不同菌株發(fā)酵黃精抗氧化、降血糖和降血脂活性比較研究

摘要：傳統(tǒng)的黃精炮制方法一般采用耗時、耗能的酒蒸法或酒燉法。為了開發(fā)出耗能低、耗時短、條件溫和的黃精炮制工藝，篩選了黃精發(fā)酵最適菌株，對發(fā)酵前后黃精制品中抗氧化、降血糖和降血脂活性進行了系統(tǒng)研究。最終篩選到一株最適黃精發(fā)酵菌株植物乳桿菌Picp-2。采用植物乳桿菌Picp-2 對黃精進行液態(tài)發(fā)酵，所得黃精多糖的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（·O2?） 清除率及總還原力分別提升50.38%，13.10%，14.48%，31.47%。同時，Picp-2 發(fā)酵組α-葡萄糖苷酶抑制率增加83.24%。研究結(jié)果表明，植物乳桿菌Picp-2 能夠通過液態(tài)發(fā)酵顯著提升黃精抗氧化、降血糖活性。本文為黃精炮制工藝的開發(fā)與研究提供了理論依據(jù)和指導。

關鍵詞：發(fā)酵；黃精；抗氧化；降血糖；降血脂

中圖分類號：R 283.1 文獻標志碼：A

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科植物的干燥根莖，是一種傳統(tǒng)的藥食同源中草藥[1-5]。中醫(yī)認為黃精具有增氣、滋陰、潤肺、健脾的特性[6-7]。生黃精含有一種特殊多糖類物質(zhì)——黏液質(zhì)，生食該物質(zhì)會產(chǎn)生強烈的麻口感，因此黃精必須經(jīng)過炮制后才可以入藥、食用[8-9]。

目前，黃精的主要炮制工藝為《中國藥典》中記載的酒蒸法和酒燉法[9-11]，該法需要向黃精中添加黃酒，并進行反復蒸制、烘干。該工藝耗能高、耗時長，且蒸制過程中伴隨高溫等劇烈條件，產(chǎn)物中往往會產(chǎn)生大量美拉德反應產(chǎn)物5-羥甲基糠醛[12-14]。微生物發(fā)酵，即利用微生物生命代謝活動對發(fā)酵基質(zhì)起到提質(zhì)增效的作用，因其條件溫和、耗能低，同時還能減輕中藥材本身的毒副作用，目前已成為熱門的中藥材炮制手段之一[15]。崔亞鵬等[16] 利用植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵金銀花浸提液，顯著提升了1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、2，2'聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基的清除率。Zhu 等[17] 利用靈芝發(fā)酵大麻葉，顯著提高了其DPPH·、羥基自由基（·OH）清除率。吳德超等[18] 等論述了黑曲霉中產(chǎn)生的各種酶系，對中藥材中的活性物質(zhì)具有顯著的轉(zhuǎn)化作用。

本文比較分析了不同菌株、不同發(fā)酵方式對黃精活性物質(zhì)含量、抗氧化活性、降血糖活性、降血脂活性的影響，以期確定最適的發(fā)酵菌株，為黃精深加工及新炮制工藝的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料及試劑

植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）Picp-（CCTCC No：M20191045）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY 購自安琪酵母股份有限公司；中華紅芝（Ganodermalucidum，CCTCC No：KF2008392）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；黑曲霉（Aspergillus niger）曲精購自濟寧玉園生物科技有限公司。

α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶、水楊酸（ 分析純）：北京索萊寶科技有限公司；H2O2（分析純）：湖南匯虹試劑有限公司；DPPH、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 實驗儀器

超聲波清洗機：深圳市潔盟清洗設備有限公司JP-060S；酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司I510；高速離心機：美國Sigma 公司3K15；電子天平： 上?，幮码娮涌萍加邢薰綥QC3002。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃精液態(tài)發(fā)酵

生黃精烘干后放入中藥材粉碎機中粉碎，過60 目篩網(wǎng)。稱取10 g 黃精粉末放入500 mL 三角燒瓶中，向燒瓶中加入50 mL無菌水。將混合物在121 ℃ 下滅菌15 min。

超凈操作臺內(nèi)，分別接種活化好的10%（體積分數(shù)）植物乳桿菌Picp-2 和2%（體積分數(shù)）釀酒酵母SY，對照組加入等量的無菌水。對照組、Picp-2、SY 發(fā)酵組置于恒溫搖床內(nèi)140 r/min，37 ℃ 發(fā)酵72 h；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵樣品冷凍干燥，4 ℃ 保存，備用。

1.2.2 黃精固態(tài)發(fā)酵

生黃精烘干后放入中藥材粉碎機中粉碎，過60 目篩網(wǎng)。黃精粉末于121 ℃ 下滅菌20 min。無菌操作臺內(nèi)，稱取15 g 滅菌后的黃精粉末于培養(yǎng)皿中，加入15 mL 無菌水，再分別接入3 mL 中華紅芝、黑曲霉菌液孢子懸浮液，混勻后封口，置于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。發(fā)酵黃精置于冷凍干燥機中干燥，4 ℃ 保存，備用。

1.2.3 黃精多糖提取物制備

將黃精炮制樣品用中藥材粉碎機粉碎后，稱取黃精粉碎樣品1 g，按樣品質(zhì)量與液體體積為1∶20 的比例加入純水，70 ℃ 下浸提2 h，離心收集上清。加入與上清液等體積的10%（質(zhì)量分數(shù)）三氯乙酸溶液， 4 ℃靜置12 h 進行脫蛋白， 以7 500 r/min 離心10 min，吸出上清液。向上清液中加入4 倍上清液體積的無水乙醇，醇沉過夜。以7 500 r/min 離心10 min，收集沉淀，加入20 mL 純水復溶，即得多糖提取物。

1.2.4 抗氧化活性測定

a. DPPH·清除率（R1）

用移液槍吸取1 mL 黃精乙醇提取物，將其放入2 mL 的EP 管中。向EP 管中加入1 mL 的0.2 mmol/LDPPH 溶液。振蕩混勻EP 管中的溶液，以確保提取物與DPPH 溶液充分接觸。然后避光靜置反應30 min。

反應結(jié)束后，用移液槍吸取200 μL 反應液，放入酶標板中。將酶標板放入酶標儀中，選擇波長517 nm 進行光密度（OD）測定。陽性對照組使用100 μg/mL 的維生素C 溶液。根據(jù)下式計算清除率：

R1 = [1-（A1 -B1）=C1 ]×100%

式中：A1，B1，C1 分別表示實驗組、對照組、空白組在517 nm 處的OD 值。

b. ·OH 清除率（R2）

用移液槍將2 mL 黃精乙醇提取物轉(zhuǎn)移至10 mL 的 EP 管中。分別向EP 管中加入6 mmol/LFeSO4 溶液和6 mmol/L H2O2 溶液各2 mL。振蕩EP 管，使溶液充分混合。將EP 管靜置，進行反應10 min。

反應結(jié)束后， 向各組EP 管中加入2 mL6 mmol/L 水楊酸溶液。再次振蕩EP 管，使溶液充分混合。靜置，進行反應30 min。

反應結(jié)束后，使用移液槍吸取200 μL 反應液，轉(zhuǎn)移至酶標板。將酶標板放入酶標儀中，于波長510 nm 下測定OD 值。設置100 μg/mL 維生素C 溶液作為陽性對照。根據(jù)下式計算清除率：

R2 = （1-A2=B2）×100%

式中：A2，B2 分別表示實驗組、對照組在510 nm處的OD 值。

c. 超氧陰離子自由基（·O2?） 清除率（R3）

將1 mL 黃精乙醇提取物與4.5 mL 0.05 mol/LTris-HCl（pH=8.2）溶液混合均勻，置于25 ℃ 水浴鍋中，進行恒溫反應20 min。加入0.3 mL 0.05 mol/L鄰苯三酚， 繼續(xù)保持水浴鍋25 ℃ 恒溫反應4 min。加入1 mL 的8 mmol/L HCl 溶液終止反應，混合均勻。

在波長325 nm 處測定吸光度，根據(jù)下列公式計算待測樣品的·O2?清除率：

R3 = [1-（A3 -B3）=C3]×100%

式中：A3，B3，C3 分別表示實驗組、對照組（純水替代鄰苯三酚） 、空白組（ 純水替代樣品） 的吸光度。

d. 總還原力

吸取1 mL 黃精乙醇提取物， 再分別吸取2.5 mL 0.2 mol/L PBS 溶液和質(zhì)量分數(shù)為1% 的K3[Fe（CN）6] 溶液，混勻后，50 ℃ 恒溫條件下反應20 min。反應結(jié)束后，加入2.5 mL 質(zhì)量分數(shù)為10% 的三氯乙酸溶液，迅速將其上清液和純水按等比例混合至5 mL，最后加入0.5 mL 質(zhì)量分數(shù)為0.1% 的 FeCl3 溶液，再次振蕩混勻，反應10 min。反應完成后，吸取200 μL 反應液于酶標儀中，在700 nm 波長下測定OD 值。樣品的總還原力與測得的OD 值成正比。

1.2.5 降血糖、降血脂活性測定

a. α-葡萄糖苷酶抑制率（R4）

將0.2 mL 樣品加入1 mLα-葡萄糖苷酶溶液，在37 ℃ 的恒溫條件下反應10 min。在反應體系中加入0.5 mL 的5 mmol/mL PNPG 溶液，繼續(xù)在37 ℃的恒溫條件下反應10 min。反應結(jié)束后，向反應體系中加入1 mL 的0.1 mol/L Na2CO3 溶液以終止反應。將反應液轉(zhuǎn)移到酶標儀中，在405 nm 的波長下測定吸光度。

R4 = [1-（A4 -B4）=（C4 -D4）]×100%

式中：A4，B4，C4，D4 分別表示實驗組、實驗背景組、空白組、空白背景組的吸光度。

b. 胰脂肪酶抑制率（R5）

分別取500 μL 樣品、胰脂肪酶（1.2 U/mL）和PBS（pH=7.4），混合均勻，然后在37 ℃ 的恒溫條件下反應10 min 后， 向混合液中加入500 μL的P-NPB 溶液（ 11.2 mol/L），再次混合均勻。在37 ℃ 的恒溫條件，繼續(xù)反應20 min，反應結(jié)束后，迅速在405 nm 的波長下測定混合液的吸光度。

R5 = [1-（A5 -B5）=（C5 -D5）]×100%

式中：A5，B5，C5，D5 分別表示實驗組、實驗背景組、空白組、空白背景組的吸光度。

1.2.6 黃精多糖含量測定

按照王彥平等[19] 提出的修改方法，用苯酚-硫酸法測定黃精多糖含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析軟件來處理和分析實驗數(shù)據(jù)。本文采用T-test 統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學差異分析。在分析過程中，設定Plt;0.05 表明兩組樣本之間存在統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同菌株發(fā)酵黃精多糖含量

不同菌株發(fā)酵后黃精多糖含量如圖1 所示。圖中不同字母a～c 代表統(tǒng)計學差異。植物乳桿菌Picp-2 發(fā)酵組多糖含量為（48.38±2.4） mg/g，相較生黃精多糖含量（52.39±0.89） mg/g下降了7.66%，但無顯著差異。釀酒酵母SY、中華紅芝、黑曲霉發(fā)酵組多糖含量分別為（40.02±2.33），（24.34±1.90），（28.31±4.04） mg/g，分別較生黃精多糖含量顯著降低23.62%，53.53%，45.97%（Plt;0.05）。微生物發(fā)酵過程中的生命活動會消耗黃精中的碳水化合物，而黃精中含有大量果膠、纖維素等物質(zhì)，微生物需將這些物質(zhì)水解后方可利用，不同菌株產(chǎn)纖維素酶能力不一致，對黃精中碳水化合物利用度存在差異，因此發(fā)酵后多糖含量存在一定差異[15，20]。多糖為黃精的主要活性成分，植物乳桿菌Picp-2 在發(fā)酵過程中，對多糖的保留率最好。

2.2 不同菌株發(fā)酵黃精多糖DPPH·清除率

DPPH·作為一種人工合成自由基，因其反應迅速、便捷，被廣泛利用在植物物質(zhì)抗氧化活性測定中， 但由于任何供氫體都能清除DPPH·， 且DPPH·只能在有機溶劑中進行反應，因此存在一定局限性[21]。不同菌株發(fā)酵后黃精多糖DPPH·清除率如圖2 所示，經(jīng)過植物乳桿菌Picp-2 和釀酒酵母SY 發(fā)酵后， 黃精多糖DPPH·清除率分別為30.86%±2.00%，28.00%±1.10%，相較生黃精多糖DPPH·清除率（ 20.52%±2.26%） 分別顯著提升了50.38%， 3 6 . 4 5 % （ Plt;0.05） ， 其中植物乳桿菌Picp-2 發(fā)酵組的提升率最大。中華紅芝和黑曲霉發(fā)酵后黃精多糖DPPH·清除率分別為21.50%±1.08%，22.48%±0.55%，相較生黃精多糖DPPH·清除率無顯著變化。

2.3 不同菌株發(fā)酵黃精多糖·OH 清除率

·OH 屬于活性氧（ROS），為生物體內(nèi)天然存在的自由基，是生命系統(tǒng)中最重要的一類，是引起食品氧化變質(zhì)、機體器官病變的重要因子，通過評價·OH 清除率可直接反應出機體的抗氧化能力[22]。不同菌株發(fā)酵后黃精多糖·OH 清除率如圖3所示。經(jīng)過植物乳桿菌Picp-2、釀酒酵母SY、中華紅芝和黑曲霉發(fā)酵后， 黃精多糖·OH 清除率分別為55.34%±3.34%，50.90%±0.21%，47.10%±0.60%，49.08%±1.62%，相較生黃精多糖·OH 清除率48.93%±0.11%，植物乳桿菌Picp-2 發(fā)酵黃精多糖·OH 清除率上升了13.10%，無統(tǒng)計學差異。

2.4 不同菌株發(fā)酵黃精多糖·O2?清除率

·O2?同·OH 一樣， 均屬于活性氧， 活性氧還包括過氧化氫（H2O2）、氧化脂質(zhì)（LO·）、過氧化脂質(zhì)（LOO·）等。·O2?源于氧化酶在機體生命活動、血紅蛋白自氧化及光解作用[23]。不同菌株發(fā)酵后黃精多糖·O2?清除率如圖4 所示，經(jīng)過植物乳桿菌Picp-2、釀酒酵母SY、中華紅芝和黑曲霉發(fā)酵后，黃精多糖·O2?清除率分別為31.39%±2.55%，31.49%±1.32%， 27.39%±1.94%， 29.08%±2.14%，生黃精多糖·O2?清除率為27.42%±2.17%。植物乳桿菌Picp-2 和釀酒酵母SY 發(fā)酵黃精多糖·O2?清除率較生黃精多糖·O2?清除率上升了14.48% 和14.84%，無統(tǒng)計學差異。

2.5 不同菌株發(fā)酵黃精多糖的總還原力

抗氧化劑的抗氧化性能往往與還原能力呈正相關，通過Fe3+還原方法，能夠有效評價抗氧化能力[24]。不同菌株發(fā)酵后黃精多糖總還原力如圖5所示，經(jīng)過植物乳桿菌Picp-2、釀酒酵母SY 發(fā)酵后，黃精多糖總還原力為0.122 4±0.017 6 和0.109 9±0.021 9，相較生黃精多糖總還原力（0.093 1±0.005 8）分別顯著提升了31.47% 和18.05%。而中華紅芝和黑曲霉發(fā)酵后黃精多糖總還原力分別為0.092 6±0.008 4 和0.096 3±0.010 7，相較生黃精多糖的總還原力無顯著變化。

2.6 不同菌株發(fā)酵黃精多糖降血糖活性

不同菌株發(fā)酵后黃精多糖降血糖活性如圖6所示。經(jīng)過植物乳桿菌Picp-2、釀酒酵母SY、中華紅芝和黑曲霉發(fā)酵后，黃精多糖α-葡萄糖苷酶抑制率為70.89%±2.57%，64.90%±0.78%，69.34%±3.30%，65.52%±7.95%，相較生黃精多糖α-葡萄糖苷酶抑制率（ 38.69%±1.15%） 分別顯著提升了83.24%，67.74%，79.22%，69.35%，其中植物乳桿菌Picp-2 發(fā)酵組的抑制率提升幅度最大。多糖能夠通過誘導α-葡萄糖苷酶疏水性表面基團暴露，使其三級結(jié)構(gòu)變化從而被抑制活性[25]。

2.7 不同菌株發(fā)酵黃精多糖降血脂活性

不同菌株發(fā)酵后黃精多糖降血脂活性如圖7所示。經(jīng)過發(fā)酵后，植物乳桿菌Picp-2 和釀酒酵母SY 發(fā)酵黃精多糖胰脂肪酶抑制率分別為115.68%±1.18%、117.07%±4.79%，相較生黃精多糖胰脂肪酶抑制率（121.58%±1.72%）無顯著變化；而中華紅芝和黑曲霉發(fā)酵黃靜多糖胰脂肪酶抑制率分別為76.85%±9.66%、107.76%±3.47%，相較生黃精多糖胰脂肪酶抑制率分別顯著降低了44.73% 和13.82%。多糖能夠通過抑制胰脂肪酶活性，降低人體對脂質(zhì)的吸收[26]。微生物則可能通過代謝活動對黃精中多糖結(jié)構(gòu)進行修飾，增強其對α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶抑制，從而起到降血糖、降血脂的作用。

3 結(jié) 論

a. 微生物發(fā)酵是一種條件溫和、低能耗的中藥材炮制方式，本文通過不同菌株分別黃精進行發(fā)酵，同時比較了不同發(fā)酵黃精多糖的抗氧化、降血糖、降血脂活性。

b. 利用植物乳桿菌Picp-2 對黃精進行液態(tài)發(fā)酵效果最佳，所得黃精多糖的DPPH·，·OH，·O2?清除率和總還原力及α-葡萄糖苷酶抑制率均最高。

c. 本研究篩選確定了一株最適黃精發(fā)酵菌株植物乳桿菌Picp-2，能夠有效提高黃精功效，為黃精炮制工藝開發(fā)與研究提供了一定參考和理論依據(jù)。