• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    淺析細胞治療產(chǎn)品中滋養(yǎng)細胞的使用及控制策略

    2024-05-06 02:37:32尹慧芳
    中國食品藥品監(jiān)管 2024年2期
    關(guān)鍵詞:基因修飾細胞系病毒

    尹慧芳

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評檢查長三角分中心

    徐隆昌

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

    邱曉

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

    陳愛萍

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評檢查長三角分中心

    韋薇*

    國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

    細胞的生長需要復雜的營養(yǎng)支持,其中包括多種已知和未知的可溶性及膜結(jié)合生長因子、受體等。部分細胞可通過在培養(yǎng)基中添加胞外基質(zhì)蛋白和生長因子以滿足細胞生長所需條件,但某些類型的細胞生長和增殖則需要依賴于與其他細胞,例如滋養(yǎng)細胞的物理接觸,此時,滋養(yǎng)細胞在一定程度上可提供培養(yǎng)基以外的細胞生長所需的必要條件[1]。滋養(yǎng)細胞通常為經(jīng)適當處理后,自身不能分裂和增殖,但通過細胞與細胞間相互作用或分泌一定的營養(yǎng)物質(zhì),用以支持其他細胞生長、擴增的一類細胞[1]。滋養(yǎng)細胞主要有兩方面的作用:旁分泌相互作用(paracrine interactions)、近 分泌和物理相互作用(juxtacrine and physical interactions)。旁分泌即分泌一系列的生長因子及細胞因子以促進目的細胞的生長,最終可以通過在培養(yǎng)基中添加重組蛋白進行取代。近分泌和物理相互作用則必須依賴于滋養(yǎng)細胞的存在,因為其需要細胞與細胞的接觸來介導近分泌信號通路及機械巢效應(yīng)(mechanical nest effects)[1]。此外,滋養(yǎng)細胞還能消除培養(yǎng)基毒性物質(zhì)和抑制因子,合成胞外基質(zhì)蛋白以調(diào)控目的細胞生長并作為細胞附著的基質(zhì)[1]。

    目前,雖然有相關(guān)技術(shù)指導原則提及滋養(yǎng)細胞,但均為概括性指導,對滋養(yǎng)細胞的使用和控制方面尚無專門的技術(shù)指南。為了幫助此類產(chǎn)品的開發(fā)和技術(shù)評價,本文基于當前認知并結(jié)合最新研究進展,以基因編輯的人慢性髓系白血病細胞(K562 細胞)為例,結(jié)合相關(guān)指導原則和審評經(jīng)驗,對細胞系來源的滋養(yǎng)細胞的制備、使用及控制策略進行了探討,以期為行業(yè)的發(fā)展和監(jiān)管措施的完善提供借鑒與思路。

    一、使用和申報情況概述

    滋養(yǎng)細胞因能促進目的細胞的擴增,已經(jīng)被應(yīng)用于自然殺傷(natural killer,NK)細 胞、腫瘤浸潤淋巴(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)細胞等的體外擴增,并取得了良好的增殖效果。目前,滋養(yǎng)細胞主要包括:外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)及一些腫瘤來源的細胞系,例如人多發(fā)性骨髓瘤外周 血B 淋巴細 胞(RPMI8866細胞)、EB 病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞系(Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell line,EBV-LCL)、K562 細 胞、人B淋巴母細胞樣細胞系(human B-lymphoblastoid cell line)721.221、人T 淋巴細胞白血病細胞(Jurkat)等[2-5]。其中,基因編輯的K562 細胞因其良好的促進增殖作用而被廣泛研究和使用。研究表明使用基因編輯的K562 細胞作為滋養(yǎng)細胞能使NK細胞的擴增效率提高幾十到上萬倍[3-7]。

    目前,國際上已有多款使用滋養(yǎng)細胞生產(chǎn)的NK 細胞和iPSC-NK 細胞產(chǎn)品獲批進入臨床試驗。我國也有使用滋養(yǎng)細胞的細胞治療產(chǎn)品申請溝通交流或者獲批進入臨床試驗,主要集中在TIL 細 胞、NK 細胞及iPSCNK 細胞領(lǐng)域。

    基于滋養(yǎng)細胞可能引入的外源因子污染、成瘤性和致瘤性風險,基因編輯的滋養(yǎng)細胞可能帶來的基因修飾系統(tǒng)殘留風險和可復制性病毒風險以及殘留檢測的復雜性,一般應(yīng)盡可能避免使用滋養(yǎng)細胞,如必須使用,則滋養(yǎng)細胞應(yīng)進行殘留量檢測,以控制相關(guān)風險。因此,在研發(fā)早期,需要充分評估使用滋養(yǎng)細胞的必要性,遵循非必要不使用的原則,并積極探尋其他替代物或替代來源以減少滋養(yǎng)細胞可能帶來的風險。但由于某些種類的細胞只有在滋養(yǎng)細胞存在時才能實現(xiàn)有效激活和增殖,且當前無其他可比擬的替代物,因此,在某些情況下,滋養(yǎng)細胞的使用尚存在一定的必要性。

    二、審評考慮

    1.起始細胞

    起始細胞是用來生產(chǎn)滋養(yǎng)細胞的起始原材料,對滋養(yǎng)細胞的質(zhì)量至關(guān)重要。例如,K562 為人慢性髓系白血病細胞系,為了保證起始原材料的安全性,細胞來源應(yīng)清晰可追溯。根據(jù)細胞系的來源、歷史培養(yǎng)和改造信息分析細胞系的適用性,還需關(guān)注歷史培養(yǎng)過程中可能的污染或引入的牛源性病毒、豬源性病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、人源性病毒的風險。在細胞篩選階段或后續(xù)的建庫階段都應(yīng)參考2020 年版《中國藥典》的要求進行全面檢定,以綜合判斷細胞的適用性。

    2.工程細胞株的構(gòu)建和建庫

    K562 細胞表面表達的膜結(jié)合白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)可以極大地促進K562細胞的促增殖能力。研究表明,使用表達膜結(jié)合IL-15 的K562細胞進行培養(yǎng),21 天后,NK 細胞擴增了825 倍,與未增殖的NK 細胞相比,NK 細胞端??s短,在第24~42 天衰老并失去增殖能力;使用表達膜結(jié)合IL-21的K562 細胞進行培養(yǎng),21 天后,NK 細胞擴增了47697 倍,與未增殖的NK 細胞相比,NK 細胞端粒變長,在第42 天仍然維持著增殖能力[7]。不同修飾的滋養(yǎng)細胞不僅在促增殖能力方面存在差異,還可能會影響細胞終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此,應(yīng)在構(gòu)建細胞株之初就評估其對細胞終產(chǎn)品可能產(chǎn)生的影響,以構(gòu)建符合需求的工程細胞株。當前,通常使用基因修飾系統(tǒng)導入膜結(jié)合的IL-15(mbIL-15)/膜結(jié)合的IL-21(mbIL-21)、4-1BBL[2,7-8],或者結(jié)合特定需求導入其他基因,或者進行基因敲除,以擴展滋養(yǎng)細胞的功能。

    常見可用于編輯K562 細胞的基因修飾系統(tǒng)一般包括病毒載體(慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)、質(zhì)粒DNA 或其他基因編輯工具等。由于各類基因修飾系統(tǒng)的差異,對編輯后K562 細胞質(zhì)量風險的影響可能不同。因此,除需要對細胞改造或修飾結(jié)果進行確認外,同時應(yīng)關(guān)注和評估基因修飾系統(tǒng)引入的風險,包括病毒載體可能引入的可復制病毒風險,轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在基因組中的移動風險等。

    為了保證滋養(yǎng)細胞的質(zhì)量可控和批間一致性,通常在經(jīng)過基因修飾后篩選單克隆細胞株,并建立細胞庫。此外,還應(yīng)結(jié)合篩選過程和相關(guān)檢測技術(shù)保證細胞的單克隆來源,單克隆細胞不僅能保證細胞的質(zhì)量均一性,還能為后續(xù)滋養(yǎng)細胞殘留檢測提供便利,并按照2020 年版《中國藥典》要求開展滋養(yǎng)細胞庫的檢定及穩(wěn)定性研究。在進行滋養(yǎng)細胞庫的檢定時內(nèi)外源病毒因子檢測應(yīng)關(guān)注種屬特異性病毒、生物來源物料可能引入的病毒。還應(yīng)結(jié)合單克隆篩選和細胞庫建庫對基因插入位點、轉(zhuǎn)基因元件拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因表達進行確認,并關(guān)注基因修飾系統(tǒng)殘留及基因修飾系統(tǒng)所引入的風險。

    3.生產(chǎn)工藝

    滋養(yǎng)細胞制備工藝流程可能包括細胞復蘇、培養(yǎng)、傳代擴增、細胞收獲、細胞滅活及凍存等工藝步驟。制備時應(yīng)控制生產(chǎn)過程中可能引入的風險,確保生產(chǎn)工藝能生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定、無增殖能力的滋養(yǎng)細胞。其中,細胞滅活工藝為關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前主要采用輻照法進行滅活。有研究表明,高能輻照可以在不影響細胞代謝的情況下抑制細胞分裂,是一種相對安全且高效的細胞滅活方法[1-2]。目前,常采用γ 輻照和X 射線進行處理。有研究比較了這兩種不同輻照方式處理的K562細胞對NK 細胞增殖的影響。該研究采用這兩種方式對K562 細胞進行處理,并在培養(yǎng)基中添加IL-12、IL-15 后 與PBMCs 共培養(yǎng)14 天。結(jié)果表明:與γ 輻照組相比,X 射線處理組NK 細胞增殖速度略低,NK 細胞純度相當。且X 射線處理與γ 輻照的K562 細胞均未出現(xiàn)自身擴增現(xiàn)象,單獨培養(yǎng)至第10 天細胞存活率約為16% 和13%;與NK 細胞共培養(yǎng)10 天后,K562 細胞殘留率均進一步下降到0.5%。擴增后的NK 細胞受體表達(CD16、CD 57、NKG 2A、NKG 2C、CD 8 a、NKp 30、NKp 46、CD62L、NKG2D 和DNAM-1)水平相近,同時也表現(xiàn)出相似水平的細胞毒性作用[9]。由此可知,不同的輻照處理方式可能對NK細胞增殖速度、純度、NK 細胞受體表達水平等產(chǎn)生影響,實際中建議根據(jù)產(chǎn)品需要和操作的可及性選擇適合的細胞滅活處理方式。

    為了確保滋養(yǎng)細胞無增殖能力,對輻照工藝進行研究十分必要,主要對輻照強度、輻照時間、細胞密度等指標進行研究以確定工藝參數(shù)。此外,將輻照后的滋養(yǎng)細胞冷凍保存后使用,既可以減少每次輻照處理所帶來的批次差異,也可以減少輻照操作的次數(shù),提高操作和使用的便利性,但需要開展研究以確認冷凍對細胞以及產(chǎn)品質(zhì)量的影響。有研究比較了凍存對K562 細胞本身及NK 細胞培養(yǎng)的影響,其將基因編輯的K562-mb15-41BBL 細胞進行100Gyγ輻照后保存于90%FBS+10% DMSO 凍存液中。與新鮮的輻照細胞相比,凍存的輻照細胞4-1BBL 配體表達水平相近,但膜結(jié)合的IL-15 表達水平稍低[8]。共培養(yǎng)21 天后,NK 細胞的增殖速度相近,NK細胞純度稍低。兩組NK 細胞的細胞毒性、受體表達(sCD16、NKG 2D、CD 69、NKp 30、NKp44、NKp46 和CD158b)及γ-干擾素釋放水平基本一致[8]。因此,實際中建議根據(jù)產(chǎn)品需求和相關(guān)操作選擇合適的工藝參數(shù)及保存方式。

    4.質(zhì)量研究和質(zhì)量控制

    通常滋養(yǎng)細胞需要進行外觀、鑒別、理化性質(zhì)(細胞數(shù)、細胞存活率)、純度(表達目的基因細胞比例)、活性(自身增殖能力、刺激細胞擴增能力)、安全性(無菌、支原體、內(nèi)毒素)、特定基因表達情況(如適用)及相關(guān)雜質(zhì)等研究。其中,自身增殖能力的研究建議選用定量方法,建立細胞存活率隨培養(yǎng)時間的變化曲線,以了解滋養(yǎng)細胞在輻照后的生長/存活變化情況,為后續(xù)使用提供支持性數(shù)據(jù)。對于基因編輯的滋養(yǎng)細胞,建議對導入基因的蛋白表達情況進行研究。細胞活性研究方面,可采用具有代表性的目的細胞樣本進行多批次研究,以了解滋養(yǎng)細胞對于不同供者來源/批次的目的細胞增殖能力的促進情況。雜質(zhì)研究方面,建議結(jié)合生產(chǎn)過程、細胞庫研究等制定合理的控制策略,還需要重點關(guān)注生物源性物料和基因編輯系統(tǒng)殘留及所引入的風險。此外,腫瘤組織來源的滋養(yǎng)細胞具有較高風險,建議應(yīng)進行體外和體內(nèi)的成瘤性和致瘤性研究,必要時可納入質(zhì)量標準。除此之外,還建議對每批次的滋養(yǎng)細胞進行放行檢測,確保滿足質(zhì)量標準及無外源因子污染,必要時還應(yīng)建立滋養(yǎng)細胞對照品以盡量減少批次間的差異。

    5.滋養(yǎng)細胞的使用和控制策略

    根 據(jù)2020 年 版《中國藥典》要求,滋養(yǎng)細胞屬于風險等級最高的原材料;在《美國藥典》(United States Pharmacopoeia)中,滋養(yǎng)細胞也屬于風險等級最高的輔助原材料[10]。因此,應(yīng)謹慎使用滋養(yǎng)細胞,并進行嚴格控制。在研發(fā)早期需評估使用滋養(yǎng)細胞的必要性,尋找其他替代物或替代來源,并對生產(chǎn)過程中滋養(yǎng)細胞的使用量進行研究,以期用最少的添加量生產(chǎn)出符合預(yù)期產(chǎn)量和效果的細胞產(chǎn)品。此外,還建議在生產(chǎn)過程中適當步驟對滋養(yǎng)細胞的殘留進行定量研究,以了解滋養(yǎng)細胞被去除、降解或者被細胞利用的趨勢。盡管K562細胞經(jīng)過輻照處理,且易被生長的NK 細胞殺死,但仍需確保細胞終產(chǎn)品中盡可能沒有滋養(yǎng)細胞殘留,以保障患者安全。建議研究人員開發(fā)靈敏度高的檢測方法,例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測法[11]、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)檢測法等,并對檢測方法進行專屬性、準確性、精密度、檢測限等驗證,以保證檢測方法能對生產(chǎn)過程及終產(chǎn)品進行有效表征,減少對產(chǎn)品質(zhì)量、臨床療效及安全性的影響。鑒于K562 細胞為腫瘤來源細胞系,還需關(guān)注其可能攜帶的致癌基因的風險控制,并對明確具有致癌性的基因進行殘留檢測。另外,對終產(chǎn)品的成瘤性進行研究時,還需要根據(jù)研究結(jié)果考慮其是否應(yīng)納入質(zhì)量標準進行控制。

    三、研究展望

    NK 細胞因其來源的多樣性和低免疫原性,易被開發(fā)為通用型細胞產(chǎn)品從而極大地降低治療費用,成為近年來研究和開發(fā)的熱點。NK 細胞常見的擴增和激活方式就是利用滋養(yǎng)細胞進行培養(yǎng),為此,本文結(jié)合當前研究進展,對滋養(yǎng)細胞的研究進行了展望。首先,是滋養(yǎng)細胞來源。K562 來源細胞可以作為滋養(yǎng)細胞,也有研究采用前列腺癌來源的細胞系PC3PSCA 或者來源于T 淋巴細胞系細胞作為滋養(yǎng)細胞[12-13]??刂谱甜B(yǎng)細胞的來源,并對其培養(yǎng)歷史進行充分的風險控制,可增加其使用的安全性。其次,是滋養(yǎng)細胞的改造研究。目前通常使用基因修飾系統(tǒng)導入膜結(jié)合的IL-15(mbIL-15)/膜結(jié)合 的IL-21(mbIL-21)、4-1BBL 以增強K562 細胞的 促進增殖能力[2,7-8]。未來還會有更多導入其他基因或者進行基因敲除的研究以滿足對滋養(yǎng)細胞的特定需求,或者進一步提升其促進增殖的能力以實現(xiàn)使用盡量少的滋養(yǎng)細胞達到預(yù)期效果,或者通過基因編輯實現(xiàn)滋養(yǎng)細胞自失活。再次,是滋養(yǎng)細胞的生產(chǎn)工藝研究。已有的相關(guān)研究主要為采用X 射線處理替代γ 輻照進行滋養(yǎng)細胞滅活[9],以及用凍存的輻照細胞代替新鮮輻照細胞進行生產(chǎn)[8],此類研究能夠提高滋養(yǎng)細胞的質(zhì)量可控性及批間一致性。最后,是滋養(yǎng)細胞的替代研究。替代研究可以分為多個階段或?qū)哟?,例如用細胞系細胞或基因編輯的細胞系細胞(如K562 細胞)代替PBMCs 用于TIL 細胞的培養(yǎng)和增殖,以減少不同來源的PBMCs帶來的差異性及提高檢測的便利性[14];從滋養(yǎng)細胞中(如K562.mbIL21.4-1BBL)提取膜顆粒用于細胞(如NK 細胞)的擴增,以克服滋養(yǎng)細胞可能帶來的污染和風險[15]。滋養(yǎng)細胞的替代研究能夠極大地降低使用滋養(yǎng)細胞所帶來的風險。

    四、結(jié)語

    滋養(yǎng)細胞已被研究應(yīng)用于細胞治療產(chǎn)品的培養(yǎng)中,筆者建議開發(fā)者在研發(fā)早期評估使用滋養(yǎng)細胞的必要性,遵循非必要不使用的原則,積極尋找其他替代物或替代來源以減少滋養(yǎng)細胞的使用。如必須使用滋養(yǎng)細胞,則需進行嚴格的控制和檢測,以控制原材料和生產(chǎn)過程中可能引入的風險,包括挑選單克隆細胞株建立細胞庫,對滋養(yǎng)細胞的滅活進行研究,確保滋養(yǎng)細胞自身無增殖能力,并對滋養(yǎng)細胞的使用比例、自身增殖能力及對目的細胞的促增殖能力進行研究等。在細胞產(chǎn)品的整個生產(chǎn)過程中需對殘留的滋養(yǎng)細胞或相關(guān)的風險基因以及蛋白殘留進行表征和定量研究,以了解滋養(yǎng)細胞被去除、降解或者被細胞利用的趨勢。同時還需開發(fā)適當?shù)臍埩魳藴屎蜋z測方法以保證對過程及細胞終產(chǎn)品的有效表征,減少或者消除滋養(yǎng)細胞對產(chǎn)品質(zhì)量和安全性可能產(chǎn)生影響。

    猜你喜歡
    基因修飾細胞系病毒
    器官異種移植展現(xiàn)長期存活率
    科學導報(2023年74期)2023-10-28 08:54:39
    從基因編輯看歐美對新型基因修飾生物技術(shù)的監(jiān)管及挑戰(zhàn)
    科學與社會(2023年3期)2023-10-24 07:31:28
    病毒
    感冒病毒大作戰(zhàn)
    幼兒園(2021年16期)2021-12-06 01:06:36
    Nurr1基因修飾胚胎中腦神經(jīng)干細胞移植治療帕金森病
    病毒,快滾開
    感冒病毒
    STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細胞系增殖與凋亡的影響
    抑制miR-31表達對胰腺癌Panc-1細胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
    E3泛素連接酶對卵巢癌細胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    免费av毛片视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 免费观看在线日韩| 亚洲综合色惰| 国产在视频线精品| 又爽又黄a免费视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品视频女| 日韩av免费高清视频| 国产精品久久久久久av不卡| 直男gayav资源| 搞女人的毛片| 国产一区二区三区av在线| 国产精品三级大全| 少妇人妻精品综合一区二区| 在线播放无遮挡| 91久久精品电影网| 色吧在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 婷婷色av中文字幕| 国产毛片a区久久久久| 亚洲自拍偷在线| 男女国产视频网站| 韩国高清视频一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产极品天堂在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产又色又爽无遮挡免| 国产亚洲5aaaaa淫片| 精品久久国产蜜桃| 秋霞在线观看毛片| 99re6热这里在线精品视频| 午夜福利在线在线| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品国产三级国产专区5o| av专区在线播放| 国产免费福利视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品无大码| 听说在线观看完整版免费高清| 最近的中文字幕免费完整| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 人人妻人人看人人澡| 久久影院123| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 男女国产视频网站| 亚洲,一卡二卡三卡| 毛片女人毛片| 国产成人精品一,二区| 99视频精品全部免费 在线| 精品久久久久久电影网| 亚洲最大成人手机在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产高潮美女av| 亚洲av福利一区| 日本欧美国产在线视频| 久久久a久久爽久久v久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色吧在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 人妻 亚洲 视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 午夜亚洲福利在线播放| 极品教师在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久ye,这里只有精品| 久久人人爽人人片av| 尾随美女入室| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 在线 av 中文字幕| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久久久九九精品影院| 成年女人在线观看亚洲视频 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 少妇的逼水好多| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一区二区三区精品91| 国产精品久久久久久精品电影| 2018国产大陆天天弄谢| 美女内射精品一级片tv| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品嫩草影院av在线观看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 国产免费又黄又爽又色| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久欧美国产精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产午夜福利久久久久久| 黑人高潮一二区| 在线 av 中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 在线观看免费高清a一片| 九九爱精品视频在线观看| av天堂中文字幕网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 五月天丁香电影| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久久久久久精品精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 成人毛片60女人毛片免费| 色哟哟·www| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲性久久影院| 亚洲精品成人久久久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 97在线人人人人妻| 久久久亚洲精品成人影院| 精品久久久久久久久av| 免费看av在线观看网站| 国产毛片a区久久久久| 久久久久久伊人网av| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产极品天堂在线| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久国产精品人妻一区二区| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲在久久综合| 尾随美女入室| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久女婷五月综合色啪小说 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 综合色丁香网| 精品人妻熟女av久视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩欧美精品v在线| 在线观看国产h片| 亚洲人与动物交配视频| 日韩视频在线欧美| 成年女人看的毛片在线观看| 日本免费在线观看一区| 欧美最新免费一区二区三区| 午夜日本视频在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品久久久久久电影网| 午夜激情久久久久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产黄a三级三级三级人| 国产视频首页在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品久久久精品久久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 一区二区三区精品91| 国产真实伦视频高清在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品福利在线免费观看| 美女主播在线视频| 亚洲怡红院男人天堂| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产男女内射视频| 深爱激情五月婷婷| 久久精品久久精品一区二区三区| 免费大片18禁| 亚洲色图综合在线观看| 在线观看免费高清a一片| 毛片女人毛片| 国产亚洲一区二区精品| 欧美成人午夜免费资源| 日本一本二区三区精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 97在线人人人人妻| 国产精品人妻久久久久久| 天天一区二区日本电影三级| 国产男女超爽视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 免费av不卡在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品,欧美精品| 国产极品天堂在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产老妇女一区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品偷伦视频观看了| 日本wwww免费看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲成人久久爱视频| 特大巨黑吊av在线直播| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 看黄色毛片网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 永久免费av网站大全| 免费观看a级毛片全部| 一级毛片电影观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 免费观看av网站的网址| 少妇被粗大猛烈的视频| 舔av片在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| videos熟女内射| 国产伦在线观看视频一区| 精品熟女少妇av免费看| av免费观看日本| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 欧美成人a在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久6这里有精品| 久久人人爽人人片av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 交换朋友夫妻互换小说| 国产男女内射视频| 少妇熟女欧美另类| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲怡红院男人天堂| 久久久久九九精品影院| 日本一本二区三区精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 久久久色成人| 伊人久久国产一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 日本wwww免费看| 久久97久久精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 色视频www国产| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品自拍成人| 欧美另类一区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲人成网站在线播| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩一本色道免费dvd| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产毛片在线视频| 一边亲一边摸免费视频| 观看免费一级毛片| 少妇人妻 视频| 亚洲精品第二区| 免费观看av网站的网址| 能在线免费看毛片的网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 少妇的逼好多水| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99久久精品国产国产毛片| 九草在线视频观看| 夫妻午夜视频| 国产色婷婷99| 中国三级夫妇交换| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩欧美精品v在线| 简卡轻食公司| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久久久午夜电影| 免费少妇av软件| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美3d第一页| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 五月天丁香电影| av天堂中文字幕网| 六月丁香七月| 大香蕉久久网| 天美传媒精品一区二区| 国产伦在线观看视频一区| 一级a做视频免费观看| 国产在线一区二区三区精| 只有这里有精品99| 少妇人妻精品综合一区二区| 午夜福利高清视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产欧美亚洲国产| 婷婷色综合大香蕉| 日韩一区二区三区影片| 久久久亚洲精品成人影院| 国产亚洲精品久久久com| h日本视频在线播放| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 99久久精品一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜日本视频在线| 亚洲精品第二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 嫩草影院入口| 看免费成人av毛片| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产亚洲最大av| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产在线一区二区三区精| 日韩中字成人| 91精品国产九色| 亚洲真实伦在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| av.在线天堂| 91精品伊人久久大香线蕉| 十八禁网站网址无遮挡 | 777米奇影视久久| av黄色大香蕉| 中国三级夫妇交换| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲av成人精品一二三区| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 老司机影院成人| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品第二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产男女超爽视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 免费av不卡在线播放| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产成人freesex在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 日本一本二区三区精品| 亚洲av福利一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 美女国产视频在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久网色| 国产老妇女一区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品久久精品一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 大片免费播放器 马上看| 久久久久国产网址| 欧美成人a在线观看| 色综合色国产| 亚洲高清免费不卡视频| 九九在线视频观看精品| 能在线免费看毛片的网站| av天堂中文字幕网| 男插女下体视频免费在线播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美性感艳星| 欧美人与善性xxx| 超碰av人人做人人爽久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 有码 亚洲区| a级一级毛片免费在线观看| 在线观看三级黄色| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲内射少妇av| 国产欧美日韩精品一区二区| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品国产av在线观看| 男女国产视频网站| 亚洲,欧美,日韩| 一级二级三级毛片免费看| 18+在线观看网站| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本av手机在线免费观看| 伦精品一区二区三区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜福利视频精品| 熟女电影av网| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩av在线免费看完整版不卡| 水蜜桃什么品种好| 2022亚洲国产成人精品| 日本黄色片子视频| 日本午夜av视频| 国产精品蜜桃在线观看| www.色视频.com| videos熟女内射| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| av一本久久久久| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费av不卡在线播放| 一本久久精品| 国产免费一级a男人的天堂| 黄色视频在线播放观看不卡| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久人人爽人人片av| av播播在线观看一区| 国产v大片淫在线免费观看| 五月伊人婷婷丁香| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产日韩欧美在线精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美日本视频| 午夜免费鲁丝| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜福利视频1000在线观看| 久久热精品热| 免费看日本二区| 少妇人妻 视频| 在线观看人妻少妇| 久久久久久国产a免费观看| 18+在线观看网站| 视频中文字幕在线观看| 黄色日韩在线| 成年人午夜在线观看视频| 日韩av不卡免费在线播放| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 丝袜喷水一区| 有码 亚洲区| 日韩成人伦理影院| 男男h啪啪无遮挡| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国产一区二区在线观看日韩| 国产大屁股一区二区在线视频| 一本色道久久久久久精品综合| 在线观看一区二区三区激情| 麻豆国产97在线/欧美| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 嫩草影院新地址| 成人免费观看视频高清| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在现免费观看毛片| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人一区二区视频在线观看| 草草在线视频免费看| 亚洲精品国产av蜜桃| 成人黄色视频免费在线看| 久热久热在线精品观看| 国产精品无大码| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美精品一区二区大全| 国产片特级美女逼逼视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 嫩草影院入口| 亚洲综合色惰| 老司机影院成人| 少妇高潮的动态图| 国产成人精品婷婷| 久久久久性生活片| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 亚洲精品456在线播放app| 在线天堂最新版资源| 久久97久久精品| 国产精品.久久久| 国产黄片视频在线免费观看| 久久亚洲国产成人精品v| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 又爽又黄无遮挡网站| 特级一级黄色大片| eeuss影院久久| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久久久久久成人| 国产精品福利在线免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 有码 亚洲区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 看非洲黑人一级黄片| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲欧美精品自产自拍| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 免费观看无遮挡的男女| 晚上一个人看的免费电影| 黄色一级大片看看| 亚洲国产av新网站| 一区二区三区免费毛片| 直男gayav资源| 成年女人看的毛片在线观看| 国产成人精品婷婷| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 香蕉精品网在线| 伦理电影大哥的女人| 草草在线视频免费看| 日本一二三区视频观看| 天堂网av新在线| 中文天堂在线官网| 嫩草影院精品99| 特大巨黑吊av在线直播| 久久女婷五月综合色啪小说 | 激情 狠狠 欧美| 特大巨黑吊av在线直播| 成人亚洲欧美一区二区av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久精品夜色国产| 内射极品少妇av片p| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲国产最新在线播放| 日韩电影二区| 中文欧美无线码| 久久韩国三级中文字幕| 老女人水多毛片| 欧美精品一区二区大全| 国产精品女同一区二区软件| 中文字幕免费在线视频6| 国产高清不卡午夜福利| 九色成人免费人妻av| 国产乱来视频区| 大香蕉久久网| 777米奇影视久久| 性色av一级| 欧美区成人在线视频| 欧美另类一区| 久久久久久久国产电影| 日本黄大片高清| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久久久久久久丰满| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜亚洲福利在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久精品人妻少妇| 最近中文字幕高清免费大全6| 丝袜喷水一区| 街头女战士在线观看网站| 日韩欧美精品免费久久| 另类亚洲欧美激情| 一区二区av电影网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 大香蕉久久网| 97在线视频观看| 日本三级黄在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 69人妻影院| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产片特级美女逼逼视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 大码成人一级视频| 如何舔出高潮| 国产永久视频网站| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩一区二区视频免费看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲av.av天堂| 日韩一区二区三区影片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久99热6这里只有精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 在线看a的网站| 男男h啪啪无遮挡| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产成年人精品一区二区| 如何舔出高潮| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国模一区二区三区四区视频| 国产成人一区二区在线| 日韩三级伦理在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 久久久午夜欧美精品| 亚洲最大成人手机在线| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲国产欧美人成| 真实男女啪啪啪动态图| 少妇丰满av| 日本黄色片子视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品人妻久久久影院| 欧美高清性xxxxhd video| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 五月天丁香电影| 亚洲成人av在线免费| av国产精品久久久久影院| 人妻 亚洲 视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久久久久国产电影| 91aial.com中文字幕在线观看| 国内精品宾馆在线| 欧美日韩综合久久久久久| 视频中文字幕在线观看| 人人妻人人看人人澡| 久久人人爽人人爽人人片va| av黄色大香蕉| 日本wwww免费看| 成人亚洲精品av一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成年人午夜在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 国产精品久久久久久av不卡| 十八禁网站网址无遮挡 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 国产成人精品福利久久| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品人妻久久久久久| 夫妻午夜视频|