化橘紅微生物限度檢查方法適用性研究

葉寶玉 黃妹齊 陳日檬* 紀(jì)小莉 李 蔚

化橘紅又名“化州橘紅”，系廣東道地藥材。其中蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’習(xí)稱“毛橘紅”；柚Citrusgrandis(L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮習(xí)稱“光七爪”“光五爪”[1]?；偌t性溫，味辛、苦，含有多糖、黃酮、香豆素、揮發(fā)油等成分[2-3]，具有散寒、燥濕、利氣、消痰功效，用于風(fēng)寒咳嗽、喉癢痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等[4-5]。其富含多種活性成分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明具有顯著的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，可用于防治糖尿病、心肌損傷[6-7]。

化橘紅為名貴中藥，目前有針對(duì)其本草學(xué)[8]、化學(xué)成分[9]、藥理作用[10]和臨床試驗(yàn)[11]等的研究，但缺少對(duì)化橘紅微生物限度的相關(guān)研究。本研究通過對(duì)化橘紅微生物限度檢查法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并對(duì)其進(jìn)行微生物安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，制定有針對(duì)性的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，使微生物負(fù)荷降低，減少化橘紅的用藥安全風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)其作為廣東道地藥材的健康發(fā)展。

1 儀器與樣品

1.1 儀器

潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），電子天平（MP500B，上海恒平科學(xué)儀器有限公司），熱空氣消毒箱（GR-246，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），高壓滅菌器（GF88DX，致微廈門儀器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082B，上海一恒溫培養(yǎng)箱），霉菌培養(yǎng)箱（HMJ-Ⅲ-250，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），生化培養(yǎng)箱（HPX-Ⅱ-250，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），移液器（Thermo Scientific）。

1.2 菌種

本研究所用菌株均為第3代。銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、乙型副傷寒沙門氏菌[CMCC(B)50094]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號(hào)200909），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批號(hào)191112），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)210617），pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（稀釋液）（批號(hào)220113），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)200308），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)200815），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）（批號(hào)200904），RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)200116），腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)191231），紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)211125），均來自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.4 樣品

化橘紅，來自江西樟樹成方中藥飲片有限公司，批號(hào)20120101。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

根據(jù)2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1105及1006要求，將各試驗(yàn)菌制成菌懸液，終濃度為50～100 cfu/ml。

2.2 供試液的制備

稱取一批75 g化橘紅，利用GF88DX高壓滅菌器進(jìn)行常規(guī)滅菌處理，其中用于沙門菌檢查的20 g化橘紅未做滅菌處理。

取已滅菌處理的化橘紅25 g，加稀釋液至250 ml，充分振搖15 min，制得1∶10供試液。取已滅菌處理的化橘紅25 g，加稀釋液至500 ml，充分振搖15 min，制得1∶20供試液。1∶10供試液20 ml，加稀釋液至100 ml，混勻，制得1∶50供試液。取1∶10供試液、1∶20供試液、1∶50供試液各20 ml于沸水浴中加熱30 min，冷卻后分別作為1∶10、1∶20、1∶50耐熱菌檢查用供試液。

2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1第一次微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1.1需氧菌總數(shù)試驗(yàn)試驗(yàn)組取1∶10的供試液9.9 ml，5份，分別加入5種試驗(yàn)菌（0.1 ml）混勻，各取1 ml注入培養(yǎng)皿中，傾注TSA，平行制備2皿。供試品對(duì)照組：用稀釋液替代菌液，其他操作同試驗(yàn)組。菌液對(duì)照組：取5份9.9 ml的稀釋液，分別加入0.1 ml各菌液，其他操作同試驗(yàn)組。

2.3.1.2霉菌和酵母菌總數(shù)試驗(yàn) 取9.9 ml 1∶10的供試液各2份，分別加入0.1 ml的白色念珠菌、黑曲霉菌菌液，混勻后取1 ml注入培養(yǎng)皿，傾注SDA，其他操作同需氧菌總數(shù)試驗(yàn)。

2.3.1.3耐熱菌總數(shù)試驗(yàn)取1∶10耐熱菌檢查供試液9.9 ml 5支，其他操作同需氧菌總數(shù)試驗(yàn)。

2.3.1.4結(jié)果依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1108，回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)×100%，平皿傾注法中各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)在50%～200%標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。由表1可得知，需氧菌、耐熱菌總數(shù)回收率試驗(yàn)中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率值小于50%，不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，故該常規(guī)法（1∶10）不適用于檢測(cè)化橘紅需氧菌、耐熱菌總數(shù)?？刹捎迷黾酉♂屢旱姆椒?，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)[12]。霉菌和酵母菌所對(duì)應(yīng)的兩種試驗(yàn)菌回收率在77%～89%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求。

表1 1∶10供試液需氧菌/耐熱菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2第2次微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)試驗(yàn)：取9.9 ml的1∶20供試液5份，其他操作與“2.3.1”需氧菌總數(shù)試驗(yàn)相同。耐熱菌總數(shù)試驗(yàn)：分別取1∶20耐熱菌總數(shù)檢查供試液9.9 ml 5份，其他操作與需氧菌總數(shù)相同。由表2可知，金黃色葡萄球菌的回收率在50%～200%范圍內(nèi)，但枯草芽孢桿菌的回收率小于50%，不符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求，說明化橘紅對(duì)枯草芽孢桿菌具有一定抑制作用，因此將供試品進(jìn)一步稀釋，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

表2 1∶20供試液需氧菌/耐熱菌總數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3第3次微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)試驗(yàn)：取9.9 ml的1∶50供試液5份，其他操作同“2.3.1”需氧菌總數(shù)試驗(yàn)。耐熱菌總數(shù)試驗(yàn)：取9.9 ml的1∶50耐熱菌總數(shù)檢查供試液5份，其他操作與需氧菌總數(shù)試驗(yàn)相同。由表3可知，5種計(jì)數(shù)菌的回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求，即采用該微生物計(jì)數(shù)方法進(jìn)行需氧菌、耐熱菌總數(shù)回收率試驗(yàn)。

表3 1∶50供試液需氧菌總數(shù)、酵母菌總數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 控制菌方法適用性試驗(yàn)

2.4.1試驗(yàn)組大腸埃希菌：取1∶10供試液10 ml加入100 ml TSB混勻，再加入大腸埃希菌液（不大于100 cfu/ml）1 ml，搖勻后置于30～35 ℃培養(yǎng)24 h。取1 ml上述培養(yǎng)物接種于100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，觀察是否有菌落生長(zhǎng)并鑒定。

沙門菌試驗(yàn)：取制備好的供試品10 g各2份，分別加入100、200 ml TSB混勻，各加入沙門菌液1 ml，30～35 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 ml上述培養(yǎng)物，加入9.9 ml RV沙門增菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，劃線接種于XLD平板，觀察是否有菌落生長(zhǎng)并鑒定。

耐膽鹽革蘭陰性菌：取20 ml在23 ℃培養(yǎng)2 h的0.1 g供試液，用TSB稀釋制成0.01 g、0.001 g供試液。取培養(yǎng)后的0.1 g供試液2 ml，分別加入到兩管10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，每管1 ml，接著兩管分別加入大腸埃希菌液和銅綠假單胞菌液（均不大于100 cfu/ml）。0.01 g、0.001 g供試液同法操作。將以上6支試管置于33 ℃培養(yǎng)48 h后，劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)后，觀察是否有菌落生長(zhǎng)并鑒定。

2.4.2對(duì)照組供試品對(duì)照組用稀釋液替代菌液，其他操作同2.4.1試驗(yàn)組。陰性對(duì)照組用10 ml稀釋液替代供試品，不加菌液，其他操作同2.4.1試驗(yàn)組。陽性對(duì)照組不加入供試品，其他操作同2.4.1試驗(yàn)組。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1大腸埃希菌由表4的結(jié)果可知，試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組有大腸埃希菌生長(zhǎng)，而供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組無大腸埃希菌生長(zhǎng)。

表4 大腸埃希菌微生物檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2沙門菌化橘紅沙門菌檢查采用直接接種法，TSB體積為100 ml的試驗(yàn)組未檢出沙門菌，說明化橘紅對(duì)沙門菌有一定的抑制作用。當(dāng)TSB體積為200 ml時(shí)，由表5的指示結(jié)果可知，試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組有沙門菌生長(zhǎng)，而供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組無沙門菌生長(zhǎng)。

表5 沙門菌微生物檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

由表6結(jié)果可知，化橘紅耐膽鹽革蘭陰性菌檢查試驗(yàn)中腸道菌增菌液體培養(yǎng)基體積為10 ml，試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組中各稀釋級(jí)（0.1 g、0.01 g、0.001 g）均檢出大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組無目標(biāo)菌落生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明耐膽鹽革蘭陰性菌檢查可采用直接接種法。

表6 耐膽鹽革蘭陰性菌微生物檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

作為中醫(yī)藥重要特色和優(yōu)勢(shì)之一的中藥飲片，其質(zhì)量控制在中藥質(zhì)量控制中處于薄弱環(huán)節(jié)[12-13]?；颊叱Ｐ杓逯蠡蚺莘兴庯嬈?，而經(jīng)過高溫處理后某些污染微生物可能依然能夠存活，會(huì)對(duì)患者的用藥安全性造成威脅[14]。本研究通過對(duì)化橘紅進(jìn)行微生物限度適用性試驗(yàn)，可為藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)及藥品生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行該飲片的質(zhì)量檢查提供檢查方法參考，中藥飲片的用藥安全及微生物質(zhì)量控制提供支持。

本研究發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)方法將化橘紅制成1∶10稀釋度的供試液進(jìn)行需氧菌、耐熱菌總數(shù)回收試驗(yàn)時(shí)，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收比值不達(dá)50%，表明化橘紅含有對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有明顯抑菌作用的成分；采用溶液稀釋法，將化橘紅制成1∶50的供試液后進(jìn)行試驗(yàn)，各菌株回收率均符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求，最終確認(rèn)用1∶50稀釋度進(jìn)行化橘紅的需氧菌、耐熱菌總數(shù)試驗(yàn)。采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)試驗(yàn)，各菌株回收率均符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求。采用直接接種法開展控制菌試驗(yàn)，試驗(yàn)組均能檢出試驗(yàn)菌，最終亦確認(rèn)以直接接種法進(jìn)行化橘紅控制菌檢查。