乳酸菌發(fā)酵對花生衣抗糖化緩解皮膚衰老功能的影響

摘要：糖化會導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）形成并在體內(nèi)積累，引起皮膚衰老。體外實驗表明花生衣具有抗糖化作用，乳酸菌發(fā)酵能否提升花生衣的抗糖能力尚不清楚。本研究采用體外AGEs 生成模型和丙酮醛損傷皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）模型，從10 株乳酸菌中篩出植物乳植桿菌CCFM1354，該菌具有很好的抑制AGEs 生成能力，能緩解HSF 細(xì)胞的糖化損傷。高糖細(xì)胞模型實驗發(fā)現(xiàn)，CCFM1354 發(fā)酵花生衣能顯著降低HSF 細(xì)胞中BAX 和NFKB1 的 mRNA 的相對表達(dá)量；D?半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠實驗結(jié)果表明，口服植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣能顯著降低小鼠血清AGEs 含量，提高小鼠皮膚彈性，改善小鼠皮膚萎縮狀況，且效果優(yōu)于未發(fā)酵花生衣。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵能顯著提升花生衣的抗糖化功能，緩解皮膚衰老。

關(guān)鍵詞：抗糖化；晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）；乳酸菌發(fā)酵；花生衣；皮膚衰老

中圖分類號：Q 815 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

糖化反應(yīng)是還原糖的羰基和蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的游離氨基，在非酶促的合適條件下，經(jīng)過一系列復(fù)雜的分子重排反應(yīng)生成穩(wěn)定、不可逆的共價聚合物的過程，最終生成晚期糖基化終末產(chǎn)物（ advanced glycation end products，AGEs）[1]。AGEs 隨著外源攝入或隨著年齡增長內(nèi)源產(chǎn)生后會在血液和多組織中積累，它通過與特異性受體（receptor for AGEs， RAGE）結(jié)合激活下游級聯(lián)反應(yīng)，以及與蛋白質(zhì)交聯(lián)破壞其正常功能特性這兩大主要途徑引發(fā)后續(xù)的糖化損傷[2]。許多器官病變已被報道受AGEs 的影響[3]，皮膚作為人體最大的器官直觀反映糖化損傷下皮膚衰老加劇的問題：糖化反應(yīng)使AGEs 在皮膚積累、促進(jìn)皮膚細(xì)胞凋亡、激活RAGE 并加強與AGEs 的結(jié)合、刺激NF-κB 等下游級聯(lián)通路造成皮膚炎癥、氧化損傷加劇，并且刺激基質(zhì)金屬蛋白酶活性上調(diào)、減少皮膚成纖維細(xì)胞正常的膠原蛋白合成功能，造成皮膚狀態(tài)惡化[4]，這些證據(jù)引起人們對基于抗糖化的對抗皮膚衰老研究有了更多的關(guān)注?，F(xiàn)階段被提出的常見抗糖化途徑包括抑制AGEs 的生成、阻斷AGE-RAGE 結(jié)合、破壞蛋白質(zhì)交聯(lián)和抑制AGE-RAGE 結(jié)合后的信號激活[2]。

花生是世界范圍內(nèi)重要的油料植物，不僅富有營養(yǎng)，而且分布廣泛。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球每年的花生總產(chǎn)量約2 900 萬t[5]?；ㄉ驮诩庸み^程中會產(chǎn)生花生衣、花生殼、花生粕等大量副產(chǎn)品，花生衣受到較多的關(guān)注。在食品及藥劑配方中應(yīng)用的花生酚類（主要是原花青素）被證實具有較好的抗氧化、抗糖尿病、抗癌、抗菌等功效[6]?，F(xiàn)有報道顯示，紅花生的花生衣中最主要的酚類化合物是兒茶素和阿魏酸，約占總酚類化合物的85%；一些被認(rèn)為是有效抗氧化劑的酚酸（包括香豆酸和綠原酸）和類黃酮（包括表兒茶素、白藜蘆醇），在紅花生的花生衣中也被檢測到[7]。近年來，報道指出花生衣具有抗糖化的功能，能減弱早期糖化加合物（阿瑪多里產(chǎn)物）的形成以及捕獲反應(yīng)性二羰基化合物，抑制體外AGEs 的生成[5]。此外，也有報道稱花生的酚類物質(zhì)能抑制AGEs 的前體物質(zhì)丙酮醛（MGO）所誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡[8]。

乳酸菌是一類常見的有益細(xì)菌，其培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的胞外酶破壞植物細(xì)胞細(xì)胞壁，常促進(jìn)植物提取物或中藥有效成分的酮類、酚類等物質(zhì)含量增加[9]。應(yīng)用乳酸菌發(fā)酵天然植物類提取物，使其原有生物活性提升已成為食品和化妝品原料研究的一大新趨勢。一些研究證實，植物乳植桿菌能通過發(fā)酵果蔬汁提升其原有的抗氧化功能特性[10-11]；也有報道稱植物乳植桿菌Kinko-SU4 發(fā)酵花生牛奶能提升產(chǎn)品在體外牛血清蛋白?果糖（BSA-Fru）體系中的AGEs 生成抑制率[12]。針對花生衣中主要酚類成分兒茶素，有糞菌發(fā)酵實驗顯示，發(fā)酵后含3'，4'?二羥基化結(jié)構(gòu)的代謝物增多，從而提高了發(fā)酵兒茶素的抗氧化活性。因此，通過微生物發(fā)酵，打開花生衣中兒茶素的C 環(huán)并增加3'，4'?二羥基化結(jié)構(gòu)的代謝物，有可能會提升花生衣的抗糖化功能[13]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌會利用阿魏酰酯酶、單寧酶、脫羧酶、β?葡萄糖苷酶、β?半乳糖苷酶等將共軛酚類物質(zhì)釋放或轉(zhuǎn)化為游離的可同化形式[14]。因此，花生衣中其他酚酸和類黃酮物質(zhì)也有可能在乳酸菌發(fā)酵過程中發(fā)生代謝與轉(zhuǎn)化。目前，體外發(fā)酵對花生衣各方面抗糖化能力影響的研究并不完善，口服花生衣或花生衣發(fā)酵液的體內(nèi)抗糖化效果仍缺乏報道。此外，口服抗糖化物質(zhì)能否緩解糖損傷造成的皮膚衰老這一問題也亟待回答。

本研究使用乳酸菌發(fā)酵花生衣提取物，利用體外BSA-Fru 模型和人源皮膚成纖維細(xì)胞（ HSF）糖損傷模型篩選出能發(fā)酵提升花生衣抗糖化效果的乳酸菌，并體外評估該乳酸菌的花生衣發(fā)酵液在皮膚層面的抗糖化能力。本研究利用動物實驗，評價花生衣及其發(fā)酵物在體內(nèi)的抗糖化抗衰老能力，主要關(guān)注它在緩解皮膚衰老方面的效果，希望為花生衣及其發(fā)酵產(chǎn)物在功能性食品或化妝品原料領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

植物乳植桿菌CCFM1354、植物乳植桿菌FXJCJ22M3、植物乳植桿菌FSCDJY93L1、植物乳植桿菌FJLHD2M9、發(fā)酵乳桿菌FBJSY361、發(fā)酵乳桿菌JSWX3L1、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ19M18、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ38M3、鼠李糖乳桿菌FZJHZ14L3、鼠李糖乳桿菌FNMGHLBE18L5，均來自于江南大學(xué)食品微生物保藏中心（ CultureCollection of Food Microorganisms）（江蘇無錫）。

人源皮膚成纖維細(xì)胞（ human skin fibroblasts，HSF），購于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。雄性BABL/c小鼠（SPF 級，8 周齡）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

花生衣提取物， 陜西盛恒生物科技有限公司，批次號SH20220328；MTT 試劑，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲亞砜、果糖、PBS 磷酸鹽緩沖液速溶顆粒，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮醛（MGO），北京普西唐生物科技有限公司；qPCR 相關(guān)引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、染料法熒光定量試劑盒，南京諾維贊生物科技股份有限公司；D?半乳糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；通用型組織固定液（中性），武漢賽維爾生物科技有限公司；牛血清蛋白（BSA）、小鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）試劑盒、人源III 型膠原蛋白（Col III） 試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；脫毛膏，薇婷官方旗艦店。

隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；超凈工作臺，中科美菱低溫科技股份有限公司； 酶標(biāo)儀， 美國Thermo 公司； 熒光定量PCR 儀， 美國Bio-Rad 公司； 皮膚彈性測試儀MPA580，德國Courage+Khazaka 公司；數(shù)字切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH 公司。

1.2 乳酸菌的活化與菌液制備

將植物乳植桿菌CCFM1354、植物乳植桿菌FXJCJ22M3、植物乳植桿菌FSCDJY93L1、植物乳植桿菌FJLHD2M9、發(fā)酵乳桿菌FBJSY361、發(fā)酵乳桿菌JSWX3L1、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ19M18、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ38M3、鼠李糖乳桿菌FZJHZ14L3、鼠李糖乳桿菌FNMGHLBE18L5 于MRS 固體培養(yǎng)基劃線活化后，挑單菌落接種于液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)，每培養(yǎng)24 h 以體積分?jǐn)?shù)2% 的接種量傳代，活化2 代，得到乳酸菌菌液。

1.3 花生衣發(fā)酵液的制備

配制花生衣發(fā)酵培養(yǎng)基（記為Hsp）：5% 花生衣提取物、4 g/L 葡萄糖、5 g/L 酵母粉、4 g/L 碳酸鈣以去離子水混合，在115 ℃ 滅菌20 min。在花生衣發(fā)酵培養(yǎng)基中接入2×106 CFU/mL 的乳酸菌菌液，在37 ℃ 培養(yǎng)48 h，發(fā)酵終點離心取上清液得到菌株發(fā)酵花生衣上清液。

1.4 體外AGEs 抑制實驗

在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上稍加修改制備牛血清蛋白?果糖（BSA-Fru）體系[15-17]，建立體外熒光AGEs 生成抑制的評估模型。用0.2 mol/L、pH 7.40 的磷酸緩沖液（PBS）溶解牛血清蛋白和D?果糖，使最終體系中BSA 濃度為10 mg/mL， Fru 濃度為0.5 mol/L，混合均勻的反應(yīng)溶液體系過0.22 μm 水系濾膜得到反應(yīng)液?？瞻渍{(diào)零組：4 mL 的PBS 溶液；空白對照組： 2 mL 的PBS 溶液與2 mL 反應(yīng)液均勻混合；2 mL 反應(yīng)液與2 mL 實驗待測樣品溶液。上述組別于37 ℃ 下避光孵化14 d，用酶標(biāo)儀測定其在激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm 處的熒光強度，發(fā)射狹縫5 nm。

Hsp 由PBS 稀釋成100 μg/mL 的最終濃度并過0.22 μm 水系濾膜得花生衣待測樣品溶液。菌株發(fā)酵花生衣上清液由PBS 稀釋成100 μg/mL，過0.22 μm 水系濾膜后得實驗待測樣品。

AGEs 生成抑制率的計算公式如下：

R = [1-（F1 - F2）=（F3 - F2）]×100%

式中： F1為樣品組熒光值； F2為空白調(diào)零組熒光值； F3為空白對照組熒光值。

1.5 細(xì)胞抗糖化實驗

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性篩選

人源皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基中（胎牛血清和雙抗的體積分?jǐn)?shù)分別為10% 和1%），在37 ℃、CO2 體積分?jǐn)?shù)為5% 的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 d 以體積分?jǐn)?shù)為0.25% 胰酶消化，并以1∶4 傳代。

MTT 法是測定細(xì)胞活力的常用方法，可評估藥物在細(xì)胞的最大安全劑量。當(dāng)HSF 細(xì)胞生長到對數(shù)期時，以胰酶消化制備細(xì)胞懸液，計算細(xì)胞數(shù)使HSF 細(xì)胞以3 000 個/孔的最終密度接種在96 孔板中培養(yǎng)24 h。將Hsp 和不同菌株的花生衣發(fā)酵液分別過0.22 μm 水系濾膜后，用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)1% 雙抗，無胎牛血清）稀釋成不同濃度梯度（12.5～1 000 μg/mL），替換96 孔板中原本的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μLMTT 溶液（5 mg/mL），避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)時吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 二甲亞砜（DMSO），用酶標(biāo)儀在490 nm 處測試吸光度，得到OD490 [18]。

1.5.2 MGO 誘導(dǎo)的HSF 細(xì)胞活力損傷測定

以Park 等的方法為基礎(chǔ)[8]， 采用MGO 誘導(dǎo)HSF 細(xì)胞， 建立糖損傷模型。將HSF 細(xì)胞以3 000 個/孔的最終密度接種在96 孔板中培養(yǎng)24 h，之后分成不同組別進(jìn)行操作。對照組：將培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，過24 h 重復(fù)換一次液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。模型組： 將培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，過24 h 去除培養(yǎng)基并用400 μM MGO 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗組：去除培養(yǎng)液，加入由基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的Hsp 或菌株發(fā)酵花生衣上清液（使各組花生衣提取物終濃度為100 μg/mL）培養(yǎng)24 h，再更換為含400 μM MGO 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。各組培養(yǎng)終點以1.5.1 中的方法測試細(xì)胞活力，得到各實驗組對丙酮醛損傷的預(yù)防效果。

1.5.3 高糖培養(yǎng)下HSF 細(xì)胞的功能測定

a. HSF 細(xì)胞的高糖模型建立。

將Pang 等[19] 的方法稍加修改，建立HSF 細(xì)胞高糖模型。以葡萄糖含量為35 mmol/L 的DMEM完全培養(yǎng)基（ 記為HG） 為高糖培養(yǎng)基， 建立HSF 細(xì)胞高糖模型。將HSF 細(xì)胞以1×104 個/mL的濃度接種至六孔板中培養(yǎng)24 h，分成不同組別進(jìn)行以下操作。對照組：除去原有培養(yǎng)液后，以完全培養(yǎng)基（葡萄糖含量為5.5 mmol/L）培養(yǎng)24 h，重復(fù)48 h。HG 組：以完全培養(yǎng)基正常換液培養(yǎng)24 h，再以高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。實驗組：除去培養(yǎng)基后，加入由完全培養(yǎng)基稀釋的100 μg/mL 的Hsp 或100 μg/mL 的植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣上清液培養(yǎng)24 h，再以高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

b. HSF 細(xì)胞基因表達(dá)的測定。

培養(yǎng)終點收獲細(xì)胞，根據(jù)RNA 提取試劑盒操作說明，從HSF 中提取總RNA，并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 備用。用實時定量聚合酶鏈反應(yīng) （RT-qPCR） 確定HSF 細(xì)胞中DDOST、MMP9、BAX 和NFKB1 的mRNA 的表達(dá)。將準(zhǔn)備好的cDNA 根據(jù)Liu 等[20] 描述的方法，使用熒光定量試劑盒在CFX96 系統(tǒng)（Bio-Rad）上進(jìn)行實時熒光定量?；蛐蛄性诿绹鴩疑锛夹g(shù)信息中心（NCBI）檢索，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計引物，使用β-actin 作為內(nèi)參基因。具體引物序列如表1 所示。

c. HSF 細(xì)胞III 型膠原蛋白含量的測定。

高糖模型培養(yǎng)結(jié)束，收集對照組、模型組、實驗組細(xì)胞培養(yǎng)液于無菌離心管中， 于4℃ 、3 000 r/min 離心20 min，保存上清液，用ELISA 試劑盒檢測其中III 型膠原蛋白含量。

1.6 動物抗糖化抗衰老實驗

1.6.1 動物實驗設(shè)計

將20 只實驗小鼠隨機分為對照組、模型組、花生衣發(fā)酵培養(yǎng)基組（ 記為Hsp） 、植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣上清液組（ 記為HCCFM1354），每組5 只。進(jìn)鼠適應(yīng)1 周后，除對照組外，其余小鼠每天皮下注射生理鹽水配置的D?半乳糖（500 mg/kg），造模6 周[21]。造模期間，Hsp 組小鼠每只每天分別灌胃80 mg/kg 花生衣發(fā)酵培養(yǎng)基，CCFM1354 組小鼠每只每天分別灌胃80 mg/kg 植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣上清液，灌胃量都為0.1 mL/20 g 小鼠；對照組和模型組的小鼠每天灌胃等體積的生理鹽水。實驗過程中，每周固定時間對所有小鼠的體重進(jìn)行測量并記錄。最后一次干預(yù)造模24 h 后處死小鼠，立即取樣。動物實驗方案獲得江南大學(xué)實驗動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（ 倫理編號： JN.No20230415b1430621[132]）。

1.6.2 小鼠皮膚彈性性能測定

造模6 周后，用脫毛膏脫去小鼠背部毛發(fā)，以皮膚彈性測試儀檢測每只小鼠背部皮膚彈性性能參數(shù)R2，測定時固定小鼠，確保儀器表面與待測皮膚始終保持垂直[22]。

1.6.3 小鼠血清糖化衰老標(biāo)志物測定

采用眼眶靜脈叢采集小鼠血液，靜置1 h，以3 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液分裝。采用ELISA 試劑盒測定血清中糖化標(biāo)志物AGEs 含量。

1.6.4 小鼠皮膚組織病理觀察及分析

收獲約1 cm2 皮膚組織塊在10% 多聚甲醛溶液中固定48 h。將上述組織送武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行Hamp;E 染色，使用數(shù)字切片掃描儀掃描切片，以Image J 軟件對切片結(jié)果中皮膚組織表皮厚度進(jìn)行測量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 9.0.0 軟件進(jìn)行作圖和對顯著性差異完成統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較使用單因素方差分析（ One-Way ANOVA） 。P lt; 0.05 記為*， P lt;0.01 記為**，P lt; 0.001 記為***，P lt; 0.000 1 記為****；“ns”表示無顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 能夠提升花生衣抗糖功能的乳酸菌篩選

2.1.1 不同菌株的花生衣發(fā)酵液抑制AGEs 生成能力檢測

如圖1 所示，在100 μg/mL 濃度下，Hsp 的熒光AGEs 生成抑制率為56.89%，與之前的抗糖化研究結(jié)果相符；由于前期研究已證實花生衣的體外抑制AGEs 生成能力與添加濃度成正相關(guān)[8]，為了凸顯發(fā)酵對花生衣抗糖化能力的提升，本研究選擇100 μg/mL 的低Hsp 添加濃度進(jìn)行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同菌株發(fā)酵液的AGEs 抑制率有差異變化，植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵Hsp 顯著提高其AGEs 生成抑制率， 達(dá)到76.74%（ Plt;0.000 1） ；植物乳植桿菌FSCDJY93L1 和副干酪乳酪桿菌DQHXNQ38M3 發(fā)酵后，AGEs 抑制率也分別顯著上升至65.81% 和64.05%（Plt;0.001 和P lt;0.01）。

2.1.2 不同菌株的花生衣發(fā)酵液對MGO 誘導(dǎo)的HSF 細(xì)胞活力的影響

a. Hsp 對HSF 細(xì)胞活力的影響。

HSF 細(xì)胞是皮膚真皮層重要的細(xì)胞。為確定合適的花生衣發(fā)酵液濃度，首先測試了不同濃度花生衣發(fā)酵培養(yǎng)基（ Hsp）對HSF 細(xì)胞活力的影響。

由圖2 可知，12.5～100 μg/mL 的Hsp 與HSF共孵育24 h 后均未見明顯的細(xì)胞毒性， 但當(dāng)Hsp 濃度升高至500 μg/mL 后HSF 細(xì)胞活力明顯下降。因此，選定100 μg/mL 為后續(xù)Hsp 以及各組別花生衣發(fā)酵上清液的給藥濃度。在同類研究中，花生衣提取物對于RAW 264.7 細(xì)胞的最大濃度設(shè)置為150 μg/mL，與本實驗結(jié)果一致[23]。

b. 預(yù)防細(xì)胞丙酮醛損傷的能力。

丙酮醛（MGO）是種高活性的二羰基化合物，是AGEs 生成過程中常見的高反應(yīng)中間體。MGO不僅會加劇細(xì)胞糖酵解過程中AGEs 生成、引發(fā)后續(xù)糖化損傷，也具有抑制與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因的細(xì)胞毒性，常被用作糖化損傷相關(guān)的實驗造模劑[24]。

由圖3 可知，與對照組（100%）相比，模型組經(jīng)過MGO 處理會造成細(xì)胞活力顯著下降至52.84%，證實MGO 造成細(xì)胞損傷。實驗組用100 μg/mL 的Hsp預(yù)處理后能使細(xì)胞活力提高到62.48%；100 μg/mL不同菌株的花生衣發(fā)酵上清液預(yù)防給藥后，細(xì)胞活力與出現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下降，其中植物乳植桿菌CCFM1354 組的細(xì)胞活力顯著提高至76.07%（Plt;0.000 1），發(fā)酵乳桿菌JSWX3L1 組顯著提升至68.52%（Plt;0.05）。

與未發(fā)酵的花生衣相比，乳酸菌發(fā)酵花生衣可能有兩部分成分變化：第一種是花生衣中部分功效物質(zhì)在乳酸菌作用下發(fā)生了轉(zhuǎn)化；第二種是在花生衣原有物質(zhì)的基礎(chǔ)上增加了乳酸菌的某些代謝產(chǎn)物。這兩部分成分變化共同造成發(fā)酵花生衣在抑制AGEs 生成能力和預(yù)防細(xì)胞丙酮醛損傷能力上的變化。針對第一種可能性，乳酸菌發(fā)酵會產(chǎn)生不同的催化酶，如木聚糖酶、蛋白酶和單寧酶，可以解聚和溶解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)骨架中的一些特定植物化學(xué)物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵底物中一些特殊酚類物質(zhì)的釋放或合成，增強底物的抗氧化能力。但具體酚類物質(zhì)的增加及底物功效的增強與乳酸菌菌株密切相關(guān)[14]。針對第二種可能性，有研究發(fā)現(xiàn)不同滅活乳酸菌對脂多糖造成的角質(zhì)形成細(xì)胞活力損傷的預(yù)防能力不同[25]，不同植物乳植桿菌菌株上清液的體外抗氧化能力不同[26]。因此，不同乳酸菌發(fā)酵會改變花生衣的原有抗糖化功能。綜合2.1.1 和2.1.2 的結(jié)果，植物乳植桿菌CCFM1354發(fā)酵提升花生衣抗糖功能的能力最顯著，既能提高體外AGEs 生成抑制率，也能緩解MGO 對HSF細(xì)胞造成的糖化損傷，提升花生衣體外抗糖化能力。

植物乳植桿菌在發(fā)酵提升抗糖化功能方面的作用被多次報道：植物乳植桿桿菌GKM3 發(fā)酵上清液可以通過捕獲糖化劑實現(xiàn)抑制蛋白質(zhì)糖化[27]，植物乳桿菌Kinko-SU4 發(fā)酵花生乳也提升了花生乳的抗糖化特性[7]。而本研究篩選出的體外抗糖化功效最強的菌株也是植物乳植桿菌，與相近研究的結(jié)果具有一致性。因此，選擇植物乳植桿菌CCFM1354 的花生衣發(fā)酵上清液為研究對象，開展體外和體內(nèi)的抗糖化功效評價。

2.2 植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵提升花生衣預(yù)防HSF 細(xì)胞糖化損傷的能力

HG 常被用來模擬糖尿病條件，該培養(yǎng)條件容易引起糖化反應(yīng)并對細(xì)胞造成不利影響。研究表明，30 mM 葡萄糖處理不影響HSF 細(xì)胞的增殖活性，但能明顯上調(diào)細(xì)胞凋亡基因，誘發(fā)炎癥，造成細(xì)胞部分功能異常[19]。

2.2.1 花生衣發(fā)酵液對高糖培養(yǎng)下HSF 細(xì)胞基因表達(dá)的影響

HG 培養(yǎng)會加劇細(xì)胞炎癥并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也會促進(jìn)AGE-RAGE 結(jié)合，從而加劇糖化下游反應(yīng)，同時會造成蛋白質(zhì)異常水解。BAX 是動物細(xì)胞凋亡基因Bcl-2 家族一員，高表達(dá)會加劇細(xì)胞凋亡；NFKB1 能編碼蛋白質(zhì)前體，參與NF-κB 復(fù)合物形成，使糖化下游級聯(lián)反應(yīng)持續(xù)作用；DDOST是調(diào)控RAGE 競爭性受體AGER1 的基因，能通過增加DDOST 的表達(dá)減少AGE-RAGE 的結(jié)合；MMP9 是金屬蛋白水解酶家族一員，與HSF 的生理功能緊密相關(guān)。HG 培養(yǎng)下HSF 的基因表達(dá)水平結(jié)果如圖4 所示。

與對照組相比，模型組BAX mRNA 相對表達(dá)量顯著上升至2.390（Plt;0.000 1）（圖4（a）），與其他研究結(jié)果一致[28]；與模型組相比，Hsp 組中BAX表達(dá)顯著降低至1.410（ Plt;0.001） ， H-CCFM1354組BAX 表達(dá)量顯著降低至1.100（ Plt;0.000 1） 。HG 培養(yǎng)后，模型組NFKB1 mRNA 相對表達(dá)量顯著上升至1.680（Plt;0.000 1）（圖4（b））；與模型組相比，Hsp 和H-CCFM1354 都能顯著降低基因NFKB1相對表達(dá)量（ Plt;0.000 1） 。HG 培養(yǎng)后， 模型組DDOST mRNA 相對表達(dá)量由對照組1.200 降低至0.590 0（圖4（c）），Hsp 干預(yù)能使基因相對表達(dá)量提高至1.070，而H-CCFM1354 干預(yù)后基因相對表達(dá)量仍僅有0.570 0。HG 培養(yǎng)后，與對照組相比，模型組MMP9 mRNA 相對表達(dá)量顯著上升（Plt;0.01）；與模型組相比，Hsp 組能顯著（Plt;0.05）降低基因相對表達(dá)量至1.310（圖4（d）），而H-CCFM134 組的基因表達(dá)量只能降低為1.780，即發(fā)酵沒有明顯提升花生衣調(diào)控MMP9 基因表達(dá)異常的能力。

花生衣能調(diào)控由高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞中BAX、NFKB1、DDOST 和MMP9 基因表達(dá)異常，但具體功能成分未見報道。乳酸菌可以發(fā)酵花生衣提取物，但其中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化尚未明確。益生菌可以通過抑制NF-κB 信號通路，顯著降低細(xì)胞凋亡蛋白BAX 的水平[29]，而BAX 基因和NFKB1 基因密切關(guān)聯(lián)，所以乳酸菌發(fā)酵花生衣對BAX 和NFKB1具有較好的調(diào)控效果。對于DDOST 基因，目前研究未發(fā)現(xiàn)其具體的上游調(diào)控機制，我們推測乳酸菌發(fā)酵改變了花生衣中原有的緩解DDOST 基因表達(dá)缺陷的有效成分，因此，并未提升花生衣調(diào)控DDOST 基因表達(dá)異常的能力。乳酸菌發(fā)酵花生衣依舊能降低高糖模型下HSF 細(xì)胞MMP9 基因的過表達(dá)，只是與發(fā)酵前比未得到顯著提升；在未發(fā)酵的花生衣中，白藜蘆醇是抑制MMP9 基因活性的潛在成分[30]，但白藜蘆醇在發(fā)酵過程中可能發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，變成對MMP9 調(diào)控敏感性低的其他衍生形式， 導(dǎo)致發(fā)酵物改善MMP9 基因異常過表達(dá)的能力降低。綜上，盡管植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵未能全面提升Hsp 的抗糖化功能，但能明顯提升花生衣預(yù)防細(xì)胞高糖損傷下BAX 和NFKB1 基因表達(dá)異常的能力。

2.2.2 花生衣發(fā)酵液對高糖培養(yǎng)下HSF 細(xì)胞產(chǎn)III 型膠原蛋白能力的影響

III 型膠原蛋白是維持皮膚彈性的重要膠原蛋白，人體自然衰老過程中，III 型膠原蛋白的占比會逐漸減低。HSF 細(xì)胞可以分泌III 型膠原蛋白，對傷口愈合和維持皮膚組織正常強度和完整性有重要意義；HG 培養(yǎng)會加劇HSF 細(xì)胞中蛋白水解酶的表達(dá)，減少膠原蛋白合成。采用ELISA 試劑盒檢測細(xì)胞上清液中III 型膠原蛋白含量，結(jié)果如圖5 所示。與對照組相比，HG 模型組的III 型膠原蛋白含量顯著下降至31.85 ng/L（Plt;0.01）；Hsp干預(yù)后的III 型膠原蛋白含量顯著上升至36.56 ng/L（Plt;0.05），H-CCFM1354 干預(yù)后的III 型膠原蛋白含量顯著上升至40.05 ng/L（Plt;0.001）。表明植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣能提升Hsp 預(yù)防III 型膠原蛋白含量下降的能力。

2.3 植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣上清液對D?半乳糖致衰小鼠的影響

2.3.1 灌胃樣品對小鼠體重的影響

實驗期間小鼠體重變化如圖6 所示。在實驗期間，各組小鼠體重均呈現(xiàn)平穩(wěn)增長，組間并未出現(xiàn)明顯差異，表明Hsp 及H-CCFM1354 灌胃樣品（未發(fā)酵花生衣上清液及其發(fā)酵上清液）對小鼠無明顯副作用。

2.3.2 灌胃樣品對血清糖化衰老標(biāo)志物的影響

D?半乳糖致衰是種常見的模擬衰老模型，高劑量D?半乳糖受半乳糖氧化酶催化會刺激活性氧形成，在造成氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的同時也加劇機體糖化反應(yīng)標(biāo)志物AGEs 的生成，刺激后續(xù)糖化損傷發(fā)生。血清中AGEs 含量測定結(jié)果如圖7 所示。以D?半乳糖連續(xù)皮下注射造模后，模型組小鼠血清AGEs 含量較對照組260.2 ng/L 顯著提升至406.2 ng/L（Plt;0.01），與其他D?半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型AGEs 變化趨勢相符[31]。與模型組相比，Hsp組血清AGEs 含量顯著降低至247.0 ng/L（Plt;0.01），H-CCFM1354 組顯著降低至208.4 ng/L（Plt;0.001）。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 的發(fā)酵強化了花生衣抑制血清AGEs 積累的能力，具有更好地抑制后續(xù)機體糖化損傷的潛力。

2.3.3 灌胃樣品對小鼠皮膚彈性性能的影響

D?半乳糖造成的AGEs 積累會造成全身糖化損傷，在皮膚層面主要表現(xiàn)為促進(jìn)皮膚細(xì)胞凋亡并影響其正常生理活性、破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、影響傷口愈合等，直觀反映為表皮變薄、皮膚結(jié)構(gòu)松弛等衰老表象[4]。R2 值被認(rèn)為是最接近皮膚彈性真實狀態(tài)的參數(shù)值，數(shù)值越大表明皮膚彈性越好。由圖8 可知，與對照組的皮膚彈性74.90% 相比，模型組的R2 顯著降低至53.70%（Plt;0.01）；與模型組相比，Hsp 能緩解R2 的降低，使其恢復(fù)至64.90%； H-CCFM1354 顯著恢復(fù)了皮膚彈性性能，使R2 值達(dá)到72.40%（Plt;0.05）。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣顯著提高了小鼠皮膚彈性，比未發(fā)酵花生衣有提升作用。

2.3.4 灌胃樣品對小鼠皮膚病理的影響

皮膚組織Hamp;E 染色結(jié)果如圖9（a） 所示。與對照組相比，模型組表皮嚴(yán)重萎縮、皮突明顯減少、炎性細(xì)胞大量增加，真皮內(nèi)出現(xiàn)充血現(xiàn)象，并且彈性蛋白結(jié)構(gòu)紊亂不清晰，與先前研究中造模出現(xiàn)的皮膚病理情況相吻合[32]。與對照組相比，Hsp 組和H-CCFM1354 組出現(xiàn)表皮萎縮、真皮內(nèi)充血的情況有所緩解。此外，H-CCFM1354組較Hsp 組的炎性細(xì)胞含量明顯減少，彈性蛋白結(jié)構(gòu)更完整清晰。以Image J 軟件對各組皮膚切片的表皮厚度進(jìn)行測量，結(jié)果如圖9（b） 所示。與對照組相比，模型組表皮厚度顯著下降至12.40 μm（Plt;0.01）。與模型組相比，Hsp 組的表皮厚度提升至14.05 μm，H-CCFM1354組的表皮厚度顯著提升至17.00 μm（Plt;0.05）。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣可有效改善衰老小鼠的皮膚表皮萎縮，改善皮膚質(zhì)構(gòu)。

3 結(jié) 論

通過體外AGEs 反應(yīng)體系、細(xì)胞糖損傷模型、D?半乳糖致衰小鼠模型，研究了乳酸菌發(fā)酵對花生衣抗糖化功能的影響，明確花生衣發(fā)酵液體內(nèi)外抗糖化緩解皮膚衰老的關(guān)鍵機制。本研究得到的主要結(jié)論如下：

a. 利用體外AGEs 生成模型和HSF 細(xì)胞丙酮醛損傷模型，從10 株乳酸菌中篩選出1 株能夠提升花生衣體外抗糖化能力的植物乳植桿菌CCFM1354。

b. 構(gòu)建HSF 細(xì)胞高糖模型， 植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵能提高花生衣的抑制BAX 和NFKB1 mRNA 過表達(dá)的能力、緩解高糖下HSF 細(xì)胞III 型膠原蛋白含量降低的能力，但植物乳植桿菌CCFM1354 發(fā)酵花生衣不能阻礙高糖培養(yǎng)下HSF 細(xì)胞的AGE-RAGE 結(jié)合，也不影響HSF 細(xì)胞中蛋白質(zhì)水解相關(guān)的基因表達(dá)。

c. 與未發(fā)酵花生衣相比，口服植物乳植桿菌CCFM1354 的花生衣發(fā)酵液能有效降低D?半乳糖致衰小鼠血清中AGEs 的含量，緩解D?半乳糖致衰小鼠皮膚彈性降低，能更好地減輕D?半乳糖致衰小鼠皮膚病理情況。

綜上，本研究證實植物乳植桿菌CCFM1354發(fā)酵可以提升花生衣的抗糖化功能力，抗糖化特性在體內(nèi)依然起效，填補了口服花生衣抗糖化的研究空白，也為花生衣及其發(fā)酵物作為化妝品或食品抗糖化功效原料提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。