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    淺析細胞治療產(chǎn)品中滋養(yǎng)細胞的使用及控制策略

    2024-05-06 02:37:32尹慧芳
    中國食品藥品監(jiān)管 2024年2期
    關(guān)鍵詞:基因修飾細胞系病毒

    尹慧芳

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評檢查長三角分中心

    徐隆昌

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

    邱曉

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    陳愛萍

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評檢查長三角分中心

    韋薇*

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

    細胞的生長需要復雜的營養(yǎng)支持,其中包括多種已知和未知的可溶性及膜結(jié)合生長因子、受體等。部分細胞可通過在培養(yǎng)基中添加胞外基質(zhì)蛋白和生長因子以滿足細胞生長所需條件,但某些類型的細胞生長和增殖則需要依賴于與其他細胞,例如滋養(yǎng)細胞的物理接觸,此時,滋養(yǎng)細胞在一定程度上可提供培養(yǎng)基以外的細胞生長所需的必要條件[1]。滋養(yǎng)細胞通常為經(jīng)適當處理后,自身不能分裂和增殖,但通過細胞與細胞間相互作用或分泌一定的營養(yǎng)物質(zhì),用以支持其他細胞生長、擴增的一類細胞[1]。滋養(yǎng)細胞主要有兩方面的作用:旁分泌相互作用(paracrine interactions)、近 分泌和物理相互作用(juxtacrine and physical interactions)。旁分泌即分泌一系列的生長因子及細胞因子以促進目的細胞的生長,最終可以通過在培養(yǎng)基中添加重組蛋白進行取代。近分泌和物理相互作用則必須依賴于滋養(yǎng)細胞的存在,因為其需要細胞與細胞的接觸來介導近分泌信號通路及機械巢效應(yīng)(mechanical nest effects)[1]。此外,滋養(yǎng)細胞還能消除培養(yǎng)基毒性物質(zhì)和抑制因子,合成胞外基質(zhì)蛋白以調(diào)控目的細胞生長并作為細胞附著的基質(zhì)[1]。

    目前,雖然有相關(guān)技術(shù)指導原則提及滋養(yǎng)細胞,但均為概括性指導,對滋養(yǎng)細胞的使用和控制方面尚無專門的技術(shù)指南。為了幫助此類產(chǎn)品的開發(fā)和技術(shù)評價,本文基于當前認知并結(jié)合最新研究進展,以基因編輯的人慢性髓系白血病細胞(K562 細胞)為例,結(jié)合相關(guān)指導原則和審評經(jīng)驗,對細胞系來源的滋養(yǎng)細胞的制備、使用及控制策略進行了探討,以期為行業(yè)的發(fā)展和監(jiān)管措施的完善提供借鑒與思路。

    一、使用和申報情況概述

    滋養(yǎng)細胞因能促進目的細胞的擴增,已經(jīng)被應(yīng)用于自然殺傷(natural killer,NK)細 胞、腫瘤浸潤淋巴(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)細胞等的體外擴增,并取得了良好的增殖效果。目前,滋養(yǎng)細胞主要包括:外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)及一些腫瘤來源的細胞系,例如人多發(fā)性骨髓瘤外周 血B 淋巴細 胞(RPMI8866細胞)、EB 病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞系(Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell line,EBV-LCL)、K562 細 胞、人B淋巴母細胞樣細胞系(human B-lymphoblastoid cell line)721.221、人T 淋巴細胞白血病細胞(Jurkat)等[2-5]。其中,基因編輯的K562 細胞因其良好的促進增殖作用而被廣泛研究和使用。研究表明使用基因編輯的K562 細胞作為滋養(yǎng)細胞能使NK細胞的擴增效率提高幾十到上萬倍[3-7]。

    目前,國際上已有多款使用滋養(yǎng)細胞生產(chǎn)的NK 細胞和iPSC-NK 細胞產(chǎn)品獲批進入臨床試驗。我國也有使用滋養(yǎng)細胞的細胞治療產(chǎn)品申請溝通交流或者獲批進入臨床試驗,主要集中在TIL 細 胞、NK 細胞及iPSCNK 細胞領(lǐng)域。

    基于滋養(yǎng)細胞可能引入的外源因子污染、成瘤性和致瘤性風險,基因編輯的滋養(yǎng)細胞可能帶來的基因修飾系統(tǒng)殘留風險和可復制性病毒風險以及殘留檢測的復雜性,一般應(yīng)盡可能避免使用滋養(yǎng)細胞,如必須使用,則滋養(yǎng)細胞應(yīng)進行殘留量檢測,以控制相關(guān)風險。因此,在研發(fā)早期,需要充分評估使用滋養(yǎng)細胞的必要性,遵循非必要不使用的原則,并積極探尋其他替代物或替代來源以減少滋養(yǎng)細胞可能帶來的風險。但由于某些種類的細胞只有在滋養(yǎng)細胞存在時才能實現(xiàn)有效激活和增殖,且當前無其他可比擬的替代物,因此,在某些情況下,滋養(yǎng)細胞的使用尚存在一定的必要性。

    二、審評考慮

    1.起始細胞

    起始細胞是用來生產(chǎn)滋養(yǎng)細胞的起始原材料,對滋養(yǎng)細胞的質(zhì)量至關(guān)重要。例如,K562 為人慢性髓系白血病細胞系,為了保證起始原材料的安全性,細胞來源應(yīng)清晰可追溯。根據(jù)細胞系的來源、歷史培養(yǎng)和改造信息分析細胞系的適用性,還需關(guān)注歷史培養(yǎng)過程中可能的污染或引入的牛源性病毒、豬源性病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、人源性病毒的風險。在細胞篩選階段或后續(xù)的建庫階段都應(yīng)參考2020 年版《中國藥典》的要求進行全面檢定,以綜合判斷細胞的適用性。

    2.工程細胞株的構(gòu)建和建庫

    K562 細胞表面表達的膜結(jié)合白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)可以極大地促進K562細胞的促增殖能力。研究表明,使用表達膜結(jié)合IL-15 的K562細胞進行培養(yǎng),21 天后,NK 細胞擴增了825 倍,與未增殖的NK 細胞相比,NK 細胞端??s短,在第24~42 天衰老并失去增殖能力;使用表達膜結(jié)合IL-21的K562 細胞進行培養(yǎng),21 天后,NK 細胞擴增了47697 倍,與未增殖的NK 細胞相比,NK 細胞端粒變長,在第42 天仍然維持著增殖能力[7]。不同修飾的滋養(yǎng)細胞不僅在促增殖能力方面存在差異,還可能會影響細胞終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此,應(yīng)在構(gòu)建細胞株之初就評估其對細胞終產(chǎn)品可能產(chǎn)生的影響,以構(gòu)建符合需求的工程細胞株。當前,通常使用基因修飾系統(tǒng)導入膜結(jié)合的IL-15(mbIL-15)/膜結(jié)合的IL-21(mbIL-21)、4-1BBL[2,7-8],或者結(jié)合特定需求導入其他基因,或者進行基因敲除,以擴展滋養(yǎng)細胞的功能。

    常見可用于編輯K562 細胞的基因修飾系統(tǒng)一般包括病毒載體(慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)、質(zhì)粒DNA 或其他基因編輯工具等。由于各類基因修飾系統(tǒng)的差異,對編輯后K562 細胞質(zhì)量風險的影響可能不同。因此,除需要對細胞改造或修飾結(jié)果進行確認外,同時應(yīng)關(guān)注和評估基因修飾系統(tǒng)引入的風險,包括病毒載體可能引入的可復制病毒風險,轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在基因組中的移動風險等。

    為了保證滋養(yǎng)細胞的質(zhì)量可控和批間一致性,通常在經(jīng)過基因修飾后篩選單克隆細胞株,并建立細胞庫。此外,還應(yīng)結(jié)合篩選過程和相關(guān)檢測技術(shù)保證細胞的單克隆來源,單克隆細胞不僅能保證細胞的質(zhì)量均一性,還能為后續(xù)滋養(yǎng)細胞殘留檢測提供便利,并按照2020 年版《中國藥典》要求開展滋養(yǎng)細胞庫的檢定及穩(wěn)定性研究。在進行滋養(yǎng)細胞庫的檢定時內(nèi)外源病毒因子檢測應(yīng)關(guān)注種屬特異性病毒、生物來源物料可能引入的病毒。還應(yīng)結(jié)合單克隆篩選和細胞庫建庫對基因插入位點、轉(zhuǎn)基因元件拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因表達進行確認,并關(guān)注基因修飾系統(tǒng)殘留及基因修飾系統(tǒng)所引入的風險。

    3.生產(chǎn)工藝

    滋養(yǎng)細胞制備工藝流程可能包括細胞復蘇、培養(yǎng)、傳代擴增、細胞收獲、細胞滅活及凍存等工藝步驟。制備時應(yīng)控制生產(chǎn)過程中可能引入的風險,確保生產(chǎn)工藝能生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定、無增殖能力的滋養(yǎng)細胞。其中,細胞滅活工藝為關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前主要采用輻照法進行滅活。有研究表明,高能輻照可以在不影響細胞代謝的情況下抑制細胞分裂,是一種相對安全且高效的細胞滅活方法[1-2]。目前,常采用γ 輻照和X 射線進行處理。有研究比較了這兩種不同輻照方式處理的K562細胞對NK 細胞增殖的影響。該研究采用這兩種方式對K562 細胞進行處理,并在培養(yǎng)基中添加IL-12、IL-15 后 與PBMCs 共培養(yǎng)14 天。結(jié)果表明:與γ 輻照組相比,X 射線處理組NK 細胞增殖速度略低,NK 細胞純度相當。且X 射線處理與γ 輻照的K562 細胞均未出現(xiàn)自身擴增現(xiàn)象,單獨培養(yǎng)至第10 天細胞存活率約為16% 和13%;與NK 細胞共培養(yǎng)10 天后,K562 細胞殘留率均進一步下降到0.5%。擴增后的NK 細胞受體表達(CD16、CD 57、NKG 2A、NKG 2C、CD 8 a、NKp 30、NKp 46、CD62L、NKG2D 和DNAM-1)水平相近,同時也表現(xiàn)出相似水平的細胞毒性作用[9]。由此可知,不同的輻照處理方式可能對NK細胞增殖速度、純度、NK 細胞受體表達水平等產(chǎn)生影響,實際中建議根據(jù)產(chǎn)品需要和操作的可及性選擇適合的細胞滅活處理方式。

    為了確保滋養(yǎng)細胞無增殖能力,對輻照工藝進行研究十分必要,主要對輻照強度、輻照時間、細胞密度等指標進行研究以確定工藝參數(shù)。此外,將輻照后的滋養(yǎng)細胞冷凍保存后使用,既可以減少每次輻照處理所帶來的批次差異,也可以減少輻照操作的次數(shù),提高操作和使用的便利性,但需要開展研究以確認冷凍對細胞以及產(chǎn)品質(zhì)量的影響。有研究比較了凍存對K562 細胞本身及NK 細胞培養(yǎng)的影響,其將基因編輯的K562-mb15-41BBL 細胞進行100Gyγ輻照后保存于90%FBS+10% DMSO 凍存液中。與新鮮的輻照細胞相比,凍存的輻照細胞4-1BBL 配體表達水平相近,但膜結(jié)合的IL-15 表達水平稍低[8]。共培養(yǎng)21 天后,NK 細胞的增殖速度相近,NK細胞純度稍低。兩組NK 細胞的細胞毒性、受體表達(sCD16、NKG 2D、CD 69、NKp 30、NKp44、NKp46 和CD158b)及γ-干擾素釋放水平基本一致[8]。因此,實際中建議根據(jù)產(chǎn)品需求和相關(guān)操作選擇合適的工藝參數(shù)及保存方式。

    4.質(zhì)量研究和質(zhì)量控制

    通常滋養(yǎng)細胞需要進行外觀、鑒別、理化性質(zhì)(細胞數(shù)、細胞存活率)、純度(表達目的基因細胞比例)、活性(自身增殖能力、刺激細胞擴增能力)、安全性(無菌、支原體、內(nèi)毒素)、特定基因表達情況(如適用)及相關(guān)雜質(zhì)等研究。其中,自身增殖能力的研究建議選用定量方法,建立細胞存活率隨培養(yǎng)時間的變化曲線,以了解滋養(yǎng)細胞在輻照后的生長/存活變化情況,為后續(xù)使用提供支持性數(shù)據(jù)。對于基因編輯的滋養(yǎng)細胞,建議對導入基因的蛋白表達情況進行研究。細胞活性研究方面,可采用具有代表性的目的細胞樣本進行多批次研究,以了解滋養(yǎng)細胞對于不同供者來源/批次的目的細胞增殖能力的促進情況。雜質(zhì)研究方面,建議結(jié)合生產(chǎn)過程、細胞庫研究等制定合理的控制策略,還需要重點關(guān)注生物源性物料和基因編輯系統(tǒng)殘留及所引入的風險。此外,腫瘤組織來源的滋養(yǎng)細胞具有較高風險,建議應(yīng)進行體外和體內(nèi)的成瘤性和致瘤性研究,必要時可納入質(zhì)量標準。除此之外,還建議對每批次的滋養(yǎng)細胞進行放行檢測,確保滿足質(zhì)量標準及無外源因子污染,必要時還應(yīng)建立滋養(yǎng)細胞對照品以盡量減少批次間的差異。

    5.滋養(yǎng)細胞的使用和控制策略

    根 據(jù)2020 年 版《中國藥典》要求,滋養(yǎng)細胞屬于風險等級最高的原材料;在《美國藥典》(United States Pharmacopoeia)中,滋養(yǎng)細胞也屬于風險等級最高的輔助原材料[10]。因此,應(yīng)謹慎使用滋養(yǎng)細胞,并進行嚴格控制。在研發(fā)早期需評估使用滋養(yǎng)細胞的必要性,尋找其他替代物或替代來源,并對生產(chǎn)過程中滋養(yǎng)細胞的使用量進行研究,以期用最少的添加量生產(chǎn)出符合預(yù)期產(chǎn)量和效果的細胞產(chǎn)品。此外,還建議在生產(chǎn)過程中適當步驟對滋養(yǎng)細胞的殘留進行定量研究,以了解滋養(yǎng)細胞被去除、降解或者被細胞利用的趨勢。盡管K562細胞經(jīng)過輻照處理,且易被生長的NK 細胞殺死,但仍需確保細胞終產(chǎn)品中盡可能沒有滋養(yǎng)細胞殘留,以保障患者安全。建議研究人員開發(fā)靈敏度高的檢測方法,例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測法[11]、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)檢測法等,并對檢測方法進行專屬性、準確性、精密度、檢測限等驗證,以保證檢測方法能對生產(chǎn)過程及終產(chǎn)品進行有效表征,減少對產(chǎn)品質(zhì)量、臨床療效及安全性的影響。鑒于K562 細胞為腫瘤來源細胞系,還需關(guān)注其可能攜帶的致癌基因的風險控制,并對明確具有致癌性的基因進行殘留檢測。另外,對終產(chǎn)品的成瘤性進行研究時,還需要根據(jù)研究結(jié)果考慮其是否應(yīng)納入質(zhì)量標準進行控制。

    三、研究展望

    NK 細胞因其來源的多樣性和低免疫原性,易被開發(fā)為通用型細胞產(chǎn)品從而極大地降低治療費用,成為近年來研究和開發(fā)的熱點。NK 細胞常見的擴增和激活方式就是利用滋養(yǎng)細胞進行培養(yǎng),為此,本文結(jié)合當前研究進展,對滋養(yǎng)細胞的研究進行了展望。首先,是滋養(yǎng)細胞來源。K562 來源細胞可以作為滋養(yǎng)細胞,也有研究采用前列腺癌來源的細胞系PC3PSCA 或者來源于T 淋巴細胞系細胞作為滋養(yǎng)細胞[12-13]??刂谱甜B(yǎng)細胞的來源,并對其培養(yǎng)歷史進行充分的風險控制,可增加其使用的安全性。其次,是滋養(yǎng)細胞的改造研究。目前通常使用基因修飾系統(tǒng)導入膜結(jié)合的IL-15(mbIL-15)/膜結(jié)合 的IL-21(mbIL-21)、4-1BBL 以增強K562 細胞的 促進增殖能力[2,7-8]。未來還會有更多導入其他基因或者進行基因敲除的研究以滿足對滋養(yǎng)細胞的特定需求,或者進一步提升其促進增殖的能力以實現(xiàn)使用盡量少的滋養(yǎng)細胞達到預(yù)期效果,或者通過基因編輯實現(xiàn)滋養(yǎng)細胞自失活。再次,是滋養(yǎng)細胞的生產(chǎn)工藝研究。已有的相關(guān)研究主要為采用X 射線處理替代γ 輻照進行滋養(yǎng)細胞滅活[9],以及用凍存的輻照細胞代替新鮮輻照細胞進行生產(chǎn)[8],此類研究能夠提高滋養(yǎng)細胞的質(zhì)量可控性及批間一致性。最后,是滋養(yǎng)細胞的替代研究。替代研究可以分為多個階段或?qū)哟?,例如用細胞系細胞或基因編輯的細胞系細胞(如K562 細胞)代替PBMCs 用于TIL 細胞的培養(yǎng)和增殖,以減少不同來源的PBMCs帶來的差異性及提高檢測的便利性[14];從滋養(yǎng)細胞中(如K562.mbIL21.4-1BBL)提取膜顆粒用于細胞(如NK 細胞)的擴增,以克服滋養(yǎng)細胞可能帶來的污染和風險[15]。滋養(yǎng)細胞的替代研究能夠極大地降低使用滋養(yǎng)細胞所帶來的風險。

    四、結(jié)語

    滋養(yǎng)細胞已被研究應(yīng)用于細胞治療產(chǎn)品的培養(yǎng)中,筆者建議開發(fā)者在研發(fā)早期評估使用滋養(yǎng)細胞的必要性,遵循非必要不使用的原則,積極尋找其他替代物或替代來源以減少滋養(yǎng)細胞的使用。如必須使用滋養(yǎng)細胞,則需進行嚴格的控制和檢測,以控制原材料和生產(chǎn)過程中可能引入的風險,包括挑選單克隆細胞株建立細胞庫,對滋養(yǎng)細胞的滅活進行研究,確保滋養(yǎng)細胞自身無增殖能力,并對滋養(yǎng)細胞的使用比例、自身增殖能力及對目的細胞的促增殖能力進行研究等。在細胞產(chǎn)品的整個生產(chǎn)過程中需對殘留的滋養(yǎng)細胞或相關(guān)的風險基因以及蛋白殘留進行表征和定量研究,以了解滋養(yǎng)細胞被去除、降解或者被細胞利用的趨勢。同時還需開發(fā)適當?shù)臍埩魳藴屎蜋z測方法以保證對過程及細胞終產(chǎn)品的有效表征,減少或者消除滋養(yǎng)細胞對產(chǎn)品質(zhì)量和安全性可能產(chǎn)生影響。

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