎng)攝取等，而mTOR是肌細(xì)胞活力的主要調(diào)節(jié)因子，也是干預(yù)SP的希望靶標(biāo)。mTOR信號(hào)通路的活性常因內(nèi)源性和外源性因素的不同(如氧化還原平衡、營(yíng)養(yǎng)可用性、體力活動(dòng))而存在差異。而該通路的激活是通過分子反饋環(huán)實(shí)現(xiàn)的，該分子反饋環(huán)可阻斷mTORC1上AKT的激活，因此是肌肉生長(zhǎng)或蛋白質(zhì)合成的交叉點(diǎn)[25]。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶可能是肌細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵，可通過調(diào)節(jié)mTORC1和mTORC2影響肌纖維代謝、生長(zhǎng)和增殖。而激活PI3K-AKT-mTORC1軸可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并抑制蛋白分解，從而保持肌肉細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)肌肉再生[26]。此外，調(diào)節(jié)肌再生與神經(jīng)肌肉接頭的穩(wěn)定具有密切聯(lián)系，而mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)被抑制可觸發(fā)肌纖維去神經(jīng)支配，從而影響骨骼肌再生[27]。運(yùn)動(dòng)對(duì)Raptor(mTORC1重要的支架和調(diào)節(jié)蛋白)的調(diào)節(jié)研究表明，mTORC1可能在骨骼肌強(qiáng)烈收縮下控制蛋白質(zhì)合成[28]，因此運(yùn)動(dòng)可作為促進(jìn)成肌的重要方式。葡萄糖和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)素能夠通過mTOR通路激活肌蛋白并促進(jìn)其合成。但在老年人中，肌纖維組成會(huì)向慢肌纖維轉(zhuǎn)變，快肌纖維中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter type 4，GLUT4)表達(dá)也會(huì)相應(yīng)減少，同時(shí)肌肉在胰島素刺激下利用葡萄糖的能力降低[29]，這說明通過補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)素可有效逆轉(zhuǎn)SP。綜上，mTOR通路對(duì)于促進(jìn)肌再生具有重要作用，但過度活化和持續(xù)高活性可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，通過這一機(jī)制靶向治療SP時(shí)，需謹(jǐn)慎平衡其激活程度。

3.2 成骨方面

mTOR途徑在調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)可抑制小鼠BMSCs的成骨分化。相反，IGF-1可通過激活mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)以刺激BMSCs向成骨細(xì)胞分化[30]。骨形成信號(hào)Wnt配體(如Wnt3a和Wnt7b)可通過PI1K-AKT信號(hào)激活mTORC3。而抑制mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)則會(huì)阻止Wnt7b誘導(dǎo)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，表明Wnt7b可通過激活mTORC1促進(jìn)骨形成。此外，BMP2也可通過mTORC1依賴性機(jī)制誘導(dǎo)成骨發(fā)生[31]。這說明mTORC1已成為介導(dǎo)IGF-1、Wnt和BMP等骨合成因子的常見效應(yīng)物，而mTORC1的失調(diào)可能導(dǎo)致OP的發(fā)生。一項(xiàng)研究通過敲除小鼠Raptor使 mTORC1 失活，并通過敲除破骨細(xì)胞前體中含有LyzM-Cre的Tsc1以激活mTORC1，分別增加或降低了破骨細(xì)胞的數(shù)量[32]，說明mTORC1可通過直接作用于破骨細(xì)胞以抑制骨吸收。此外，mTORC1還可通過抑制NF-κB和NFATc1活性而抑制破骨細(xì)胞分化。因此，mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)可能通過直接和間接作用對(duì)破骨細(xì)胞譜系產(chǎn)生特異性影響，但對(duì)其具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究[33]。與mTORC1類似，mTORC2也可通過調(diào)節(jié)成骨或破骨細(xì)胞增殖與分化改善OP。除刺激成骨細(xì)胞分化中的相關(guān)因子外，成骨細(xì)胞前體中的mTORC2信號(hào)傳導(dǎo)還通過調(diào)節(jié)RANKL的表達(dá)間接促進(jìn)骨形成[32]。盡管mTOR信號(hào)通路在OP的治療中具有一定潛力，但也存在使用mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)劑的劑量與時(shí)機(jī)、靶向性、耐藥性、安全性等問題。未來研究需進(jìn)一步探索有效的藥物劑型和治療策略以解決上述問題，提高治療效果及安全性。

4 MAPKs信號(hào)通路

MAPKs信號(hào)通路在肌肉與骨骼相關(guān)細(xì)胞的生物過程中發(fā)揮重要作用。目前已鑒定出的3個(gè)MAPK家族成員分別為ERK1/2、P38 MAPK和c-Jun NH2末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。

4.1 成肌方面

MAPKs是骨骼肌中主要的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子，可響應(yīng)氧化反應(yīng)和機(jī)械應(yīng)力。有證據(jù)表明，部分刺激可通過MAPKs信號(hào)通路影響胰島素抵抗和蛋白質(zhì)分解代謝。運(yùn)動(dòng)是一種間歇性的細(xì)胞應(yīng)激形式，王嶼萌等[34]研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可激活大鼠骨骼肌中的ERK1/2、p38 MAPK和JNK通路以增加肌肉再生率。ERK1/2在動(dòng)物模型中可被柔性運(yùn)動(dòng)(阻力運(yùn)動(dòng)和耐力運(yùn)動(dòng))快速激活，在接受劇烈運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(如騎自行車、游泳等)的人體肌肉中也可被快速激活。作為MAPKs信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中獨(dú)立的信號(hào)組成部分，p38 MAPK由4個(gè)同分異構(gòu)體(p38α、 p38β、p38δ、P38γ)組成，主要在高強(qiáng)度肌肉收縮時(shí)被激活[35]。運(yùn)動(dòng)也會(huì)通過JNK途徑刺激信號(hào)傳導(dǎo)，且現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)JNK的磷酸化隨著肌肉收縮力的升高而呈線性增加[36]。綜上所述，3個(gè)MAPK信號(hào)模塊均由運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)，但激活機(jī)制又有所不同。此外，氧化應(yīng)激是SP的發(fā)病機(jī)制之一，骨骼肌中造成氧化應(yīng)激的成分主要是活性氧。IGF-1已被證明可以保護(hù)肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激影響而促進(jìn)肌細(xì)胞增殖、分化和存活。而這種保護(hù)效應(yīng)可能是通過PI3K-Akt和ERK1/2 MAPK途徑進(jìn)行的[37]。

4.2 成骨方面

MAPKs通常受輔助蛋白(如細(xì)胞支架和磷酸酶)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，這種特性使MAPKs通路能夠調(diào)控骨組織的代謝和重塑。典型的ERK-MAPK包括ERK1-MAPK3和ERK2-MAPK1兩種亞型，二者均在成骨細(xì)胞譜系中高表達(dá)。研究表明，ERK-MAPK通路在體內(nèi)外均可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，主要通過控制成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子(包括Runx2，ATF4和β-連環(huán)蛋白)的活性來完成[38]。MAPK p38α是RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，而p38抑制劑可通過調(diào)節(jié)MAPK p38α抑制破骨細(xì)胞增殖來保存骨量。張旭等[39]研究發(fā)現(xiàn)，p38受兩種上游MAPK激酶(MAP Kinase Kinase，MKK)調(diào)節(jié)，即MKK3和MKK6；且MKK3可體外調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，缺乏MKK3可使活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)的表達(dá)降低。此外，破骨細(xì)胞特異性基因蛋白酶K、相關(guān)受體和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-protein，MMP)9的表達(dá)均受MKK3的影響，說明MKK3可直接介導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖。而MKK6可能通過增加促炎因子的產(chǎn)生間接介導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)可通過調(diào)控成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化增加骨量。而PGE2受體激動(dòng)劑EP2A和EP4A主要通過激活p38 MAPK、ERK及JNK刺激內(nèi)源性PGE2生成。雖然MAPK通路可通過調(diào)控成骨和破骨細(xì)胞抗骨質(zhì)疏松，但該通路還參與其他生物學(xué)過程，因此藥物靶向該通路時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生副作用。

綜上所述，OS 是嚴(yán)重威脅中老年人身心健康的退行性疾病，目前臨床上防治該類疾病主要以O(shè)P為著力點(diǎn)，尚缺乏同時(shí)針對(duì)肌肉和骨骼的靶向治療方案。目前已知Hh、Hippo、mTOR和MAPK等多種信號(hào)通路同時(shí)作用于肌肉和骨骼，但其具體機(jī)制及相互作用仍缺乏深入認(rèn)識(shí)，不利于OS的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化。未來應(yīng)進(jìn)一步以潛在成肌成骨信號(hào)傳導(dǎo)為研究著力點(diǎn)，明確信號(hào)通路上下游效應(yīng)因子及其對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)的具體作用，為OS的靶向治療及藥物研發(fā)提供新思路。

作者貢獻(xiàn)：劉晏?hào)|、張彥軍負(fù)責(zé)論文撰寫；鄧強(qiáng)負(fù)責(zé)論文指導(dǎo)；李中鋒、彭冉東負(fù)責(zé)論文構(gòu)思；郭鐵峰、王雨榕、陳博負(fù)責(zé)論文修訂。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突