貯藏溫度對(duì)火棘鮮果采后生理及功效活性成分的影響

陳一龍，商桑，曾順德，曾小峰，刁源，尹旭敏，高倫江

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,重慶 401329）

火棘[Pyrɑcɑnthɑfortuneɑnɑ（mɑxim.）Li]為薔薇科蘋果亞科火棘屬常綠野生灌木,別名吉祥果、救兵糧、紅子、小紅果、紅姑娘、火把果和赤陽子等?；鸺瑢僦参镉?0 種,我國發(fā)現(xiàn)7 種,常見有4 種,主要分布在我國東南和西南部海拔500～2 800 m 的山地、丘陵地陽坡灌叢草地及河溝路旁,野生資源儲(chǔ)量極為豐富,僅重慶地區(qū)就達(dá)2 萬t 左右?；鸺麑?shí)性味干酸,具有健脾消積、生津止渴、清熱解毒、活血止血等功效,在營養(yǎng)保健食品、藥品、化妝品、日用品、盆景培植和生態(tài)等方面具有諸多作用,綜合利用價(jià)值高,是亟待開發(fā)和利用的野生植物資源[1]。火棘除含有原花青素、黃酮類、酚類、鞣酸類、萜類、生物堿類化合物等多種功效活性成分外,還包含多種微量元素、多種維生素、脂肪酸、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、膳食纖維、淀粉、多糖和果膠等營養(yǎng)成分[2],可開發(fā)火棘果粉[3]、飲料[4]、發(fā)酵火棘果汁[5]、果酒[6]、果醋[7]、果醬[8]等系列產(chǎn)品。已有研究人員對(duì)火棘功效成分如原花青素[9]、黃酮[10]、多酚[11]等的提取工藝和功效活性進(jìn)行較為系統(tǒng)地研究,發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化[10]、抗腫瘤[12-13]、預(yù)防肝臟疾病[14]、改善高血糖和腸道菌群失調(diào)[15]等功效。目前,火棘原料保藏已成為火棘加工企業(yè)短板?；鸺r果傳統(tǒng)高溫冷庫（0 ℃以上）貯藏只能起短期調(diào)劑作用,凍藏（-18 ℃）則運(yùn)行成本過高；干制則易造成火棘原有功效活性成分如原花青素、黃酮、總酚、VC等含量急劇下降,同時(shí)也給后續(xù)加工帶來困擾,如火棘籽油的提取就存在困難。本研究以重慶彭水野生火棘鮮果為試材,分別在-5、-3、-1、1、3、5 ℃貯藏,測(cè)定原花青素、黃酮、總酚、VC含量,相關(guān)抗性酶[超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、苯丙氨酸解氨酶（shenylalanine ammonia lyase,PAL）]活性、次生代謝產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量及腐損率,探究火棘鮮果適宜的貯藏溫度,以期為火棘鮮果原料貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火棘鮮果:重慶火吉健康產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）有限公司；乙醇（60%）、三氯化鋁、乙酸鉀、Na2CO3、福林酚試劑、硫酸鐵銨、丙酮、甲醇、香草醛、硫酸、草酸、α,α′-聯(lián)吡啶、VC、十二烷基苯磺酸鈉（均為分析純）、原花青素標(biāo)品:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:德國Dr.Ehrenstorfer 公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品:天津科密歐化學(xué)試劑公司；SOD 活性檢測(cè)試劑盒、PAL 活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛測(cè)試盒、植物類黃酮含量檢測(cè)試劑盒、植物總酚檢測(cè)試劑盒:北京索萊寶科技有限公司；2,6-二氯酚靛酚（分析純）:成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

754E 紫外-可見分光光度計(jì):天津市普瑞斯儀器有限公司；GL-12A 高速冷凍離心機(jī):上海菲恰爾分析儀器有限公司；BC/BD-101HEJ 冰箱:青島海爾集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)將采收的火棘鮮果剔除損傷和霉?fàn)€果后隨機(jī)分為6 組,每組250 g,采用打孔聚乙烯（polyethylene,PE）保鮮袋分裝,利用冰箱進(jìn)行控溫貯藏,溫度波動(dòng)范圍±0.5 ℃,分別置于-5、-3、-1、1、3、5 ℃溫度下貯藏,每隔15 d 測(cè)定原花青素、黃酮、總酚、Vc、MDA 含量,SOD、PAL 活性和腐損率,做3 次重復(fù)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 原花青素含量測(cè)定

取原花青素標(biāo)品10 mg,用甲醇配制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液,分別取1 mL 加入2.5 mL 3% 香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30% 硫酸-甲醇溶液,搖勻,30 ℃水浴保溫20 min。在546 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.162x+0.026,R2=0.997 6）。

準(zhǔn)確稱取1.0 g 火棘鮮果粉末于錐形瓶中,加入乙醇溶液20 mL,將錐形瓶60 ℃水浴60 min,經(jīng)過濾后提取2 次,合并提取液,旋蒸后用60% 乙醇定容至25 mL。取1 mL 加入2.5 mL 3% 香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30% 硫酸-甲醇溶液,搖勻,30 ℃水浴保溫20 min。在546 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。

1.4.2 黃酮含量測(cè)定

黃酮含量測(cè)定參照植物類黃酮含量檢測(cè)試劑盒說明書。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:用移液管分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL,置于10 mL 容量瓶中,加入三氯化鋁溶液2 mL、乙酸鉀溶液3 mL,用乙醇溶液定容至刻度,搖勻,室溫下放置30 min,同時(shí)以蒸餾水作空白對(duì)照,在波長(zhǎng)470 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo),濃度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出蘆丁濃度（μg/mL）與吸光度間的線性回歸方程（y=0.837 7x+0.059,R2=0.990 9）。

生鮮火棘果粉碎,稱取樣品0.2 g,置于150 mL 具塞三角瓶中,加入乙醇溶液30 mL,蓋緊瓶塞,將三角瓶置于65 ℃恒溫提取2 h,趁熱過濾,濾液置于50 mL容量瓶中,用乙醇溶液清洗濾紙和殘?jiān)?合并濾液,冷卻至室溫,加乙醇溶液至刻度,搖勻,為火棘待測(cè)液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL 火棘待測(cè)液至10 mL 容量瓶中,分別加入三氯化鋁溶液2 mL、乙酸鉀溶液3 mL,用乙醇溶液定容至刻度,搖勻,室溫下放置30 min,在4 000 r/min速度下離心10 min,于波長(zhǎng)470 nm 處測(cè)定吸光度,將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算黃酮濃度。

1.4.3 總酚含量測(cè)定

參照植物總酚檢測(cè)試劑盒說明書,將生鮮火棘果粉碎,稱取樣品約0.1 g 于帶蓋離心管,加入2 mL 60%乙醇水溶液,蓋緊,漩渦混勻抽提2～3 min,置于60 ℃提取30 min,4 000 r/min 離心10 min,上清液待測(cè)。按說明書測(cè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管及對(duì)照管760 nm下吸光度（A0、A1、A2、A3）,按下列公式計(jì)算出植物總酚含量（F,μmol/g）。

式中:B為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,500μmol/g；T為提取液體積,0.002 L；X為上清液稀釋倍數(shù)；Y為樣本質(zhì)量,g。

1.4.4 VC含量測(cè)定

參考曹建康等[16]方法測(cè)定VC含量。20 g/L 草酸溶液:準(zhǔn)確稱取草酸20 g,蒸餾水溶解稀釋定容至1 000 mL。0.1 mg/mL 抗壞血酸溶液:稱取50 mg 抗壞血酸,用20 g/L 草酸溶液溶解,定容至500 mL,低溫避光保存。

2,6-二氯酚靛酚溶液:稱取2,6-二氯酚靛酚100 mg,充分溶解在100 mL 沸水中（加入26 mg 碳酸氫鈉）,冷卻后過濾,用蒸餾水定容至1 000 mL,貯于棕色瓶中,低溫保存。

2,6-二氯酚靛酚溶液染料標(biāo)定:采用染料將10 mL 標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸滴定至微紅色,15 s 不褪色,根據(jù)滴定量計(jì)算每mL 染料的滴定度。

稱取火棘鮮果10 g 加入少量草酸溶液于研缽中冰浴勻漿,將勻漿轉(zhuǎn)入容量瓶中,加草酸定容至100 mL 搖勻,于冰水靜置10 min 后,收集濾液,用移液管移取10 mL 濾液于三角瓶中,用標(biāo)定后的染料滴定至微紅色,且15 s 不褪色即為終點(diǎn),記錄染料用量。以10 mL 草酸溶液為空白對(duì)照。按下列公式計(jì)算出VC含量（B,mg/100 g）。

B=（V-V0）×T×A/（W× 100）

式中:V為滴定樣液時(shí)消耗染料溶液的體積,mL；V0為滴定空白時(shí)消耗染料溶液的體積,mL；T為2,6-二氯酚靛酚染料滴定度,mg/mL；A為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量,g。

1.4.5 SOD 活性測(cè)定

參照SOD 活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。以每分鐘每克樣本在反應(yīng)體系中使560 nm 處吸光度變化0.01 為一個(gè)酶活力單位,為U/g（鮮重）。

1.4.6 PAL 活性測(cè)定

參照PAL 活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。以每分鐘每克樣本在反應(yīng)體系中使290 nm 處吸光度變化0.01 為一個(gè)酶活力單位,為U/g（鮮重）。

1.4.7 MDA 含量測(cè)定

參照丙二醛測(cè)試盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.4.8 腐損率測(cè)定

取試樣100 g 左右,稱量計(jì)為m1,分選出褐變、霉?fàn)€、黑化的火棘顆粒,稱量計(jì)為m2,計(jì)算腐損率（D,%）。

D=m2/m1× 100

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次,取平均值,顯著性采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果功效成分及腐損率的影響

2.1.1 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果原花青素含量的影響

原花青素是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮混合物,具有優(yōu)越的抗氧化、清除自由基、心血管保護(hù)等一系列重要的保健生理作用[17],貯藏期間保持火棘鮮果相對(duì)較高的原花青素含量可為深加工提供高品質(zhì)原料保障。貯藏溫度對(duì)火棘鮮果原花青素含量的影響如圖1 所示。

圖1 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果原花青素含量的影響Fig.1 Effects of storage temperature on proanthocyanidin content of fresh pyracantha

由圖1 可知,初始原花青素含量為32.11 mg/g。研究發(fā)現(xiàn),貯藏溫度越低,越有利于原花青素保持,0 ℃以上貯藏溫度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)原花青素含量下降幅度越大,零下貯藏溫度有利于原花青素保持,且貯藏溫度越低,下降幅度越小。特別是-3、-5 ℃與常規(guī)5 ℃貯藏溫度相比,貯藏60 d,-5、-3 ℃原花青素含量分別是其3.80 倍和3.41 倍,比較發(fā)現(xiàn)-3 ℃和-5 ℃差異較小,故選擇-3 ℃貯藏作為推薦性貯運(yùn)溫度。

2.1.2 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果黃酮含量的影響

黃酮類化合物是一類具有廣泛生物活性的物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、防治心血管疾病及增強(qiáng)人體免疫力等多種生物活性。貯藏溫度對(duì)火棘鮮果黃酮含量的影響如圖2 所示。

圖2 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果黃酮含量的影響Fig.2 Effects of storage temperature on flavonoid content of fresh pyracantha

由圖2 可知,初始黃酮含量為6.11 mg/g。研究發(fā)現(xiàn),貯藏溫度越低,越有利于黃酮含量保持,這與顧思彤等[18]研究發(fā)現(xiàn)0 ℃貯藏可以顯著保持軟棗獼猴桃類黃酮含量的結(jié)果一致。0 ℃以上貯藏溫度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),黃酮含量下降幅度越大,而貯藏溫度越低,下降幅度越小,零下溫度此趨勢(shì)更明顯,-3、-5 ℃效果較好。同5 ℃貯藏相比,-3 ℃黃酮含量是5 ℃的2.17倍,-5 ℃是5 ℃的2.20 倍。比較發(fā)現(xiàn)-3 ℃貯藏和-5 ℃貯藏差異不顯著,-3 ℃作為推薦性貯藏溫度。

2.1.3 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果總酚含量的影響

酚類物質(zhì)廣泛存在于植物中,是植物次生代謝的產(chǎn)物,具有抗氧化、殺菌、清除自由基等作用,同時(shí)在預(yù)防心腦血管、癌癥以及衰老方面有著十分重要的作用[19]。貯藏溫度對(duì)火棘鮮果總酚含量的影響如圖3 所示。

圖3 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果總酚含量的影響Fig.3 Effects of storage temperature on total phenolic content of fresh pyracantha

由圖3 可知,總酚初始含量高達(dá)111.19μmol/g。研究發(fā)現(xiàn),貯藏溫度越低,越有利于總酚含量的保持,與張瑜瑜等[20]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓5 ℃冷藏比對(duì)照和0 ℃貯藏更有利于總酚保持結(jié)果不一致,原因可能與兩者組織結(jié)構(gòu)差異有關(guān)；0 ℃以上貯藏溫度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),總酚含量下降幅度越大,而貯藏溫度越低,下降幅度越小,-3、-5 ℃此趨勢(shì)更明顯。同5 ℃相比,-3、-5 ℃總酚含量分別是5 ℃的1.92、1.94 倍。比較發(fā)現(xiàn)-3 ℃和-5 ℃差異較小,-3 ℃作為推薦性貯藏溫度。

2.1.4 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果VC含量的影響

VC是植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì),具有一定的還原性,可清除果蔬體內(nèi)因氧化作用產(chǎn)生的自由基,可抑制果蔬體內(nèi)非酶促褐變。貯藏溫度對(duì)火棘鮮果VC含量的影響如圖4 所示。

圖4 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果VC 含量的影響Fig.4 Effects of storage temperature on VC content of fresh pyracantha

由圖4 可知,VC初始含量為5.38 mg/100 g。研究發(fā)現(xiàn),貯藏溫度越低,越有利于VC保持,這與顧思彤等[18]研究發(fā)現(xiàn)0 ℃貯藏顯著保持軟棗獼猴桃較高VC含量一致。也與曾麗萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)低溫貯藏可延緩VC降解損失一致。0 ℃以上貯藏溫度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),VC含量下降幅度越大,而貯藏溫度越低,下降幅度越小,貯藏60 d,-3、-5 ℃VC保持率分別是5 ℃的3.54、3.58 倍。比較發(fā)現(xiàn)-3 ℃和-5 ℃差異不顯著,以-3 ℃作為推薦性貯藏溫度。

2.2 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果相關(guān)抗性酶活性和次生代謝產(chǎn)物的影響

2.2.1 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果SOD 活性的影響

果實(shí)在生理代謝過程中產(chǎn)生大量的活性氧,啟動(dòng)膜脂過氧化反應(yīng),引起細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)破壞。SOD 是細(xì)胞抵御活性氧傷害的重要保護(hù)性酶,能將O2-歧化為H2O2和O2[22]。貯藏溫度對(duì)火棘鮮果SOD 活性的影響如表1 所示。

表1 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果SOD 活性的影響Table 1 Effect of storage temperature on SOD activity of fresh pyracantha U/g

火棘鮮果初始SOD 活性為100.04 U/g,由表1 可知,隨著貯藏溫度升高,SOD 活性逐漸降低。貯藏60 d,-5、-3 ℃和-1 ℃SOD 活性分別是5 ℃的7.3、7.1、5.9 倍,說明貯藏溫度越低越有利于維持相對(duì)較高的SOD 活性,這與孫佳平等[23]研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫可造成甜菜SOD 活性顯著上升的結(jié)果一致。也與趙秋月等[24]發(fā)現(xiàn)低溫有利于保持平菇相對(duì)較高SOD 活性的研究結(jié)果一致。

2.2.2 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果PAL 活性的影響

PAL 是苯丙烷類代謝過程關(guān)鍵酶和限速酶,能促進(jìn)酚類、木質(zhì)素和植保素等重要抗菌物質(zhì)合成[25]。貯藏溫度對(duì)火棘鮮果PAL 活性的影響如表2 所示。

表2 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果PAL 活性的影響Table 2 Effect of storage temperature on PAL activity of fresh pyracantha U/g

低溫貯藏有利于維持火棘鮮果較高的PAL 活性,初始PAL 活性為98.07 U/g,由表2 可知,隨著溫度升高,PAL 活性逐漸降低。說明低溫冷藏有利于維持PAL 活性,從而提高抗病性、延緩衰老,低溫貯藏有利于維持火棘鮮果較高的PAL 活性,貯藏60 d,-5、-3、-1 ℃的PAL 活性分別是5 ℃的4.07、3.54、2.97 倍。這與秦國政等[26]研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌與病原菌處理桃并使其導(dǎo)保持較高PAL 活性,有利于發(fā)揮抑病效果的結(jié)果一致。

2.2.3 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果MDA 含量的影響

MDA 能破壞維持正常代謝的內(nèi)膜系統(tǒng),導(dǎo)致細(xì)胞透性增加、細(xì)胞代謝失調(diào)、膜結(jié)構(gòu)及其功能被破壞、果肉組織衰老,其絕對(duì)含量和累積速率可作為判斷果蔬耐貯性指標(biāo)之一,MDA 累積含量高低反應(yīng)細(xì)胞膜損傷程度。貯藏溫度對(duì)火棘鮮果MDA 含量的影響如表3所示。

表3 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果MDA 含量的影響Table 3 Effect of storage temperature on MDA content of fresh pyracantha nmol/g

初始MDA 含量9.22 nmol/g,由表3 可知,貯藏60 d 時(shí),與5 ℃相比,-5 ℃低74.30%,-3 ℃低69.71%,-1 ℃低47.21%,貯藏溫度越低越有利于抑制火棘鮮果MDA 累積,這與林炎娟等[27]研究發(fā)現(xiàn)低溫顯著抑制青梅采后MDA 含量積累結(jié)果一致。

2.2.4 貯藏溫度對(duì)火棘鮮果腐損率的影響

貯藏溫度是影響采后果蔬呼吸作用、微生物生長(zhǎng)和代謝相關(guān)酶活性變化的主要因素,貯藏溫度對(duì)火棘鮮果腐損率的影響如圖5 所示。

火棘鮮果主要成分為膳食纖維,由圖5 可知,零下貯藏溫度不會(huì)影響火棘鮮果質(zhì)構(gòu)特性,貯藏溫度越高,火棘鮮果腐損率越大。5 ℃貯藏60 d,腐損率高達(dá)86.82%,3 ℃為75.94%、1 ℃為39.72%,而零下貯藏溫度如-1、-3、-5 ℃,其腐損率分別為16.42%、10.47%、10.03%。比較發(fā)現(xiàn)-3 ℃和-5 ℃差異不明顯,-3 ℃作為推薦性貯藏溫度。

3 結(jié)論

分析不同貯藏溫度、貯藏時(shí)間下火棘鮮果功效成分（原花青素、黃酮、總酚、VC）、次生代謝產(chǎn)物MDA 含量、抗性相關(guān)酶SOD、PAL 活性和腐損率變化趨勢(shì),確定火棘鮮果最適貯藏溫度。結(jié)果表明,與傳統(tǒng)高溫冷庫貯藏相比,-5、-3、-1 ℃微凍貯藏更有利于火棘鮮果原花青素、黃酮、總酚、VC等功效成分含量的保持,-5、-3 ℃貯藏效果更佳,但整體上-5 ℃和-3 ℃差異不明顯；相關(guān)抗性酶活性分析表明-5、-3 ℃貯藏有利于維持較高的SOD、PAL 活性,從而提高抗病性、延緩衰老；-5、-3 ℃貯藏可有效降低次生代謝產(chǎn)物MDA 累積程度；-5、-3 ℃腐損率明顯降低,-5 ℃和-3 ℃差異不明顯。推薦以-3 ℃作為火棘鮮果貯藏溫度,可相對(duì)減少能耗和運(yùn)行成本。