超聲誘發(fā)成核提高HepG2 細(xì)胞冷凍消融致死率研究

摘要：冷凍消融技術(shù)對于治療實(shí)體腫瘤具有一定的效果，但普遍存在降溫效果有限、靶向殺傷效率不高等問題。為提高冷凍消融的療效，提出了將超聲誘發(fā)成核用于冷凍消融的一種新的輔助手段，研究了2 種降溫速率下不同誘發(fā)成核溫度對細(xì)胞存活率的影響，觀察并記錄了超聲誘發(fā)成核后的胞外冰晶形態(tài)、胞內(nèi)冰晶生成情況及復(fù)溫后的細(xì)胞損傷情況。結(jié)果表明：使用超聲誘發(fā)成核輔助冷凍消融可以提高腫瘤細(xì)胞的致死率。慢速冷凍輔助成核組的效果最佳，消融更為徹底，HepG2 細(xì)胞的存活率低至15.60% ± 2.60%?？焖倮鋬鲚o助成核時(shí)，需要配合較低的誘發(fā)成核溫度才能更好地殺傷細(xì)胞。設(shè)計(jì)開發(fā)具有超聲誘發(fā)成核功能的冷凍消融器械具有實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞：超聲誘發(fā)成核；冷凍消融；細(xì)胞活力；冰晶

中圖分類號：R 318.52 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

冷凍消融是一種通過凍融過程破壞腫瘤細(xì)胞的物理消融方式，與常規(guī)手術(shù)切除相比，具有微創(chuàng)、疼痛小、出血少等優(yōu)勢，在實(shí)體瘤患者的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。迄今為止，冷凍消融已被用于肝癌[1]、乳腺癌[2] 和前列腺癌[3] 等的臨床治療中。然而，冷凍消融普遍存在降溫效果有限、靶向殺傷效率不高等問題，最終會導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)殘留、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，治療效果不佳。

為提高冷凍消融的療效，眾多學(xué)者開始研究低溫復(fù)合治療模式。目前已有研究將抗凍蛋白[4-6]或納米粒子[7-9] 加入冷凍消融過程中，盡管這些聯(lián)合應(yīng)用可以加劇冷凍消融對腫瘤細(xì)胞的殺傷，但抗凍蛋白的提取復(fù)雜、產(chǎn)量低，而納米粒子的添加不可避免地會帶來細(xì)胞毒性、載體的可降解性以及靶向性等問題[10]。因此，尋找一種新的冷凍消融輔助手段迫在眉睫。近年來，超聲波已成為一種新興治療手段，其在癌癥的臨床治療中顯示出獨(dú)特的價(jià)值和優(yōu)勢。超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)會引起空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-13] 并增加細(xì)胞膜的通透性[14-15]。低強(qiáng)度超聲波除了可以直接用于臨床治療外，在藥物生產(chǎn)中也發(fā)揮著巨大的作用[16]。使用超聲波可以促進(jìn)原料結(jié)晶，并且顯著影響晶體的粒徑和分布，提高結(jié)晶的可重復(fù)性。除此之外，超聲波也被應(yīng)用于食品工業(yè)以提高冷凍食品的品質(zhì)。它可以有效地增強(qiáng)冰核形成，控制冰晶大小與形狀，同時(shí)還能改善傳熱傳質(zhì)以加速冷凍過程[17]。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用保護(hù)劑結(jié)合超聲誘發(fā)成核可以提高細(xì)胞的保存效果[18]，但未添加保護(hù)劑下的超聲誘發(fā)成核效果還未被研究。

本文提出了一種將超聲誘發(fā)成核用于冷凍消融的新方法，為達(dá)到提高腫瘤細(xì)胞致死率的目的，研究了超聲波輔助冷凍消融對腫瘤細(xì)胞即時(shí)存活率和再培養(yǎng)存活率的影響。通過低溫顯微系統(tǒng)，觀察并記錄了超聲誘發(fā)成核后的胞外冰晶形態(tài)、胞內(nèi)冰晶生成情況以及復(fù)溫后的細(xì)胞損傷情況，探討了冰晶形態(tài)與細(xì)胞損傷的微觀結(jié)構(gòu)關(guān)系，為未來進(jìn)一步優(yōu)化腫瘤冷凍消融提供了新方向。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

肝癌細(xì)胞 HepG2（ Procell CL-0103， 武漢普諾賽生命科技有限公司） ， 胎牛血清（ CAPRICORN 公司），DMEM 培養(yǎng)基（ GIBCO 公司） ， 雙抗（ GIBCO 公司） ， 胰蛋白酶（ TBD 公司），PBS 緩沖液（TBD 公司），AO/PI（吖啶橙/碘化丙啶）染色液（ Nexcelom Bioscience，CS2-0106-5 mL）。

T-25 培養(yǎng)瓶（ NEST 耐思） ， 50 mL 離心管（NEST 耐思），15 mL離心管（NEST 耐思），1.2 mL凍存管（ LABSELECT， CV-002-120-EX） ， CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（日本同仁，CK04）。

1.2 儀器和設(shè)備

全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（BodBoge），多功能讀板儀（美國BioTek， Synergy H1），手持超聲波發(fā)生器（ 愛爾創(chuàng)， UPT3） ， 程序降溫儀（ 英國Planer，Kryo360-1.7），機(jī)械超聲波清洗機(jī)（科璽世紀(jì)，KX-1730QT）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2 細(xì)胞在補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，取細(xì)胞時(shí)先輕輕吸棄培養(yǎng)瓶里的上清液，向瓶中加入1 mL PBS 緩沖液，輕柔洗滌2 次后吸棄PBS 緩沖液，加入1 mL 胰蛋白酶，培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱消化3 min。在光學(xué)顯微鏡下見細(xì)胞形態(tài)已呈圓形，輕拍培養(yǎng)瓶一側(cè)，細(xì)胞可與壁面完全脫離，添加2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化。用1 mL 移液槍吸取培養(yǎng)液，輕柔、均勻地反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底壁，確保細(xì)胞脫離底壁全部進(jìn)入溶液中，將細(xì)胞溶液以1 100 r/min 的轉(zhuǎn)速離心4 min 后重懸于培養(yǎng)基中待用。

1.4 細(xì)胞冷凍消融

取1.2 mL 凍存管，分別加入500 μL HepG2 細(xì)胞懸液，保證每管內(nèi)的細(xì)胞濃度為5×105 個(gè)/mL，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)開始前，將對照組和實(shí)驗(yàn)組的凍存管分別夾在程序降溫儀的遞送管上，按設(shè)計(jì)的凍融程序設(shè)定好程序降溫儀，啟動儀器。對照組僅進(jìn)行冷凍消融，而不進(jìn)行超聲誘發(fā)成核。

細(xì)胞冷凍消融程序?yàn)椋?以10 ℃/min 或50 ℃/min 的降溫速率從20℃ 降溫到超聲誘發(fā)成核溫度（?5，?7，?9，?11 ℃），程序降溫儀顯示達(dá)到誘發(fā)成核溫度并提示可進(jìn)行誘發(fā)成核操作后，將遞送管取出放入超聲波清洗機(jī)內(nèi)，開啟超聲2 s，誘發(fā)成核。超聲波頻率40 kHz，功率120 W。超聲誘發(fā)成核完成后將遞送管迅速放回程序降溫儀中，以原速率降溫至?20 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 的升溫速率將溫度升至20 ℃。

1.5 細(xì)胞存活率檢測

采用AO/PI 染色評估凍融后即時(shí)的HepG2 細(xì)胞活力。用10 μL 移液槍吸取10 μL 凍融結(jié)束后的細(xì)胞懸液，避光加入10 μL AO/PI 染液，輕輕混勻。吸取10 μL 混合液到一次性計(jì)數(shù)板，細(xì)胞存活率由細(xì)胞計(jì)數(shù)儀直接讀取。采用CCK-8 法評估細(xì)胞經(jīng)過凍融后繼續(xù)培養(yǎng)12 ，24，48 h 的細(xì)胞活力。將凍融完成后的不同組細(xì)胞以1×104 cell/孔接種在96 孔板上，分別于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12，24，48 h。培養(yǎng)完成后使用CCK-8 試劑染色，在450 nm 波長下測定每個(gè)孔的最終吸光度。

1.6 低溫顯微觀察

低溫顯微實(shí)驗(yàn)之前的細(xì)胞準(zhǔn)備與1.3 小節(jié)描述的相同，裝置示意圖如圖1 所示。首先將樣品坩堝放置于冷熱臺中央，用移液槍吸取4 μL 新鮮制備的HepG2 細(xì)胞懸液并滴加到樣品坩堝中，隨后迅速蓋上干凈的蓋玻片，將顯微鏡調(diào)節(jié)至視野清晰后啟動設(shè)定好的凍融程序。誘發(fā)成核的實(shí)驗(yàn)操作步驟為：當(dāng)達(dá)到所設(shè)定的誘發(fā)成核溫度后，打開冷臺頂部圓蓋，使用超聲波發(fā)生器尖端輕碰玻片邊緣來誘發(fā)溶液中冰晶的形成，整個(gè)過程應(yīng)做到快速且精確，并盡可能保證玻片不被移動。用CCD 相機(jī)實(shí)時(shí)記錄整個(gè)降溫和復(fù)溫過程，時(shí)間間隔為1 s。

低溫顯微鏡的凍融程序?yàn)椋簩?shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別在10 ℃/min 和50 ℃/min 的降溫速率下，從20 ℃降溫到所需溫度（?5，?7 ，?9，?11 ℃）后誘發(fā)成核， 接著以原來的速率降溫至?20 ℃ 并保持1 min，以5 ℃/min升至室溫。對照組細(xì)胞也分別以10 ℃/min 和50 ℃/min 的速率降溫至?20 ℃ 并保持1 min，最后以 5 ℃/min 升至室溫。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行，采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同降溫速率下超聲誘發(fā)成核溫度對細(xì)胞存活率的影響

圖2 顯示了不同降溫速率下誘發(fā)成核溫度對HepG2 細(xì)胞存活率的影響（**代表Plt;0.01）。同各自對照組（未誘發(fā)成核，cryo）相比，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率均顯著降低（Plt;0.01），這說明使用超聲誘發(fā)成核來輔助冷凍消融的確能提高HepG2 細(xì)胞的致死率。當(dāng)降溫速率為10 ℃/min 時(shí)（圖2a），HepG2細(xì)胞的存活率最高僅為22.53 %± 5.79%，在?5～?11 ℃ 的溫度范圍內(nèi)，誘發(fā)成核溫度對細(xì)胞的存活率不產(chǎn)生顯著影響（Pgt;0.05）。當(dāng)降溫速率提高到50 ℃/min 時(shí)（圖2b），較高成核溫度（ ?5 ℃ 和?7 ℃）的實(shí)驗(yàn)組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HepG2 細(xì)胞的存活率最低為67.19% ± 2.24%，較低成核溫度（?9 ℃ 和?11 ℃）的實(shí)驗(yàn)組之間差異也不顯著，但HepG2 細(xì)胞的存活率下降至最低為42.14 %± 2.45%，細(xì)胞存活率明顯受到誘發(fā)成核溫度的影響。

當(dāng)超聲波作用于細(xì)胞溶液時(shí)，可以顯著提高傳熱與傳質(zhì)系數(shù)，有利于快速去除結(jié)晶過程所釋放的潛熱，因此可以有效地誘發(fā)晶核的形成。當(dāng)細(xì)胞外形成冰晶后，若降溫速率較慢，胞外冰晶將有充足的時(shí)間向胞內(nèi)生長，形成胞內(nèi)冰晶，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；若降溫速率較快，胞外冰晶則形成較少且來不及生長，冰晶不能及時(shí)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，無法對細(xì)胞造成致命的打擊。在較低的溫度下誘發(fā)成核時(shí)，由于過冷度較大，生成的晶核臨界尺寸小，溶液內(nèi)部可以形成更多穩(wěn)定的晶核，因此會形成更為細(xì)密的胞外冰晶。這些胞外冰晶就更有可能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生較好的殺傷效果?？偟膩碚f，超聲波誘發(fā)成核對于慢速冷凍組的殺傷效果更為顯著。

2.2 不同降溫速率下超聲誘發(fā)成核對細(xì)胞培養(yǎng)存活率的影響

冷凍消融不徹底是造成腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素，因此驗(yàn)證消融后不同時(shí)間的細(xì)胞存活率顯得尤為重要。CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，當(dāng)降溫速率為10 ℃/min（圖3a） 時(shí)， 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在培養(yǎng)12，24，48 h 后都保持極低的存活率，與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Plt;0.01）。當(dāng)降溫速率為50 ℃/min（圖3b）時(shí)，超聲誘發(fā)成核溫度為?7 ℃ 的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在培養(yǎng)12，24，48 h 后均與對照組沒有顯著差異，誘發(fā)成核溫度為?5 ℃ 的實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)48 h 后也失去了與對照組的差異，而在較低成核溫度下（?9 ℃ 和?11 ℃）的實(shí)驗(yàn)組在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)與對照組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Plt;0.01）。這是由于快速冷凍組在高成核溫度下形成的胞外冰晶大而疏，且沒有足夠的時(shí)間向胞內(nèi)生長，因此無法產(chǎn)生致命的胞內(nèi)冰晶損傷。綜上，慢速冷凍組的殺傷效果最佳，而快速冷凍組在較高成核溫度下進(jìn)行的冷凍消融不徹底，容易造成腫瘤復(fù)發(fā)。

2.3 不同降溫速率下超聲誘發(fā)成核的低溫顯微觀察

2.3.1 降溫速率為10 ℃/min 時(shí)HepG2 細(xì)胞的低溫響應(yīng)

當(dāng)降溫速率為10℃/min 時(shí)， HepG2 細(xì)胞的低溫顯微圖像如圖4 所示。圖4 中第1 列為開始降溫前細(xì)胞的圖像，可見肝癌細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞膜均保持完整。在使用超聲波誘發(fā)成核后（圖4（a2、b2、c2、d2）），胞外冰晶的生長速率很快，視野內(nèi)幾乎一瞬間就布滿冰晶，同時(shí)可觀察到部分HepG2 細(xì)胞內(nèi)部變成黑色，說明此時(shí)有胞內(nèi)冰晶的形成。圖4（e2） 為對照組自發(fā)成核時(shí)生成的冰晶情況，胞外冰晶在?15.8 ℃ 形成，并且在形成后迅速覆蓋了全部細(xì)胞，但細(xì)胞內(nèi)沒有馬上出現(xiàn)胞內(nèi)冰晶，而是在?20 ℃時(shí)才出現(xiàn)。從第2 列的胞外冰晶形態(tài)可以看出，隨著成核溫度的降低，胞外冰晶分支數(shù)目明顯增多，形態(tài)變得更加細(xì)密。從第3 列可以看出，繼續(xù)慢速冷凍至?20 ℃ 并且平衡1 min 后，各組中的胞外冰晶都有了更為明顯的生長，且細(xì)胞內(nèi)全部生成了胞內(nèi)冰晶。復(fù)溫后的實(shí)驗(yàn)組（圖4（a4、b4、c4、d4））較對照組（圖4（e4））中的細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的損傷，細(xì)胞膜的邊界變得模糊，難以辨認(rèn)，如圖中紅色箭頭所示。有些細(xì)胞在經(jīng)歷了這樣的冷凍消融后失去了活性，但仍然會有一些HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞膜受損不嚴(yán)重，這樣的細(xì)胞就可能會存活下來，造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)組中直觀的細(xì)胞損傷與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中較低的存活率相對應(yīng)，再次證明超聲誘發(fā)成核輔助冷凍消融具有很好的效果。超聲波的使用使細(xì)胞膜對于胞內(nèi)冰晶的成核變得足夠“活躍”，而充分的的胞內(nèi)冰晶生長導(dǎo)致了更強(qiáng)的細(xì)胞損傷。

2.3.2 降溫速率為50 ℃/min 時(shí)HepG2 細(xì)胞的低溫響應(yīng)

圖5 顯示了降溫速率為50 ℃/min 時(shí)，HepG2細(xì)胞的低溫顯微圖像。當(dāng)降溫速率升高到50 ℃/min后，胞外冰晶的形態(tài)呈現(xiàn)出與降溫速率為10 ℃/min時(shí)一致的變化規(guī)律，均為高成核溫度條件下形成的胞外冰晶大而疏，低成核溫度下形成的胞外冰晶小而密，并且均在形成胞外冰晶后立即觀察到了胞內(nèi)冰晶的形成。與對照組（圖5（e4））相比，低成核溫度（圖5（c4、d4））下細(xì)胞復(fù)溫后的膜邊界模糊，且受損嚴(yán)重，這樣的現(xiàn)象對應(yīng)了其在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的低存活率，而較高成核溫度（圖5（a4、b4））下細(xì)胞的損傷則沒有那么嚴(yán)重。

3 結(jié) 論

為提高腫瘤細(xì)胞冷凍消融的殺傷效果，本文創(chuàng)新性地引入超聲誘發(fā)成核來提高冷凍消融的治療結(jié)果，得到如下結(jié)論：

a. 超聲誘發(fā)成核輔助冷凍消融對細(xì)胞有更好的殺傷效果。當(dāng)降溫速率為10℃/min 時(shí)，超聲誘發(fā)成核的細(xì)胞存活率最低為15.60% ± 2.60%，不同誘發(fā)成核溫度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05）。當(dāng)降溫速率為50℃/min 時(shí)，需要配合較低的成核溫度才能達(dá)到更理想的殺傷效果，細(xì)胞存活率最低為42.14% ± 2.45%。

b. 慢速冷凍組的冷凍消融效果最佳，HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)12， 24， 48 h 后均保持極低的存活率，而快速冷凍組在較高成核溫度下進(jìn)行的冷凍消融不徹底，容易造成腫瘤復(fù)發(fā)。

c. 較高成核溫度下形成的胞外冰晶大而疏，較低成核溫度下形成的胞外冰晶小而密。超聲波使細(xì)胞膜對于胞內(nèi)冰晶的成核變得足夠“活躍”。當(dāng)降溫速率較慢時(shí)，胞外冰晶有足夠的時(shí)間向細(xì)胞內(nèi)生長，這導(dǎo)致了更強(qiáng)的細(xì)胞損傷。當(dāng)降溫速率較快時(shí)，降溫時(shí)間較短，冰晶不能及時(shí)進(jìn)入胞內(nèi)，只有在低成核溫度下形成更細(xì)小的胞外冰晶時(shí)，才有可能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并產(chǎn)生良好的殺傷效果。

d. 設(shè)計(jì)開發(fā)具有超聲誘發(fā)成核功能的冷凍消融器械具有實(shí)際意義。