利用Δ15N值評(píng)估不同硝態(tài)氮濃度下的桑樹幼苗無機(jī)氮供需關(guān)系

摘 要：喀斯特地區(qū)土壤中的硝態(tài)氮占主導(dǎo)地位，但土壤中的硝態(tài)氮含量存在時(shí)間和空間上的異質(zhì)性。因此，種植在喀斯特地區(qū)的桑樹幼苗可能會(huì)遭受低氮脅迫。為了給種植在喀斯特地區(qū)的桑樹幼苗提供科學(xué)的無機(jī)氮管理，該研究以桑樹幼苗為材料，采用水培試驗(yàn)，以改進(jìn)的霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液為培養(yǎng)基質(zhì)，以δ15N值為22.35‰的硝酸鈉提供唯一氮源，設(shè)置3個(gè)硝態(tài)氮濃度梯度（0.5、2.0、8.0 mmol·L-1），測定桑樹幼苗的光合特征以及葉、莖和根的干重、碳含量、氮含量和δ15N值，分析不同供氮水平下桑樹幼苗的生理響應(yīng)，通過整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素分餾值評(píng)估桑樹幼苗的氮需求與氮供應(yīng)的關(guān)系，通過植株的氮積累量與碳積累量研究碳氮耦合關(guān)系。結(jié)果表明：（1）當(dāng)硝態(tài)氮濃度在0.5、2.0 mmol·L-1時(shí)，增加硝態(tài)氮的濃度能顯著提高桑樹幼苗的葉綠素含量和凈光合速率，進(jìn)而顯著促進(jìn)生物量的積累。然而，當(dāng)硝態(tài)氮濃度超過2.0 mmol·L-1時(shí)，更多的硝態(tài)氮供應(yīng)（8.0 mmol·L-1）并沒有帶來葉綠素含量、凈光合速率和生物量的顯著增加。（2）增加硝態(tài)氮的供應(yīng)量能促進(jìn)桑樹幼苗的氮同化，桑樹幼苗的氮積累量隨著硝態(tài)氮供應(yīng)量的增加而逐漸增加，然而，桑樹幼苗的碳積累量在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時(shí)無明顯變化。（3）桑樹幼苗的硝態(tài)氮同化產(chǎn)物的穩(wěn)定氮同位素分餾值在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最小。綜上所述，硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)的無機(jī)氮供應(yīng)量接近桑樹幼苗的無機(jī)氮需求量，外部氮供應(yīng)量與植株氮需求量接近平衡意味著植物體內(nèi)的碳氮代謝能夠有效協(xié)調(diào)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了碳氮同化產(chǎn)物的同步增長。

關(guān)鍵詞： 硝態(tài)氮， 桑樹， 碳氮代謝， 穩(wěn)定氮同位素分餾， 氮需求

中圖分類號(hào)：Q945.1" "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" "文章編號(hào)：1000-3142（2024）03-0576-10

Use of Δ15N value to estimate the relationship between inorganic nitrogen supply and nitrogen demand for Morus alba seedlings under different nitrate nitrogen concentrations

ZHANG Furong1， WU Yanyou1，2*， ZHANG Kaiyan3

（ 1. Key Laboratory of Modern Agricultural Equipment and Technology， Ministry of Education， Institute of Agricultural Engineering， Jiangsu University，Zhenjiang 212013， Jiangsu， China; 2. State Key Laboratory of Environmental Geochemistry， Institute of Geochemistry， Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550081， China; 3. School of Karst Science， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China ）

Abstract： "Nitrate is predominant in the karst soils. However， the temporal and spatial heterogeneities are observed for the nitrate content in the soils. Hence， the Morus alba seedlings grown in karst regions may suffer from low nitrogen stress. In order to provide a scientific management of inorganic nitrogen for M. alba seedlings grown in karst regions， the M. alba seedlings were used as the experimental materials in this study. The M. alba seedlings were cultured hydroponically with a modified Hoagland solution. NaNO3， with a δ15N of 22.35‰， was employed as the sole nitrogen source at three concentrations （0.5， 2.0， and 8.0 mmol·L-1） in this study. The photosynthetic characteristics， dry weights， carbon contents， nitrogen contents and δ15N values of the leaves， stems and roots of the M. alba seedlings were measured in this study. The physiological responses to different nitrogen supply levels were analyzed for M. alba seedlings. The relationship between internal nitrogen demand and external nitrogen supply of M. alba seedlings was estimated based on the stable nitrogen isotope fractionation values at the whole-plant scale. The carbon-nitrogen coupling relationship was studied based on the nitrogen accumulation amount （NAA） and carbon accumulation amount" （CAA） in the whole plant. The results were as follows：（1） When the nitrate nitrogen concentrations at 0.5， 2.0 mmol·L-1， increasing nitrate nitrogen concentrations significantly increased the chlorophyll content and net photosynthetic rate of the M. alba seedlings， which in turn significantly promoted the biomass accumulation. However， when the nitrate nitrogen concentration exceeded 2.0 mmol·L-1， more nitrate nitrogen supply （8.0 mmol·L-1） did not lead to a significant increase in the chlorophyll content， net photosynthetic rate and biomass. （2） Increasing the nitrate nitrogen supply could promote the nitrogen assimilation in M. alba seedlings. The NAA in M. alba seedlings gradually increased with increasing nitrate nitrogen supply. However， the CAA in M. alba seedlings did not change significantly at nitrate nitrogen concentrations of 2.0 mmol·L-1 and 8.0 mmol·L-1. （3） The stable nitrogen isotope fractionation values of the nitrate nitrogen assimilates in the whole M. alba seedlings reached the minimum value at 2.0 mmol·L-1. Therefore， the inorganic nitrogen supply at the nitrate nitrogen concentration of 2.0 mmol·L-1 is close to the internal nitrogen demand of M. alba seedlings， and the close balance between external nitrogen supply and internal nitrogen demand of the plants means an effective coordination of carbon and nitrogen metabolism in plants， thus achieving a simultaneous increase in carbon and nitrogen assimilates.

Key words： nitrate nitrogen， Morus alba， carbon and nitrogen metabolism， stable nitrogen isotope fractionation， nitrogen demand

植物吸收利用的無機(jī)氮主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。然而，在通氣性良好或者pH為堿性的土壤中，大量銨根在好氣性細(xì)菌的作用下通過硝化作用迅速轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛岣?。因?yàn)榭λ固氐貐^(qū)的基巖中富含鈣元素（Huang et al.， 2015），并且鈣質(zhì)土壤具有高pH的特點(diǎn)（Wan et al.， 2009），所以喀斯特地區(qū)土壤中銨態(tài)氮會(huì)以很高的速率氧化成硝態(tài)氮，這也加劇了喀斯特地區(qū)土壤低銨多硝的特征。由于喀斯特地區(qū)土壤中的硝態(tài)氮占主導(dǎo)地位，因此，探究喀斯特生境植物對(duì)硝態(tài)氮濃度的生理響應(yīng)具有重要研究意義。

硝酸鹽對(duì)植物的生長具有多重作用，生物圈中99%的有機(jī)氮由植物同化的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化而來（Wang et al.， 1993）。硝態(tài)氮是一種重要的營養(yǎng)元素，同時(shí)在植物體內(nèi)扮演著信號(hào)分子的作用，硝酸鹽能夠調(diào)節(jié)乙烯、脫落酸的合成，并與細(xì)胞分裂素相互作用調(diào)節(jié)植物的衰老 （Wen et al.， 2020）。植物進(jìn)化出了高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以便適應(yīng)土壤中硝態(tài)氮濃度的異質(zhì)性分布。苗艷芳等（2014）研究表明土壤中硝態(tài)氮的積累量是決定氮肥肥效的主要因子，也是決定不同形態(tài)氮素效果的主要因子。因此，探究偏堿性條件下不同濃度的硝態(tài)氮對(duì)植物生長發(fā)育的影響，對(duì)科學(xué)管理喀斯特環(huán)境中植物的無機(jī)氮供應(yīng)具有重要意義。

植物光合碳同化與氮同化聯(lián)系緊密，既相互依存又彼此競爭。光合碳同化是植物利用光反應(yīng)過程中形成的ATP和NADPH把CO2還原成糖類或其他有機(jī)物的過程；植物無機(jī)氮同化是指植物吸收環(huán)境里的NO3-或NH4+，利用光反應(yīng)和暗反應(yīng)產(chǎn)生的還原力和能量，同時(shí)利用碳同化產(chǎn)物作為氨基受體合成氨基酸的過程，植物體中氨基酸的合成將碳同化與氮同化密切聯(lián)系在一起（Wang et al.， 2014；Busch et al.， 2018）。適量施氮會(huì)促進(jìn)植物的氮代謝與碳代謝（張開艷等，2022），同時(shí)氮同化會(huì)消耗很大一部分光合產(chǎn)物和還原力。光合碳同化為氮同化提供能量與骨架，氮同化會(huì)與碳同化競爭光合作用產(chǎn)生的還原力以及中間產(chǎn)物（Geng et al.， 2010）。因此，探究合理的氮素施用量對(duì)提高植物的產(chǎn)量與品質(zhì)有重要研究價(jià)值。

植物根系從培養(yǎng)基質(zhì)中吸收無機(jī)氮后，部分無機(jī)氮在根部同化，未同化的無機(jī)氮部分轉(zhuǎn)運(yùn)到葉部同化，部分返回到培養(yǎng)基質(zhì)中（Hu et al.， 2022）。植物在同化無機(jī)氮時(shí)總是偏愛更輕的氮（14N），相應(yīng)地，流出的未同化的無機(jī)氮就富集更重的無機(jī)氮（15N）。因此，整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素值就相對(duì)偏負(fù)于氮源的穩(wěn)定氮同位素值（Hu amp; Guy， 2020）。整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素值與氮源穩(wěn)定氮同位素值的差值是由氮同位素分餾而造成（Kalcsits amp; Guy， 2013）。在硝酸鹽作為唯一氮源的條件下，整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素分餾值將取決于硝酸還原酶的活力和還原力的供應(yīng)情況。硝酸還原酶活力強(qiáng)，還原力供應(yīng)充足，從根部流入的硝酸鹽就會(huì)盡可能多地被同化，于是，從根部流出的未同化的硝酸鹽的量就會(huì)減少。相應(yīng)地，整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素分餾值就會(huì)偏小。若植物遭受硝酸還原酶活力限制或還原力限制，那么根部流出的未同化的硝酸鹽的量就會(huì)增加，這就會(huì)導(dǎo)致整個(gè)植株尺度的氮同位素分餾增大（Mariotti et al.， 1982）。因此，整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素分餾值就會(huì)與植株的硝酸鹽供需密切相關(guān)?；谕凰刭|(zhì)量平衡方程（Hayes， 2004），可以計(jì)算出種植在不同硝酸鹽濃度下的整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素分餾值，這樣就能在時(shí)間尺度上評(píng)估植物的硝酸鹽供需情況，從而彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法不能在時(shí)間尺度上評(píng)估植物的硝酸鹽供需情況的不足。

桑樹（Morus alba）為多年生落葉木本植物，在我國分布極為廣泛，我國桑園面積居世界之首，提供了世界80%的桑蠶繭生產(chǎn)量。桑樹集較高生態(tài)價(jià)值與較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值于一體，是多元開發(fā)、生態(tài)扶貧的極好樹種。植桑養(yǎng)蠶產(chǎn)業(yè)的成本低，技術(shù)門檻低。我國西南部屬于喀斯特地區(qū)，多山少地，基底脆弱，種桑養(yǎng)蠶效益遠(yuǎn)高于種植甘蔗、玉米、黃豆等農(nóng)作物。桑樹根系發(fā)達(dá)，具有涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙等功效（趙佩霞，2019），對(duì)于土體淺薄、成土速度緩慢、水土流失強(qiáng)烈的我國西南部喀斯特地區(qū)的修復(fù)和治理具有重要的價(jià)值。然而，若桑園氮素供應(yīng)不足，桑樹就會(huì)出現(xiàn)枝葉生長緩慢、枝條柔軟細(xì)短、葉型小、葉質(zhì)差和產(chǎn)量低等現(xiàn)象（袁穎，2018）。此外，適宜的硝態(tài)氮施用量還是桑樹幼苗在逆境下維持高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵（逄好勝等，2014）。但是，桑樹栽培在實(shí)際生產(chǎn)中仍處于粗放管理階段，農(nóng)民為提高產(chǎn)量盲目施用氮肥的狀況普遍存在。過量施用氮肥不但會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的浪費(fèi)，而且還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境問題。許楠等（2012）研究表明桑樹是一種偏硝性的植物。因此，定量研究桑樹幼苗在不同硝態(tài)氮濃度下的供需關(guān)系就能避免硝酸鹽供應(yīng)的不足和過量，從而科學(xué)管理桑樹幼苗的硝酸鹽供應(yīng)?；谝陨夏康?，本研究以桑樹幼苗為研究對(duì)象，依托人工氣候溫室進(jìn)行幼苗培育，采用溶液培養(yǎng)的方法，通過測定桑樹幼苗在不同硝態(tài)氮濃度下的生長情況、碳氮含量與穩(wěn)定氮同位素值，擬探討以下問題：（1）不同硝態(tài)氮濃度下桑樹幼苗的生理響應(yīng)；（2）硝態(tài)氮供應(yīng)與桑樹幼苗無機(jī)氮需求的關(guān)系；（3）桑樹幼苗在不同硝態(tài)氮濃度下的碳氮耦合關(guān)系。通過對(duì)以上問題的闡述，以期實(shí)現(xiàn)科學(xué)施用氮肥和為我國西南部喀斯特地區(qū)桑樹栽培管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)和處理

試驗(yàn)在溫室內(nèi)進(jìn)行，選取若干健康、飽滿、大小一致的桑樹種子（強(qiáng)桑1號(hào)，種子公司購買）浸種后播撒于12孔育苗穴盤中，在穴盤中放置清水以保持培養(yǎng)基質(zhì)濕潤，幼苗萌發(fā)后改用1/8霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液培養(yǎng)，播種60 d后選取萌發(fā)且長勢良好的16顆幼苗移栽到育苗盆中水培培養(yǎng)，培養(yǎng)液為1/4霍格蘭營養(yǎng)液，23 d后選取其中長勢一致的9顆桑樹幼苗采用改進(jìn)的1/2霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行正式試驗(yàn)，每組3盆，共3組，改進(jìn)的1/2霍格蘭營養(yǎng)液成分為1 mmol·L-1 MgSO4·7H2O、0.125 mmol·L-1 KH2PO4、2.5 mmol·L-1 KCl、4 mmol·L-1 CaCl2、0.1875 mmol·L-1 K2SO4、50 μmol·L-1 Fe（Na）EDTA、25 μmol·L-1 H3BO3、2 μmol·L-1 MnSO4·1H2O、2 μmol·L-1 ZnSO4·7H2O、0.1 μmol·L-1 CuSO4·5H2O、0.04 μmol·L-1 CoCl2·6H2O和0.1 μmol·L-1 Na2MoO4·2H2O。δ15N值為22.35‰的硝酸鈉提供唯一氮源。整個(gè)處理持續(xù)20 d，處理期間每2 d更換一次處理液，每次每株桑樹更換500 mL處理液以保持氮源環(huán)境相對(duì)恒定。

根據(jù)喀斯特地區(qū)土壤中硝態(tài)氮含量遠(yuǎn)小于10 mmol·L-1且硝態(tài)氮存在異質(zhì)性分布的實(shí)際情況，本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)硝態(tài)氮濃度梯度，分別為0.5、2.0、8.0 mmol·L-1，其中0.5 mmol·L-1的硝態(tài)氮處理模擬喀斯特低氮水平，2.0 mmol·L-1的硝態(tài)氮處理模擬喀斯特中氮水平，8.0 mmol·L-1的硝態(tài)氮處理模擬喀斯特高氮水平。光照周期為12 h，光照強(qiáng)度為（500±25 ）μmol·m-2·s-1，光照時(shí)溫度為（25±2）℃，晚上的溫度為（19±2）℃，相對(duì)濕度為55%～60%，培養(yǎng)液的pH值為7.5±0.1。

1.2 測定方法

1.2.1 植株生長參數(shù)測定 在試驗(yàn)處理開始前選取長勢一致的3株桑樹幼苗，分別測定其葉、莖和根的干重，取其葉、莖和根干重的平均值作為整個(gè)試驗(yàn)處理中桑樹幼苗葉、莖和根的初始干重。相應(yīng)地，這3株桑樹幼苗葉、莖和根的碳氮含量的平均值近似為整個(gè)試驗(yàn)處理中桑樹幼苗葉、莖和根的初始碳氮含量；這3株桑樹幼苗葉、莖和根的穩(wěn)定氮同位素值的平均值近似為整個(gè)試驗(yàn)處理中桑樹幼苗葉、莖和根的初始穩(wěn)定氮同位素值。

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在試驗(yàn)處理的最后一天將植株分為葉、莖和根三部分，分別用電子天平稱量鮮重后，放置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)108 ℃下殺青40 min，80 ℃烘干至恒重，稱量干重；將葉、莖和根分別研磨成粉末，供后續(xù)測量碳氮含量和穩(wěn)定氮同位素值。

1.2.2 葉綠素含量和光合參數(shù)測定 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在試驗(yàn)處理的最后一天，使用SPAD-502Plus葉綠素儀測定桑樹幼苗由上至下第二片完全展開綠葉的SPAD值（代表葉綠素含量值）。采用便攜式光合儀Li-6800（LI-COR， Lincoln， NE， USA）測量凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和胞間CO2濃度（Ci）。選用6800-01A熒光葉室，在測量過程中使用CO2小鋼瓶維持CO2濃度為400 μmol·mol-1，控制氣體流速為500 mmol·s-1，光合有效輻射為500 μmol·m-2·s-1，葉溫為27 ℃。

1.2.3 光合氮利用效率 光合氮利用效率（photosynthetic nitrogen use efficiency，PNUE）是凈光合速率與葉片氮含量的比值（Poorter amp; Evans，1998），通過以下公式計(jì)算。

PUNE=Pn/CN（1）

式中： Pn為葉片的凈光合速率； CN是葉片的氮含量。

1.2.4 碳氮元素含量測定與碳氮積累量計(jì)算

使用元素分析儀（vario MACRO cube， Germany）測定桑樹幼苗葉、莖和根的總碳含量和總氮含量，其總碳含量和總氮含量表示為葉片干重的質(zhì)量百分比。

氮積累量（nitrogen accumulation amount， NAA）通過以下公式計(jì)算。

NAA=（DWleaf 1×Nleaf 1+DWstem 1×Nstem 1+DWroot 1×Nroot 1）-（DWleaf 0×Nleaf 0+DWstem 0×Nstem 0+DWroot 0×Nroot 0）（2）

式中： DWleaf 1、DWstem 1和DWroot 1分別為試驗(yàn)處理結(jié)束后的葉、莖和根的干重；" Nleaf 1、Nstem 1和Nroot 1分別是通過元素分析儀測定的試驗(yàn)處理結(jié)束后的葉、莖和根的氮含量；DWleaf 0、DWstem 0和DWroot 0分別為試驗(yàn)處理開始前的葉、莖和根的干重； Nleaf 0、Nstem 0和Nroot 0分別是通過元素分析儀測定的試驗(yàn)處理開始前的葉、莖和根的氮含量； NAA的標(biāo)準(zhǔn)誤通過誤差傳遞公式求得。

碳積累量（carbon accumulation amount， CAA）通過以下公式計(jì)算。

CAA=（DWleaf 1×Cleaf 1+DWstem 1×Cstem 1+DWroot 1×Croot 1）-（DWleaf 0×Cleaf 0+DWstem 0×Cstem 0+DWroot 0×Croot 0）（3）

式中： Cleaf 1、Cstem 1和Croot 1分別是通過元素分析儀測定的試驗(yàn)處理結(jié)束后的葉、莖和根的碳含量； Cleaf 0、Cstem 0和Croot 0分別是通過元素分析儀測定的試驗(yàn)處理開始前的葉、莖和根的碳含量； CAA的標(biāo)準(zhǔn)誤通過誤差傳遞公式求得。

1.2.5 穩(wěn)定氮同位素測定 植物樣品的穩(wěn)定氮同位素值（δ15N）使用氣體同位素質(zhì)譜儀（MAT-253， Germany）測定。MAT-253的測定精度為 0.2‰。測定穩(wěn)定氮同位素時(shí)，用IAEA N1、IAEA N2 和 IAEA NO3 進(jìn)行儀器校正。穩(wěn)定氮同位素值通過以下公式計(jì)算。

δ15N（‰）=（Rsample/Rstandard-1）×1 000（4）

式中： Rsample是桑樹幼苗15N/14N的同位素比值； Rstandard為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（大氣中的N2）15N/14N的同位素比值。

測定桑樹幼苗葉、莖和根的穩(wěn)定氮同位素值后，桑樹幼苗整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素值（δ15Nwhole-plant）即可通過以下公式計(jì)算（Robinson et al.， 2000; Wang et al.， 2016）。

δ15Nwhole-plant（‰）=（mleaf×δ15Nleaf+mstem×δ15Nstem+mroot×δ15Nroot）/（mleaf+mstem+mroot）（5）

式中： mleaf、mstem和mroot分別是桑樹幼苗葉、莖和根的含氮總量（g），葉片含氮總量為葉片干重與葉片氮含量的乘積，莖部含氮總量為莖部干重與莖部氮含量的乘積，根部含氮總量為根部干重與根部氮含量的乘積； δ15Nleaf、δ15Nstem和δ15Nroot分別是桑樹幼苗葉、莖和根的穩(wěn)定氮同位素值。

計(jì)算出桑樹幼苗試驗(yàn)處理前后的整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素值后，基于同位素質(zhì)量平衡方程（Hayes， 2004），即可計(jì)算出桑樹幼苗在整個(gè)試驗(yàn)處理期的氮同化產(chǎn)物的穩(wěn)定氮同位素值（δ15Nassimilates），氮同化產(chǎn)物的穩(wěn)定氮同位素值通過以下公式計(jì)算。

δ15Nassimilates（‰）=（m1×δ15Nwhole-plant 1-m0×[JP]δ15Nwhole-plant 0）/（m1-m0）=（ml 1×δ15Nl 1+ms 1×δ15Ns 1+mr 1×δ15Nr 1-ml 0×δ15Nl 0-ms 0×δ15Ns 0-mr 0×δ15Nr 0）/（m1-m0）（6）

式中： δ15Nwhole-plant1 和δ15Nwhole-plant0 分別是桑樹幼苗試驗(yàn)處理后和試驗(yàn)處理前的整個(gè)植株尺度的穩(wěn)定氮同位素值；m1和m0分別是桑樹幼苗試驗(yàn)處理后和試驗(yàn)處理前的整個(gè)植株的含氮總量，整個(gè)植株的含氮總量為葉片含氮總量、莖部含氮總量與根部含量總量的總和； δ15Nl 1、δ15Ns 1和δ15Nr 1 分別是桑樹幼苗試驗(yàn)處理后葉、莖和根的穩(wěn)定氮同位素值； ml 1、ms 1和mr 1分別是桑樹幼苗試驗(yàn)處理后葉、莖和根的含氮總量； δ15Nl 0、δ15Ns 0和δ15Nr 0分別是桑樹幼苗試驗(yàn)處理前葉、莖和根的穩(wěn)定氮同位素值； ml 0、ms 0和mr 0分別是桑樹幼苗試驗(yàn)處理前葉、莖和根的含氮總量； δ15Nassimilates的標(biāo)準(zhǔn)誤通過誤差傳遞公式求得。

桑樹幼苗硝態(tài)氮同化產(chǎn)物的穩(wěn)定氮同位素分餾值（Δ15Nassimilates）通過以下公式計(jì)算（Evans et al.， 1996）。

Δ15Nassimilates（‰）=δ15Nsubstrate-Δ15Nassimilates（7）

式中： δ15Nsubstrate值為22.35‰; Δ15Nassimilates的標(biāo)準(zhǔn)誤通過誤差傳遞公式求得。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 所有測量的數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x[TX-1mm]±sx[TX-0.5mm]）表示，使用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子顯著性差異分析（Tukey’s test， Plt;0.05）。文中的圖用Origin軟件繪制（2019b版本）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硝態(tài)氮濃度對(duì)桑樹幼苗生長的影響

硝態(tài)氮的供應(yīng)量對(duì)桑樹幼苗的生長具有顯著的影響（表1）。增加硝態(tài)氮的供應(yīng)量有助于改善桑樹幼苗的生長情況。桑樹幼苗在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)的植株干重顯著高于0.5 mmol·L-1時(shí)。當(dāng)硝態(tài)氮濃度達(dá)到8.0 mmol·L-1時(shí)，桑樹幼苗的植株干重也是顯著高于0.5 mmol·L-1時(shí)，但與硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)相比無顯著性差異。這表明適當(dāng)增加硝態(tài)氮濃度對(duì)桑樹幼苗的生長起到促進(jìn)作用，但超過一定濃度后，增加硝態(tài)氮濃度帶來的生長促進(jìn)作用就不再顯著。

2.2 不同硝態(tài)氮濃度對(duì)桑樹幼苗光合作用參數(shù)和葉綠素含量的影響

光合作用對(duì)植物生長至關(guān)重要。由表2可知，桑樹幼苗的凈光合速率在硝態(tài)氮濃度為2.0" mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時(shí)顯著高于0.5 mmol·L-1時(shí)，但是當(dāng)硝態(tài)氮濃度升高為8.0 mmol·L-1時(shí)的凈光合速率相對(duì)于2.0 mmol·L-1卻輕微下降，這表明硝態(tài)氮的供應(yīng)達(dá)到一定水平后，繼續(xù)增加硝態(tài)氮的供應(yīng)量對(duì)植物光合作用的促進(jìn)作用有限；增加硝態(tài)氮的濃度有助于桑樹葉綠素的生物合成，桑樹幼苗在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時(shí)的葉綠素含量均顯著高于硝態(tài)氮濃度0.5 mmol·L-1時(shí)，但是桑樹幼苗的葉綠素含量在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時(shí)無顯著變化。

2.3 不同硝態(tài)氮濃度對(duì)桑樹幼苗碳氮含量與碳氮積累量的影響

由圖1可知，相較于碳含量，不同硝態(tài)氮濃度[JP+2]處理對(duì)桑樹幼苗的氮含量產(chǎn)生了更顯著的影響。

在不同硝態(tài)氮濃度處理下，桑樹幼苗除0.5 mmol·L-1下葉片的碳含量顯著低于2.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1外，3個(gè)硝態(tài)氮濃度下桑樹幼苗的莖和根的碳含量均沒有產(chǎn)生顯著性差異，但是施氮顯著增加了桑樹幼苗葉、莖和根的氮含量，并隨著硝態(tài)氮濃度的升高而升高；整體來看，碳元素較為均勻地分布在桑樹幼苗的葉、莖和根中，而氮元素主要集中在桑樹幼苗的葉部。

試驗(yàn)處理期結(jié)束后桑樹幼苗碳、氮積累量計(jì)算結(jié)果如圖2所示，桑樹幼苗的碳積累量隨硝態(tài)氮濃度的升高呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol· L-1時(shí)的碳積累量較0.5 mmol·L-1時(shí)有明顯提升，但2.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1硝態(tài)氮供應(yīng)下的碳積累量無明顯變化。桑樹幼苗的氮積累量則隨著硝態(tài)氮濃度的升高一直升高。這說明在一定范圍內(nèi)增施氮肥能夠促進(jìn)植株碳的同化，但是碳同化不會(huì)隨著氮肥施用量的增加而持續(xù)增加，增施氮肥對(duì)植株生物量的促進(jìn)作用是有限的。

2.4 不同硝態(tài)氮濃度對(duì)桑樹幼苗光合氮利用效率的影響

由圖3可知，桑樹幼苗在硝態(tài)氮濃度為0.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時(shí)獲得了較大的光合氮利用效率，過量的硝態(tài)氮供應(yīng)（8.0 mmol·L-1）反而降低了桑樹幼苗的光合氮利用效率。這表明在一定范圍內(nèi)增加無機(jī)氮的施用量不會(huì)降低桑樹幼苗的光合氮利用效率，但過量施用無機(jī)氮會(huì)造成無機(jī)氮的浪費(fèi)。

2.5 不同硝態(tài)氮濃度對(duì)桑樹幼苗植株氮同化產(chǎn)物δ15N值與Δ15N值的影響

由圖4：A可知，不同硝態(tài)氮濃度處理下的桑樹幼苗氮同化產(chǎn)物的穩(wěn)定氮同位素值均小于氮源（硝酸鈉）的穩(wěn)定氮同位素值，這表明桑樹幼苗在同化硝態(tài)氮時(shí)均發(fā)生了穩(wěn)定氮同位素分餾。桑樹幼苗植株氮同化產(chǎn)物的δ15N值呈先增大后減小的趨勢，在2.0 mmol·L-1硝態(tài)氮濃度時(shí)達(dá)到最大，而在8.0 mmol·L-1硝態(tài)氮濃度時(shí)出現(xiàn)降低；相應(yīng)地，桑樹幼苗植株氮同化產(chǎn)物的Δ15N值則呈先減小再增大的趨勢，在2.0 mmol·L-1硝態(tài)氮濃度時(shí)的植株Δ15N值最小，當(dāng)硝態(tài)氮濃度增加到8.0 mmol·L-1時(shí)，氮同位素分餾值增大。

3 討論與結(jié)論

氮素運(yùn)籌是調(diào)控作物生長發(fā)育、改善光合特性、提高產(chǎn)量的一項(xiàng)重要措施，研究表明作物生長及其產(chǎn)量與其氮素的供給關(guān)系密切（Cui amp; Lee， 2002）， 適當(dāng)增加氮肥可明顯促進(jìn)桑樹生長 （許楠等，2012）。硝態(tài)氮是植物吸收利用的最主要的無機(jī)氮，前期研究表明，桑樹是一種偏硝性的植物（許楠等，2012）。因此，本試驗(yàn)研究了硝態(tài)氮濃度對(duì)桑樹幼苗生長的影響。結(jié)果表明，適當(dāng)增加硝態(tài)氮的濃度對(duì)桑樹幼苗的生長起到顯著的促進(jìn)作用，這可能歸功于2.0 mmol·L-1的無機(jī)氮供應(yīng)顯著促進(jìn)了葉綠素的生物合成，進(jìn)而顯著提高了桑樹幼苗的凈光合速率。然而，更多的硝態(tài)氮供應(yīng)（8.0 mmol·L-1）并沒有導(dǎo)致桑樹幼苗的線性增長，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)的硝態(tài)氮供應(yīng)已經(jīng)超過了桑樹幼苗的無機(jī)氮需求。桑樹幼苗在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時(shí)的葉綠素含量和凈光合速率均無顯著性差異，這表明增施硝態(tài)氮導(dǎo)致的光合促進(jìn)作用存在飽和濃度。此外，更多的硝態(tài)氮供應(yīng)意味著增強(qiáng)的氮同化，這就會(huì)導(dǎo)致光合產(chǎn)物的大量消耗（Geng et al.， 2010），進(jìn)而不利于生物量的積累。

通常情況下，高等植物的氮含量占干重的1.5%～5.0%（Novoa amp; Loomis， 1981），并且增加植物[JP2]的無機(jī)氮供給有利于提高植物的氮含量（Gulmon amp;[JP+1] Chu， 1981）。在本試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)增加硝態(tài)氮的濃度確實(shí)顯著提高了桑樹葉、莖和根的氮含量。相應(yīng)地，桑樹幼苗的氮積累量也就隨之增加。然而，桑樹幼苗雖然在硝態(tài)氮濃度為8.0 mmol·L-1時(shí)獲得最大氮積累量，但是相較于硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)，硝態(tài)氮供應(yīng)濃度提高了4倍，氮積累量僅提高了1.54倍；而硝態(tài)氮濃度從0.5 mmol·L-1增加到2.0 mmol·L-1時(shí)，硝態(tài)氮供應(yīng)濃度同樣提高了4倍，氮積累量卻提高了2倍。這表明桑樹幼苗在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)有相對(duì)更強(qiáng)的氮獲取能力。硝酸還原酶作為一種誘導(dǎo)酶，雖然增加硝態(tài)氮的供應(yīng)量能提高硝酸還原酶的活力從而促進(jìn)桑樹幼苗對(duì)NO3-的吸收和同化（Kaiser amp; Huber， 2001; Black et al.， 2002），但是植物同化NO3-是一個(gè)主動(dòng)耗能過程（Tsay et al.， 1993），過程中植物會(huì)利用本身相當(dāng)一部分的碳源和能量儲(chǔ)備（Huppe amp; Turpin， 1994）。通常，植物每同化一分子硝酸鹽需要消耗20分子ATP（Salsac et al.， 1987），氮積累量越多意味著消耗的能量就越多。本研究中的凈光合速率數(shù)據(jù)顯示，凈光合速率在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1與8.0 mmol·L-1時(shí)并無顯著性差異，相較于2.0 mmol·L-1，8.0 mmol·L-1的硝態(tài)氮供應(yīng)對(duì)桑樹幼苗的光合作用不再繼續(xù)產(chǎn)生促進(jìn)作用。光合作用為植物提供生長所需的物質(zhì)和能量（Walters et al.， 1993），而硝酸鹽的同化則依賴于光合作用產(chǎn)生的能量和還原力（Larsson et al.， 1985）。因此，桑樹幼苗在8.0 mmol·L-1的硝態(tài)氮濃度下的最大氮積累量意味著大量能量的消耗，這就導(dǎo)致了桑樹幼苗在8.0 mmol·L-1硝態(tài)氮濃度下的碳積累量較2.0 mmol·L-1幾乎沒有增加。然而，當(dāng)硝態(tài)氮濃度在0.5～2.0 mmol·L-1時(shí)，增加硝態(tài)氮的供應(yīng)量能實(shí)現(xiàn)桑樹幼苗碳積累量和氮積累量的同步增加。桑樹幼苗的碳積累量在2.0 mmol·L-1硝態(tài)氮濃度下的顯著增加應(yīng)該是光合作用增強(qiáng)的結(jié)果，本研究結(jié)果顯示桑樹幼苗在2.0 mmol·L-1硝態(tài)氮濃度下的凈光合速率顯著高于0.5 mmol·L-1時(shí)的凈光合速率。總體而言，合適的無機(jī)氮供應(yīng)量有助于增強(qiáng)植物的碳氮代謝，而過量的無機(jī)氮供應(yīng)僅有助于增強(qiáng)植物氮代謝，對(duì)碳代謝的促進(jìn)作用不大。因此，通過大量施用氮肥來增產(chǎn)并不科學(xué)。

隨著硝酸鹽供應(yīng)量的增加，葉片中硝酸還原酶的活力不斷增強(qiáng)（Kaiser amp; Huber， 2001; Black et al.， 2002），桑樹幼苗的氮積累量不斷增多。通常，高硝酸還原酶活性對(duì)應(yīng)高的同化產(chǎn)物δ15N值（Pate et al.， 1993），然而，桑樹幼苗的硝態(tài)氮同化產(chǎn)物的δ15N值并沒有隨著硝態(tài)氮濃度的增加而線性增大。桑樹幼苗的硝態(tài)氮同化產(chǎn)物的δ15N值在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大，而在8.0 mmol·L-1時(shí)出現(xiàn)降低，這表明氮同化產(chǎn)物的δ15N值不只與硝酸還原酶活力有關(guān)。桑樹幼苗的硝態(tài)氮同化產(chǎn)物的δ15N值在硝態(tài)氮濃度為8.0 mmol·L-1時(shí)出現(xiàn)降低可能與還原力供應(yīng)不足有關(guān)（Mariotti et al.， 1982），因?yàn)橄鯌B(tài)氮濃度從2.0 mmol·L-1增加到8.0 mmol·L-1時(shí)，光合氮利用效率降低了26.4%，這間接表明還原力的供應(yīng)受到了限制?；谏溆酌绲a(chǎn)物的δ15N值，通過方程（7），即可計(jì)算出桑樹幼苗在不同硝態(tài)氮濃度下整個(gè)植株同化硝態(tài)氮發(fā)生的穩(wěn)定氮同位素分餾值（Δ15N值）。穩(wěn)定氮同位素分餾值能指示外界氮供應(yīng)與植物氮需求之間的關(guān)系（Pritchard amp; Guy， 2005；Kalcsits et al.， 2014），通常情況下，氮同位素分餾值越小，則外界的氮供應(yīng)量越接近植物的氮需求量（即無機(jī)氮的供需平衡），而氮同位素分餾值越大，則表明外界的氮供應(yīng)量低于或超過了植物的氮需求量。本研究結(jié)果表明，桑樹幼苗在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)的Δ15N值達(dá)到最小，并且8.0 mmol·L-1時(shí)的Δ15N值明顯大于2.0 mmol·L-1時(shí)。由此可知，8.0 mmol·L-1的硝態(tài)氮供應(yīng)明顯超過了桑樹幼苗的無機(jī)氮需求，在0.5、2.0、8.0 mmol·L-1 3個(gè)硝態(tài)氮水平中，當(dāng)硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)桑樹幼苗的無機(jī)氮供需明顯最優(yōu)，即供需接近平衡。

綜上所述，基于穩(wěn)定氮同位素技術(shù)，植株在不同硝態(tài)氮濃度下的氮同化產(chǎn)物的穩(wěn)定氮同位素分餾值能夠被量化，進(jìn)而可以通過穩(wěn)定氮同位素分餾值的大小來判斷植物的無機(jī)氮供需是否平衡。確保植物的無機(jī)氮供需平衡能夠避免氮肥的浪費(fèi)和不足。桑樹幼苗在硝態(tài)氮濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)供需接近平衡，這就意味著此時(shí)的植物體內(nèi)的碳氮代謝能夠有效協(xié)調(diào)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了碳氮同化產(chǎn)物的同步增長。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）

基金項(xiàng)目： "貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合基礎(chǔ)［2020］1Y172）。

第一作者： 張富榮（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锏臒o機(jī)氮利用機(jī)制，（E-mail）furongzhang0218@126.com。

*通信作者： "吳沿友，博士，研究員，研究方向?yàn)榭λ固厣鷳B(tài)環(huán)境和環(huán)境地球化學(xué)，（E-mail）wuyanyou@mail.gyig.ac.cn。