重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合生產(chǎn)多粘菌素E

李思雨，孟之超，鄭輝杰

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300401）

隨著生活水平的不斷提高,人們對(duì)食品健康安全越來越重視。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中,抗生素被大量應(yīng)用于畜禽生病治療和提高抗病能力上,當(dāng)這些畜禽被制作成食品時(shí),就要考慮這些食品被食用后,畜禽類體內(nèi)殘留的抗生素是否會(huì)影響到人類健康。多粘菌素E 是一種對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)抗菌作用的多肽類抗生素[1],其所含毒性不大,安全性較高,多粘菌素E 不易被人體腸道吸收,但能被畜禽吸收降解,作為飼料添加劑能夠促進(jìn)畜禽生長,且在體內(nèi)的藥物殘留率低?，F(xiàn)今多粘菌素E 作為一種安全的添加劑用于食用的畜禽的飼料中,提高了多粘菌素E 的需求量。因此,為滿足市場需求,提高多粘菌素E 產(chǎn)量變得尤為重要[2-3]。

近年來,人們在提高多粘菌素E 產(chǎn)量上進(jìn)行了許多研究:1）利用高通量策略篩選多粘菌素E 高產(chǎn)菌株[4]；2）優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基[5],如Yu 等[6]用淀粉代替葡萄糖,優(yōu)化多粘菌素E 發(fā)酵培養(yǎng)基,通過影響多粘菌素E生物合成的相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)了多粘菌素E 的產(chǎn)生和多粘類芽孢桿菌的生長；3）改變發(fā)酵方式[7],如董凱等[8]采用分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行生產(chǎn),提高了多粘菌素E的產(chǎn)量。而重復(fù)分批發(fā)酵的方式還未應(yīng)用于多粘菌素E 的生產(chǎn)上,重復(fù)分批發(fā)酵通過定期去除發(fā)酵液并添加新鮮培養(yǎng)基的方式,來提高產(chǎn)物產(chǎn)量[9]。此發(fā)酵方法可縮短發(fā)酵的前期準(zhǔn)備時(shí)間,延長發(fā)酵中產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間[10]。

發(fā)酵液的大量置換,會(huì)減少培養(yǎng)基中的菌種含量進(jìn)而影響生產(chǎn),故應(yīng)選取合適的分離方法將發(fā)酵液中的菌種與產(chǎn)物分離,使含有菌種的部分發(fā)酵液重新進(jìn)入重復(fù)分批發(fā)酵中。常用分離方法有色譜分離法[11]、大孔樹脂吸附法[12]、萃取分離法[13]和沉淀分離法[14],但是這些分離方法大多會(huì)對(duì)菌體造成損傷且難以與發(fā)酵耦合,分離出的菌體無法繼續(xù)應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)。泡沫分離是在物質(zhì)具有表面活性的基礎(chǔ)上,通過通氣產(chǎn)生氣泡,使需分離的物質(zhì)吸附在氣液界面隨泡沫吹出,從而達(dá)到濃縮分離產(chǎn)物的目的。此分離方法具有分離條件溫和、設(shè)備機(jī)械部件少、易于工業(yè)放大等優(yōu)點(diǎn)[15-16]。使用泡沫分離方法分離產(chǎn)物,對(duì)發(fā)酵液內(nèi)的菌種傷害較小,且設(shè)備裝置簡單,易與發(fā)酵結(jié)合,泡沫分離法應(yīng)用的前提是分離物質(zhì)需為具有表面活性的物質(zhì),而多粘菌素E 具有表面活性可應(yīng)用泡沫分離進(jìn)行產(chǎn)物分離[17]。故可將重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合應(yīng)用于生產(chǎn)分離多粘菌素E。

本研究的目的是通過重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合提高多粘菌素E 的產(chǎn)量并從發(fā)酵液中濃縮富集多粘菌素E。在發(fā)酵過程中加入非離子表面活性劑吐溫80,有試驗(yàn)證明吐溫80 可以提高細(xì)菌素的產(chǎn)量,表面活性劑的添加也能夠提高起泡性和泡沫穩(wěn)定性[18-19]。本文對(duì)發(fā)酵液的置換時(shí)間和置換比例進(jìn)行優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上優(yōu)化吐溫80 的添加時(shí)間和添加量,并確定氣體體積流量對(duì)多粘菌素E 分離的影響。在最優(yōu)條件下將重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合,以細(xì)胞干重和多粘菌素E 效價(jià)為指標(biāo),探究耦合發(fā)酵分離方法對(duì)多粘菌素E 產(chǎn)量的影響。本文采用重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵和泡沫分離耦合的方法生產(chǎn)多粘菌素E,以解除產(chǎn)物抑制,簡化分離工序,促進(jìn)多粘菌素E 生產(chǎn),以期為多粘菌素E 的生產(chǎn)分離工藝提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多粘菌素E 生產(chǎn)菌多粘類芽孢桿菌（Bɑcilluspolymyxɑ）由河北工業(yè)大學(xué)生物工程系菌種保藏室提供；磷酸二氫鉀、蛋白胨、葡萄糖（均為分析純）:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、氨水（均為分析純）、乙腈（色譜純）:天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；吐溫80（分析純）:上海麥克林生化科技有限公司；硫酸銨、硫酸亞鐵（均為分析純）:天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；酵母浸粉（分析純）:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸多粘菌素E 標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（UV-1100）:上海美譜達(dá)儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器（85-2A）:杭州儀表電機(jī)有限公司；高效液相色譜儀（LC-20A）:島津企業(yè)管理（中國）有限公司；發(fā)酵設(shè)備:河北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵與生物分離工程實(shí)驗(yàn)室自制；臺(tái)式高速離心機(jī)（3K18）:美國Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

多粘類芽孢桿菌活化培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨1 g/L,氯化鈉1 g/L。氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

多粘類芽孢桿菌種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉40 g/L,氯化鈉1 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L。氨水調(diào)節(jié)pH 值至6.8,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

多粘類芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,硫酸銨10 g/L,氯化鈉1 g/L,硫酸亞鐵0.1 g/L,磷酸二氫鉀0.1 g/L。氨水調(diào)節(jié)pH 值至7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 多粘類芽孢桿菌細(xì)胞干重測定

生物量與吸光值（OD600）的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:在32 ℃、200 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液,從發(fā)酵開始到發(fā)酵結(jié)束,每1 h 取兩份發(fā)酵液樣品,待發(fā)酵液OD600值不再增大后停止取樣。一份樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋,在波長600 nm 下,測定吸光值。另一份樣品取5 mL 放入10 mL 已稱重的干燥離心管中,離心管質(zhì)量為m1,放入高速離心機(jī)中,10 000 r/min 離心10 min 后取出上清液,再加入適當(dāng)生理鹽水洗滌,同樣方法離心兩次后放入烘箱中在100 ℃條件下至完全干燥,稱重,質(zhì)量記為m2。樣品的干重（dry cell weight,DCW）m=m2-m1。

細(xì)胞干重（y）與吸光值（x）的關(guān)系:y=12.43x+0.03,R2=0.998。通過測定600 nm 波長下的吸光值得到相應(yīng)的細(xì)胞干重。

1.3.2.2 多粘菌素E 效價(jià)測定

利用高效液相色譜法定量檢測多粘菌素E 效價(jià),使用色譜柱C18（160 mm×4.6 mm×3.5μm）,流動(dòng)相為乙腈-無水硫酸鈉溶液,取多粘菌素E 標(biāo)準(zhǔn)品用稀硫酸稀釋至合適的濃度梯度,在波長215 nm、流速1 mL/min 條件下測定峰面積,將多粘菌素E 效價(jià)與其對(duì)應(yīng)峰面積擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到多粘菌素E 效價(jià)（Y）與峰面積（X）的關(guān)系:Y=3.76X+393.01,R2=0.996。

1.3.2.3 泡沫分離性能評(píng)價(jià)

多粘菌素E 的泡沫分離效率用富集比（F）和回收率（R,%）評(píng)價(jià),計(jì)算公式如下。

F=Tf/Ti

R=TfVf/TiVi

式中:Tf為泡沫液中多粘菌素E 效價(jià),U/mL；Ti為發(fā)酵原液中多粘菌素E 效價(jià),U/mL；Vf為泡沫液的體積,mL；Vi為發(fā)酵原液的體積,mL。

1.3.3 重復(fù)分批發(fā)酵條件的選擇

1.3.3.1 多粘類芽孢桿菌發(fā)酵

刮取斜面中的多粘類芽孢桿菌菌種接種于種子液中,在33 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h 后,將種子液以10%（體積比）的比例加入發(fā)酵液中,在32 ℃、200 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h,每4 h 取樣測定細(xì)胞干重和多粘菌素E 效價(jià),繪制多粘類芽孢桿菌發(fā)酵生長曲線,初步選定重復(fù)分批發(fā)酵的置換時(shí)間。

1.3.3.2 重復(fù)分批發(fā)酵置換時(shí)間的確定

將300 mL 發(fā)酵液置于500 mL 搖瓶中發(fā)酵確定發(fā)酵液置換時(shí)間點(diǎn)分別為第24、36、48 小時(shí),發(fā)酵置換比例設(shè)定為70%,發(fā)酵72 h,每6 h 從發(fā)酵液中取1 次樣,測定多粘菌素E 效價(jià),探究發(fā)酵液置換時(shí)間對(duì)多粘菌素E 產(chǎn)量的影響。

1.3.3.3 重復(fù)分批發(fā)酵置換比例的確定

將300 mL 發(fā)酵液置于500 mL 搖瓶中,在32 ℃、200 r/min 的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),在發(fā)酵的第36 小時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液置換,置換比例分別為50%、60%、70%、80%。每12 h 從發(fā)酵液中取1 次樣,測定多粘菌素E效價(jià)和多粘類芽孢桿菌細(xì)胞干重,探究發(fā)酵液置換比例對(duì)多粘菌素E 產(chǎn)量的影響。

1.3.3.4 吐溫80 添加時(shí)間的確定

將300 mL 發(fā)酵液置于500 mL 搖瓶中,在32 ℃、200 r/min 的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),吐溫80 添加時(shí)間設(shè)定為第1 次發(fā)酵的第0、8、16、24、32 小時(shí)和置換后的第0、3、6、9 小時(shí),吐溫80 添加量為0.15%。以不添加吐溫80 的發(fā)酵液作為對(duì)照組,分別在發(fā)酵液第1 次置換的第36 小時(shí)和置換后的第12 小時(shí)取樣,測定多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重,探究吐溫80 添加時(shí)間對(duì)多粘菌素E 產(chǎn)量的影響。

1.3.3.5 吐溫80 添加量的確定

將300 mL 發(fā)酵液置于500 mL 搖瓶中,在32 ℃、200 r/min 的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),在發(fā)酵的第24 小時(shí)添加吐溫80,吐溫80 添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%,在第36 小時(shí)取樣,測定多粘菌素E 的效價(jià)和多粘類芽孢桿菌的細(xì)胞干重,探究吐溫80 添加量對(duì)多粘菌素E 產(chǎn)量的影響。

1.3.4 泡沫分離氣體體積流量的選擇

將置換出的含有吐溫80 的發(fā)酵液導(dǎo)入泡沫分離塔中,氣體體積流量分別為40、60、80、100、120 mL/min,進(jìn)行泡沫分離并測定富集比和回收率,探究氣體體積流量對(duì)多粘菌素E 分離效率的影響。

1.3.5 重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合裝置的構(gòu)建

構(gòu)建重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合裝置如圖1 所示,發(fā)酵罐的體積為1 L,裝液量為900 mL,將發(fā)酵罐與泡沫分離塔用蠕動(dòng)泵連接,形成循環(huán)回流密閉裝置生產(chǎn)多粘菌素E,并在發(fā)酵罐上連接裝有新鮮發(fā)酵液的錐形瓶用于補(bǔ)充培養(yǎng)基,發(fā)酵罐上含有進(jìn)料口、發(fā)酵液泵出口、殘液回流口和取樣口,以滿足試驗(yàn)中發(fā)酵液置換、補(bǔ)料和取樣的要求。將發(fā)酵罐放在恒溫加熱磁力攪拌器上,發(fā)酵罐中放入轉(zhuǎn)子,發(fā)酵罐具有溫度檢測、pH 值檢測裝置放置處,以滿足發(fā)酵條件檢測需求,設(shè)置條件:溫度32 ℃、pH7、轉(zhuǎn)速200 r/min。及時(shí)補(bǔ)加氨水調(diào)節(jié)pH 值,將種子液以10%（體積比）的添加量加入發(fā)酵液中培養(yǎng),在第36 小時(shí)進(jìn)行耦合操作,首先將發(fā)酵液通過蠕動(dòng)泵泵入泡沫分離塔中進(jìn)行泡沫分離；在泡沫分離結(jié)束后,將殘液泵回發(fā)酵罐中,并將新鮮發(fā)酵液泵入發(fā)酵罐使發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液含量至最初裝液量；然后繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵至下次置換,并重復(fù)以上操作直至發(fā)酵結(jié)束。

圖1 重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合裝置圖Fig.1 Installation diagram of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation

1.3.6 重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合操作方法

在發(fā)酵培養(yǎng)的第24 小時(shí)和每次發(fā)酵液置換后的第6 小時(shí)向發(fā)酵罐中加入0.15%的吐溫80,并在發(fā)酵培養(yǎng)的第36 小時(shí)和每次發(fā)酵液置換后的第12 小時(shí)進(jìn)行泡沫分離,在80 mL/min 的氣體體積流量下分離1 h后,將殘液泵回發(fā)酵罐中并添加新鮮培養(yǎng)基至初始容積,發(fā)酵過程中每12 h 測定1 次多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次,用Origin2023 進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌發(fā)酵結(jié)果

多粘類芽孢桿菌發(fā)酵過程見圖2。

圖2 多粘類芽孢桿菌發(fā)酵過程Fig.2 Fermentation process of Bacillus polymyxa

多粘類芽孢桿菌的發(fā)酵周期一般為48～72 h,由圖2 可知,在0～4 h 為多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生長延滯期,細(xì)胞生長緩慢,多粘菌素E 產(chǎn)量也較低,在4～24 h為多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生長對(duì)數(shù)期,此周期細(xì)胞生長迅速,但多粘菌素E 產(chǎn)量仍然較低；在24～40 h 為穩(wěn)定期,此時(shí)菌體繁殖速度減弱,趨于平穩(wěn),在36 h 時(shí)多粘菌素E 產(chǎn)量大幅度上升至最高水平；在40 h 后菌體進(jìn)入衰亡期,菌體停止生長并開始死亡,多粘菌素E 產(chǎn)量不再提高。多粘類芽孢桿菌發(fā)酵過程分為3 個(gè)不同時(shí)期:菌體繁殖期、分泌期和芽孢形成期[20],初步選定這3 個(gè)時(shí)期為發(fā)酵液置換時(shí)間點(diǎn),即在發(fā)酵的第24、36、48 小時(shí)進(jìn)行置換。

2.2 發(fā)酵液置換時(shí)間對(duì)多粘菌素E 效價(jià)的影響

表1 為不同發(fā)酵液置換時(shí)間點(diǎn)的多粘菌素E 效價(jià),由于66、72 h 時(shí)的數(shù)據(jù)波動(dòng)較小,故未列出。

表1 不同發(fā)酵液置換時(shí)間點(diǎn)的多粘菌素E 效價(jià)Table 1 Polymyxin E titer at different time points of fermentation broth replacement U/mL

由表1 可知,在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行置換,置換后效價(jià)都在置換后的第12 小時(shí)達(dá)到最高值,這是由于置換時(shí)發(fā)酵液中的多粘類芽孢桿菌含量遠(yuǎn)高于初次接種量,并沒有明顯的生長延滯期,而是快速繁殖,分泌多粘菌素E。因此置換后選擇在第12 小時(shí)進(jìn)行下次發(fā)酵液置換。在第36 小時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液置換,得到最高的多粘菌素E 產(chǎn)量為17 929.8 U/mL。這是因?yàn)樵?4 h 時(shí)處于多粘類芽孢桿菌發(fā)酵的菌體繁殖期,更換新的發(fā)酵液后,細(xì)菌不能快速適應(yīng)新的環(huán)境,無法快速大量分泌多粘菌素E,且在此時(shí)期培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)還比較充足,置換培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵影響并不大。在48 h 時(shí)處于多粘類芽孢桿菌的芽孢形成期,此時(shí)菌體開始走向衰老,活性減小,不能很好地適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境,此時(shí)置換發(fā)酵液會(huì)造成菌體的大量死亡,以致產(chǎn)量大大降低,所以置換后產(chǎn)量較其他置換時(shí)間點(diǎn)偏低。在36 h 時(shí)處于多粘類芽孢桿菌發(fā)酵的分泌期,即大多處于多粘類芽孢桿菌的穩(wěn)定期,此時(shí)多粘菌素E 產(chǎn)量達(dá)到最高,且發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)被大量利用。此時(shí)更換發(fā)酵液,穩(wěn)定期的細(xì)菌快速適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境,細(xì)菌開始下一批生長繁殖,在穩(wěn)定期進(jìn)行置換時(shí)發(fā)酵罐中處于穩(wěn)定期的細(xì)胞多于對(duì)數(shù)期和衰亡期,更有利于大量分泌多粘菌素E。故選擇在36 h 進(jìn)行第1 次置換,之后每12 小時(shí)置換一次,直至多粘菌素E 產(chǎn)量降低。

2.3 發(fā)酵液置換比例對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響

發(fā)酵液置換比例對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵液置換比例對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響Fig.3 Effect of replacement ratio of fermentation broth on polymyxin E titer and cell dry weight

由圖3A 可知,當(dāng)置換比例為50%時(shí),置換后多粘菌素E 產(chǎn)量均低于初始發(fā)酵中多粘菌素E 產(chǎn)量,在4 次循環(huán)后產(chǎn)量更是大大減小。且多粘類芽孢桿菌細(xì)胞濃度也逐漸下降,第3 次循環(huán)時(shí)得到置換中的最高細(xì)胞干重為5.63 g/L,遠(yuǎn)低于第1 次發(fā)酵液中多粘類芽孢桿菌濃度（10.21 g/L）。這是因?yàn)槎嗾尘谽 的大量積累對(duì)多粘類芽孢桿菌造成產(chǎn)物抑制[21],而置換比例為50%時(shí),置換后的發(fā)酵液中多粘菌素E 含量仍較高,產(chǎn)物抑制并沒有得到很大緩解,抑制了多粘菌素E 產(chǎn)量的增加。由圖3B 可知,當(dāng)置換比例為60%時(shí),置換后多粘菌素E 產(chǎn)量比置換比例50%時(shí)有所提高,在4 次循環(huán)后產(chǎn)量也大幅下降。由圖3C 可知,當(dāng)置換比例為70%時(shí),置換后多粘菌素E 產(chǎn)量在前5 次循環(huán)時(shí)都較為穩(wěn)定且較高,分別為19 272.64、19 242.5、19 749.9、21 698.5、18 131.5 U/mL。第6 次循環(huán)時(shí)多粘菌素E 產(chǎn)量為17 023.5 U/mL 較前幾次循環(huán)的多粘菌素E 雖有所降低,但仍高于50%、60%時(shí)的多粘菌素E 產(chǎn)量。多粘類芽孢桿菌細(xì)胞干重分別為10.32、10.30、10.25、10.45、9.96、8.59 g/L,可知細(xì)胞能很快適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境,快速繁殖。由圖3D 可知,置換比例為80%時(shí),6 次循環(huán)的多粘菌素E 產(chǎn)量分別為18 624.2、16 388.6、16 384.2、17 096.4、15 510.3、14 987.2 U/mL,多粘類芽孢桿菌細(xì)胞干重分別為10.45、9.59、9.77、9.84、8.70、8.09 g/L,相較于置換比例為70%時(shí),多粘菌素E 濃度和菌種含量均有所下降,這是因?yàn)橹脫Q比例變高后,新置換的發(fā)酵液內(nèi)菌種含量減少,與置換比例70%相比,發(fā)酵液內(nèi)穩(wěn)定期的細(xì)菌含量以及對(duì)新培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力均降低。在置換比例為70%,最高的多粘菌素E產(chǎn)量出現(xiàn)在第4 次循環(huán),之后產(chǎn)量開始逐漸降低,在第6 次循環(huán)后多粘類芽孢桿菌發(fā)酵能力開始出現(xiàn)明顯下降。綜上,多粘類芽孢桿菌重復(fù)分批發(fā)酵可穩(wěn)定循環(huán)6 次,置換比例為70%時(shí)效果最好。故選擇發(fā)酵液置換比例為70%,重復(fù)分批發(fā)酵循環(huán)6 次后終止。

2.4 吐溫80 添加時(shí)間對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響

吐溫80 添加時(shí)間對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響見圖4。

圖4 吐溫80 添加時(shí)間對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響Fig.4 Effect of addition time of Tween 80 on polymyxin E titer and cell dry weight

由圖4A 可知,不添加吐溫80 的對(duì)照組的多粘菌素E 效價(jià)為17 879.9 U/mL,細(xì)胞干重為9.99 g/L。在發(fā)酵液置換前的第0、8、16、24、32 小時(shí)加入吐溫80 所獲得的多粘菌素E 效價(jià)分別為16 095.9、20 109.6、20 449.2、22 952.1、22 384.6 U/mL,細(xì)胞干重分別為6.35、7.53、7.54、9.62、9.77 g/L。Reese 等[22]研究表明吐溫80 加入發(fā)酵液中可提高細(xì)菌素產(chǎn)物的產(chǎn)量,而多粘菌素E 為氨基酸構(gòu)成的多肽[23],也應(yīng)在發(fā)酵液中加入吐溫80,以提高其產(chǎn)量。且與對(duì)照組相比,在發(fā)酵液置換前0 h添加吐溫80 的多黏菌素E 產(chǎn)量卻大大減少,且添加吐溫80 后的細(xì)菌含量均低于對(duì)照組的細(xì)胞干重,這是因?yàn)橥聹?0 添加時(shí)細(xì)菌所處的生長時(shí)期不同,吐溫80 的加入可以增加細(xì)胞膜的通透性,這可以增加多粘菌素E 向胞外分泌,提高多粘菌素E 產(chǎn)量,但在發(fā)酵初期多粘類芽孢桿菌處于生長的延滯期,細(xì)菌受外界環(huán)境影響較其他時(shí)期更大,使菌體的生長受到抑制,從而使產(chǎn)量大大減小,發(fā)酵液置換前8、16 h 時(shí)處于細(xì)菌生長的對(duì)數(shù)期,也會(huì)影響菌體的生長,此時(shí)產(chǎn)量雖然得到了提高,但會(huì)不利于進(jìn)一步的重復(fù)分批發(fā)酵。而在發(fā)酵液置換前24、32 h 時(shí),細(xì)菌生長已經(jīng)進(jìn)入了穩(wěn)定期,吐溫80 的加入對(duì)多粘類芽孢桿菌的繁殖存活影響很小,且產(chǎn)量大大增加。故選擇發(fā)酵液置換前24 h 作為吐溫80 添加時(shí)間。同理,由圖4B 可知,應(yīng)選擇發(fā)酵液置換后第6 小時(shí)作為吐溫80 添加時(shí)間。

2.5 吐溫80 添加量對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響

吐溫80 添加量對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響見圖5。

圖5 吐溫80 添加量對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響Fig.5 Effect of Tween 80 addition on polymyxin E titer and cell dry weight

由圖5 可知,隨著吐溫80 添加量從0.05%增加到0.15%時(shí),多粘類芽孢桿菌的細(xì)胞膜通透性逐漸增強(qiáng),促進(jìn)多粘菌素E 向胞外分泌,提高了多粘菌素E 的產(chǎn)量。吐溫80 添加量為0.15%～0.30%時(shí),吐溫80 在培養(yǎng)基中的占比過多,使培養(yǎng)基過于黏稠,不利于營養(yǎng)物質(zhì)被吸收利用,從而影響多粘菌素E 的生產(chǎn)。因此本研究中最佳吐溫80 添加量為0.15%。

2.6 氣體體積流量對(duì)泡沫分離的影響

氣體體積流量對(duì)多粘菌素E 富集比和回收率的影響見圖6。

圖6 氣體體積流量對(duì)多粘菌素E 富集比和回收率的影響Fig.6 Effect of gas volumetric flow rate on enrichment ratio and recovery rate of polymyxin E

由圖6 可知,氣體體積流量從40 mL/min 增加到120 mL/min,多粘菌素E 的回收率從42.7% 增加至82.5%,多粘菌素E 的富集比從5.98 下降至3.66。在通氣后,發(fā)酵液中產(chǎn)生大量氣泡,而多粘菌素E 吸附在氣液界面,在浮力的作用下,這些吸附著多粘菌素E的氣泡不斷聚集上升,在液相表面形成泡沫,而泡沫中的各個(gè)氣泡以多面體形式相互堆疊,每個(gè)氣泡的接合處有著很薄的液體薄膜,這層薄膜和氣泡中含有液體,這些液體通常被稱為普朗特邊界層,這些液體會(huì)向著氣泡交界處的壓力最低點(diǎn),即普朗特邊界層的交界處流動(dòng),使平面液膜變薄。當(dāng)氣體體積流量逐漸增大,會(huì)使氣泡在泡沫分離塔的時(shí)間變短,泡沫排液時(shí)間變短,普朗特邊界層中的液體流失減少,氣泡間的夾帶液體增多[24]。且氣體體積流量的增大,產(chǎn)生了更多的氣泡,提供了更多的氣液界面,增大了多粘菌素E 的吸附面積。故增大氣體體積流量會(huì)增加泡沫中持液率,即回收率增大。氣體體積流量越大,消泡液的體積增大,消泡液中多粘菌素E 濃度相對(duì)減小,富集比減小,回收率增大。氣體體積流量越小,泡沫的停留時(shí)間越長,小氣泡不斷破碎形成大氣泡,氣液界面減少,排液時(shí)間變長,持液率減小,消泡液中多粘菌素E 濃度變大,富集比變大,回收率減小。當(dāng)氣體體積流量為80 mL/min時(shí),富集比為4.77,回收率為77.1%。進(jìn)一步提高氣體體積流量,回收率增加變緩,而富集比仍然下降較快,故選擇氣體體積流量為80 mL/min 進(jìn)行泡沫分離。

2.7 重復(fù)分批發(fā)酵耦合泡沫分離對(duì)多粘菌素E 細(xì)胞干重和效價(jià)的影響

重復(fù)分批發(fā)酵耦合泡沫分離對(duì)多粘菌素E 細(xì)胞干重的影響見圖7。

圖7 重復(fù)分批發(fā)酵耦合泡沫分離對(duì)多粘菌素E 細(xì)胞干重的影響Fig.7 Effect of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation on the dry weight of polymyxin E cells

由圖7 可知,在耦合組和對(duì)照組的細(xì)胞在重復(fù)分批發(fā)酵過程中每批次的生長趨勢相同,但耦合組細(xì)胞干重大于對(duì)照組。這是因?yàn)轳詈辖M將泡沫分離殘液泵回了發(fā)酵罐中,殘液中含有一定量的多粘類芽孢桿菌,使耦合組中多粘類芽孢桿菌含量大于對(duì)照組,使其更能充分利用新加入的新鮮培養(yǎng)基,進(jìn)行細(xì)胞傳代。發(fā)酵批次在第4 次時(shí)細(xì)胞干重達(dá)到最高,細(xì)胞干重為11.21 g/L。比對(duì)照組的細(xì)胞干重提高了16.4%。第4 批次后細(xì)胞干重開始下降,在第6 批次細(xì)胞干重大幅降低,這是因?yàn)樵诙啻沃貜?fù)培養(yǎng)后,培養(yǎng)基中一些具有毒性的產(chǎn)物積聚,使細(xì)菌生長受到影響或產(chǎn)生表型變異,細(xì)菌無法一直保持快速增殖狀態(tài),隨著細(xì)胞干重的逐漸降低,在發(fā)酵的6 批次后,已不適于再次進(jìn)行置換發(fā)酵。

重復(fù)分批發(fā)酵耦合泡沫分離對(duì)多粘菌素E 效價(jià)的影響見圖8。

圖8 重復(fù)分批發(fā)酵耦合泡沫分離對(duì)多粘菌素E 效價(jià)的影響Fig.8 Effect of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation on the titer of polymyxin E

由圖8 可知,耦合組置換后發(fā)酵液中的多粘菌素E 效價(jià)均高于對(duì)照組,在產(chǎn)量最高的第4 批次,耦合組的多粘菌素E 效價(jià)為28 034.4 U/mL,與對(duì)照組（21 768.8 U/mL）相比提高了28.8%。這是因?yàn)轳詈辖M中的細(xì)胞含量高于對(duì)照組,處于分泌期的細(xì)胞含量較多,且更換的培養(yǎng)基相較于對(duì)照組較少,細(xì)胞更易適應(yīng)新培養(yǎng)環(huán)境,減少因環(huán)境改變而發(fā)生的細(xì)胞表型變異。在第6 批次時(shí),多粘菌素E 產(chǎn)量大大減少甚至遠(yuǎn)低于第1 次發(fā)酵,是因?yàn)榧?xì)胞含量減少,且部分細(xì)胞在多次傳代中生產(chǎn)活性降低。發(fā)酵罐內(nèi)衰老菌體積累,芽孢逐漸增加,pH 值開始快速升高,不易控制,環(huán)境逐漸不利于產(chǎn)物合成。綜上,重復(fù)分批發(fā)酵在第6 批次時(shí)細(xì)胞干重和多粘菌素E 效價(jià)均大大降低,較對(duì)照組分別減少了7.5%和9.1%,在第6 批次后終止發(fā)酵。

6 個(gè)批次的對(duì)照組發(fā)酵液、耦合組發(fā)酵液和消泡液中多粘菌素E 效價(jià)對(duì)比見圖9。耦合組泡沫分離的富集比和回收率見表2。

表2 耦合組泡沫分離的富集比和回收率Table 2 Enrichment ratio and recovery rate of foam fractionation in coupling group

圖9 耦合組、對(duì)照組和消泡液中多粘菌素E 效價(jià)Fig.9 Titer of polymyxin E in coupling group，control group，and defoamer

由圖9 可知,在產(chǎn)量最高的第4 批次對(duì)照組中的多粘菌素E 效價(jià)為21 768.8 U/mL,耦合組中多粘菌素E效價(jià)為28 034.4 U/mL,消泡液中多粘菌素E 效價(jià)為133 706.1 U/mL。由表2 可知,在第4 批次多粘菌素E的富集比為4.77,回收率為82.5%。第1、2 批次與第6 批次之間,第4 批次與第5 批次之間不存在顯著差異,其余批次間均存在顯著差異,不同批次富集比較為接近,在第5 批次達(dá)到最高值。不同批次回收率較為接近,其中第1、2 批次與第6 批次之間無顯著差異,第3 批次與第4 批次之間差異顯著（P<0.05）,回收率在第4 批次達(dá)到最高。重復(fù)分批發(fā)酵耦合泡沫分離不僅提高了多粘菌素E 的產(chǎn)量還對(duì)多粘菌素E 進(jìn)行了初步濃縮,有利于多粘菌素E 的分離利用。

3 結(jié)論

本文開發(fā)了重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離相結(jié)合生產(chǎn)多粘菌素E 的工藝,并考察了吐溫80 的加入對(duì)多粘菌素E 效價(jià)和細(xì)胞干重的影響。對(duì)操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)結(jié)果表明,發(fā)酵液最適置換比例為70%,置換時(shí)間分別為初次發(fā)酵的第36 小時(shí)和置換后發(fā)酵的第12 小時(shí),置換后發(fā)酵時(shí)間縮短為初次發(fā)酵的三分之一。吐溫80 的最適添加量為0.15%,添加時(shí)間分別為初次發(fā)酵的第24 小時(shí)和置換后發(fā)酵的第6 小時(shí),多粘菌素E效價(jià)為21 245.3 U/mL,較對(duì)照組（19 123.1 U/mL）提高了11%。泡沫分離的最適氣體體積流量為80 mL/min。將重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離耦合在最佳條件下,可發(fā)酵6 個(gè)批次,多粘菌素E 效價(jià)分別為19 397.43、21 599.1、25 446.1、28 034.4、20 449.2、17 638.0 U/mL,均高于對(duì)照組,在耦合過程中富集比和回收率分別保持在4.7 和80%左右。結(jié)果表明,重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離相結(jié)合生產(chǎn)多粘菌素E,既提高了產(chǎn)率又達(dá)到了多粘菌素E 的濃縮分離。重復(fù)分批發(fā)酵與泡沫分離相結(jié)合生產(chǎn)多粘菌素E 有利于長期生產(chǎn)性能的提高,對(duì)多粘菌素E 的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。