基于虛擬篩選從中藥中發(fā)現(xiàn)高選擇性靶向DDX3X抑制劑

邵 晨 宋 昱 史學(xué)偉 王寶珍 武 靖 董志強(qiáng)*

人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1, HIV-1）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅。盡管1996年開始引入抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，但據(jù)估計(jì)，全世界仍有3 670萬HIV-1攜帶者，每年死亡人數(shù)超過100萬[1-2]。由于HIV-1潛伏期長(zhǎng)且易變異，迄今為止徹底根除這種病原體或開發(fā)有效的預(yù)防性或治療性疫苗相當(dāng)困難[3]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)有抗病毒藥物的效力提高，HIV-1的復(fù)制可以在大多數(shù)接受治療的患者中成功地停止[4]。此外，免疫功能低下的患者易受細(xì)菌、真菌和病毒感染，這使得治療方案變得復(fù)雜，增加了用藥負(fù)擔(dān)[5]。

為了改善藥物選擇性并解決耐藥性問題，間接作用藥物被提出。HIV-1等病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)，需借助宿主細(xì)胞的各類分子和生化途徑。這些由宿主細(xì)胞提供的輔助因子成為了抑制病毒復(fù)制的潛在藥物靶點(diǎn)[6]。DEAD-box家族包含大量已知被不同病毒吸收的人類蛋白質(zhì)，許多不同的病毒依賴其調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的反應(yīng)，DEAD-box家族中的ATPase/RNA helicase X-linked DEAD-box polypeptide 3（DDX3X）蛋白被確定為是許多不同的病毒調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的依賴蛋白[7]。近年來，針對(duì)DDX3X的ATP和RNA結(jié)合位點(diǎn)開發(fā)出許多小分子抑制劑，尤其是發(fā)現(xiàn)了一種針對(duì)DDX3X的核酸結(jié)合裂縫的RNA競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，它能夠阻斷HIV-1以及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）、登革病毒（dengue virus, DENV）和西尼羅河病毒（west nile virus, WNV）的復(fù)制[8-10]。同時(shí)DDX3X參與不同的細(xì)胞途徑（翻譯、轉(zhuǎn)錄、RNA衰變、核糖體生物發(fā)生），參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、癌變、遷移和缺氧，并在大量腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，被認(rèn)為是抗癌治療學(xué)發(fā)展的新靶點(diǎn)[11-12]。

然而，大多數(shù)DEAD-box家族中RNA解旋酶的ATP和RNA結(jié)合位點(diǎn)具有顯著的相似性，這對(duì)開發(fā)具有絕對(duì)選擇性的藥物帶來了一定的挑戰(zhàn)，除了所有典型的保守結(jié)構(gòu)域外，DDX3X還被證明在參與ATP結(jié)合的基序I（WalkerA）和屬于RNA結(jié)合域的基序Ia之間有一段獨(dú)特的序列（ALRAMKENGRYGRRK，250～264），該序列被稱為“獨(dú)特的基序”[13-14]。值得注意的是，這段序列在DEAD-box家族中的其他蛋白成員中并不存在，而且文獻(xiàn)[15]報(bào)道表明，刪除這個(gè)短基序會(huì)降低DDX3X與核酸的親和力，從而影響DDX3X的RNA解旋酶活性，而用肽封閉這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以減少感染細(xì)胞中的HIV-1復(fù)制。因此，靶向這一獨(dú)特基序的抑制劑對(duì)DDX3X具有高度的選擇性，并可能保留抑制病毒復(fù)制的能力。

在本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)這一獨(dú)特的位點(diǎn)基于中藥化合物數(shù)據(jù)庫篩選出選擇性較強(qiáng)的化合物，通過分子對(duì)接、互作模式分析以及計(jì)算自由結(jié)合能的方法篩選出具有潛在抑制活力的DDX3X抑制劑，并對(duì)活性位點(diǎn)的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行分析，為DDX3X高選擇性抑制劑設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)方案。

1 資料與方法

本實(shí)驗(yàn)所有分子模擬工作運(yùn)用Schr?dinger 2019軟件中各模組完成，Discovery Studio 2020用于視圖操作。

1.1 蛋白準(zhǔn)備

從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）下載DDX3X蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：2I4I）[16]，使用Schr?dinger將蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的水分子刪掉，在“Protein preparation wizard”模塊中，對(duì)蛋白進(jìn)行加氫以及對(duì)蛋白晶體結(jié)構(gòu)中非完整氨基酸殘基進(jìn)行矯正。同時(shí)，根據(jù)PROPKA的pKa預(yù)測(cè)，在pH為7.0下實(shí)現(xiàn)質(zhì)子化殘基的氫鍵優(yōu)化。最后，在OPLS3立場(chǎng)下使蛋白晶體結(jié)構(gòu)能量最小化。

1.2 小分子準(zhǔn)備

模擬過程中的全部小分子均利用Schr?dinger中“LigPrep”模組進(jìn)行處理，將小分子在OPLS3立場(chǎng)下進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，不考慮異變體的因素下，每個(gè)小分子最多只生成一個(gè)立體異構(gòu)體。

1.3 活性位點(diǎn)確定

識(shí)別DDX3X上ATP結(jié)合的基序I（WalkerA）和屬于RNA結(jié)合域的基序Ia之間獨(dú)特的序列（ALRAMKENGRYGRRK, 250～264），將該序列內(nèi)氨基酸構(gòu)成的口袋定義為選擇性位點(diǎn)，基于此位點(diǎn)進(jìn)行選擇性抑制劑篩選。利用SiteMap模塊對(duì)基序進(jìn)行識(shí)別，將識(shí)別后產(chǎn)生的位點(diǎn)定義為選擇性位點(diǎn)。

1.4 分子對(duì)接

模擬實(shí)驗(yàn)中分子對(duì)接部分由Schr?dinger中“Glide”模組完成。通過對(duì)活性位點(diǎn)的確定，在選擇性位點(diǎn)中利用Glide中的HTVS對(duì)接完成初期的對(duì)接篩選，隨后SP對(duì)接進(jìn)一步確定配體-蛋白的結(jié)合效果。對(duì)接精度較高的XP對(duì)接用來分析篩選得到的化合物與蛋白的互作模式。對(duì)接實(shí)驗(yàn)前要評(píng)價(jià)對(duì)接方法的可靠性，將共晶體中的共晶化合物AMP進(jìn)行重新對(duì)接，分析對(duì)接前后的RMSD值，RMSD值小于2?認(rèn)為對(duì)接結(jié)果具有可靠性。

1.5 自由結(jié)合能計(jì)算

自由結(jié)合能可反映配體-蛋白復(fù)合物體系的穩(wěn)定性，通過Prime MM-GBSA對(duì)復(fù)合物體系自由結(jié)合能進(jìn)行計(jì)算。自由結(jié)合能計(jì)算遵循以下方程：

ΔG bind=ΔGMM+ΔG solv+ΔG SA

ΔG bind的計(jì)算涉及到3個(gè)主要方面：氣相自由能（ΔGMM）、溶劑化自由能（ΔG solv）和系統(tǒng)熵變化（ΔG SA）。為了實(shí)現(xiàn)這一計(jì)算，本研究選擇溶劑模型為VSGB，并采用“層次采樣”以高效而系統(tǒng)的方式對(duì)配體-蛋白復(fù)合物進(jìn)行位置、方向和構(gòu)象的系統(tǒng)采樣，以全面捕捉其結(jié)合過程中的各種可能性。同時(shí)，在OPLS3力場(chǎng)下，對(duì)各個(gè)配體-蛋白復(fù)合物體系自由結(jié)合能進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 選擇性位點(diǎn)分析

目前，大多數(shù)DDX3X蛋白解旋酶抑制劑主要瞄準(zhǔn)其RNA結(jié)合位點(diǎn)，然而，特定位點(diǎn)（250～264）的獨(dú)特序列在其他家族蛋白中缺失，為增強(qiáng)對(duì)DDX3X的選擇性提供了潛在優(yōu)勢(shì)。利用SiteMap程序?qū)Α蔼?dú)特的基序”進(jìn)行識(shí)別。如圖1所示，定義選擇位點(diǎn)的中心為X=27.6，Y=0.16，Z=5.02。選擇性位點(diǎn)位于蛋白末端，由一小段α螺旋構(gòu)成，螺旋末端連接著一段loop環(huán)。對(duì)選擇性位點(diǎn)進(jìn)行分析，位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸多為親水性氨基酸，這些氨基酸具有與小分子抑制劑形成氫鍵的潛力，此外多數(shù)氨基酸殘基在口袋內(nèi)呈正電性或負(fù)電性。

圖1 選擇性位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.2 分子對(duì)接篩選

分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)前，對(duì)分子對(duì)接方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采用配體擴(kuò)張法定義共晶化合物（X=17.2，Y=-23.33，Z=16.36）10?范圍內(nèi)的氨基酸為活性位點(diǎn)，將共晶化合物AMP重新對(duì)接后計(jì)算對(duì)接前后AMP構(gòu)象的變化。測(cè)得RMSD值為0.293?，表明本實(shí)驗(yàn)分子對(duì)接方法具有一定的可靠性。首先基于高通量分子對(duì)接篩選方法對(duì)化合物數(shù)據(jù)庫中15萬個(gè)小分子進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示共有123 199個(gè)化合物可以結(jié)合在選擇性位點(diǎn)。隨后調(diào)整對(duì)接精度為SP，將這些化合物與選擇性位點(diǎn)再次對(duì)接，隨后對(duì)結(jié)合分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選取結(jié)合分?jǐn)?shù)排名前3 000的化合物進(jìn)一步進(jìn)行精確度最高的XP對(duì)接。設(shè)置對(duì)接方式為半柔性對(duì)接，將這些候選化合物與選擇性位點(diǎn)對(duì)接。觀察分析對(duì)接后化合物的分子構(gòu)象，剔除那些與選擇性位點(diǎn)構(gòu)象不符合的化合物，同時(shí)對(duì)化合物的結(jié)合分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析，最終確定了20個(gè)化合物有著可以與選擇性位點(diǎn)相匹配的分子構(gòu)象，同時(shí)有著較好的結(jié)合作用。20個(gè)化合物理化性質(zhì)如表1所示。其中化合物1在這些化合物中表現(xiàn)出較強(qiáng)的作用效果，如圖2所示，化合物1分子構(gòu)象由3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，三部分結(jié)構(gòu)均勻地分布在選擇性位點(diǎn)中，且3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的羥基均與活性位點(diǎn)中的氨基酸形成氫鍵。

表1 化合物理化性質(zhì)

圖2 化合物1于選擇性位點(diǎn)作用方式

2.3 自由結(jié)合能計(jì)算

分子對(duì)接篩選得到的化合物表現(xiàn)出可與DDX3X蛋白解旋酶形成較強(qiáng)的結(jié)合作用，但單純的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)并不能證明配體與蛋白可構(gòu)成穩(wěn)定的復(fù)合物體系，需通過MM-GBSA對(duì)分子對(duì)接篩選出的化合物與DDX3X蛋白組成的復(fù)合物體系自由結(jié)合能進(jìn)行計(jì)算，分析蛋白-配體復(fù)合物體系的穩(wěn)定性。在進(jìn)行自由結(jié)合能計(jì)算時(shí)，設(shè)置化合物3?范圍內(nèi)的氨基酸為柔性構(gòu)象。20個(gè)化合物的自由結(jié)合能如表2所示，以ΔGbind=-60 kcal/mol為標(biāo)準(zhǔn)，選擇自由結(jié)合能低于該數(shù)值的化合物，最終確定了11個(gè)化合物。XP精準(zhǔn)對(duì)接結(jié)果顯示化合物1與DDX3D蛋白解旋酶有著較好的結(jié)合效果，自由結(jié)合能計(jì)算結(jié)果顯示兩者構(gòu)成的復(fù)合物體系較為穩(wěn)定，其中庫倫能（ΔGbindCoulomb=-70.239 kcal/mol）以及范德華作用（ΔGbindvdW=-45.423 kcal/mol）提供了主要貢獻(xiàn)。庫倫能表現(xiàn)為靜電作用，選擇性位點(diǎn)上氨基酸Arg、Lys、Asp以及Glu在對(duì)接環(huán)境下，氨基酸上的羥基與氨基電離形成帶電單位，如圖2所示化合物分子表面電勢(shì)圖顯示出較強(qiáng)的負(fù)電性，化合物1不同部位的負(fù)電性與選擇性位點(diǎn)上帶正電荷氨基酸Lys以及Arg結(jié)合形成較強(qiáng)的靜電作用以及氫鍵（ΔGbindHbond=-7.702 kcal/mol）作用，從而提升復(fù)合物的穩(wěn)定性。其他化合物與化合物1相似，庫侖能以及范德華作用為主要貢獻(xiàn)者，其次是氫鍵以及疏水作用。自由結(jié)合能計(jì)算結(jié)果與選擇性位點(diǎn)特征相符，即位點(diǎn)上以帶電荷氨基酸為主，與這些氨基酸發(fā)生靜電作用和氫鍵作用可增強(qiáng)化合物在選擇性位點(diǎn)的結(jié)合效果。

表2 蛋白-配體自由結(jié)合能(kcal/mol)

2.4 互作模式

配體-蛋白間的作用模式?jīng)Q定了復(fù)合物體系的穩(wěn)定性，與關(guān)鍵氨基酸存在相互作用可增強(qiáng)化合物對(duì)蛋白的作用效果。通過DS可視化工具對(duì)這11個(gè)化合物與DDX3X蛋白的作用方式進(jìn)行精確分析。如表3所示，氫鍵和范德華力是11個(gè)化合物中保守的兩種作用力。氨基酸Glu249、Glu256、Arg262、Gln265以及Arg315可以與多個(gè)化合物形成氫鍵作用，此外化合物1、2、5、6、14和15還可以與Glu256以及Arg262帶正電荷氨基酸形成靜電作用，這進(jìn)一步加強(qiáng)了這些化合物與DDX3X蛋白解旋酶的結(jié)合效果。氨基酸Arg296、Arg315以及Gly316與大部分化合物形成范德華力作用。除氫鍵與范德華力這兩種保守作用力外，化合物2、9、11以及14與氨基酸Arg296、Arg252、His318等殘基上的疏水基團(tuán)存在疏水作用。見圖3～4。

表3 配體-蛋白作用方式

圖3 XP對(duì)接后打分TOP20的分子與受體各氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用的數(shù)目

圖4 結(jié)合能排名前三的化合物與DDX3X蛋白解旋酶選擇性位點(diǎn)作用方式

通過對(duì)11個(gè)化合物與蛋白的互作模式進(jìn)行分析，結(jié)合自由結(jié)合能計(jì)算結(jié)果，表明在選擇性位點(diǎn)中，與位點(diǎn)上的氨基酸形成氫鍵的同時(shí)存在靜電作用可進(jìn)一步加強(qiáng)化合物與DDX3X蛋白解旋酶的穩(wěn)定性。氨基酸Glu249、Glu256、Arg262、Gln265以及Arg315作為關(guān)鍵氨基酸與化合物形成氫鍵以及靜電相互作用。通過對(duì)化合物與DDX3X蛋白解旋酶互作模式分析，認(rèn)為化合物1、2、5以及14相比于其他化合物可穩(wěn)定地作用于DDX3X蛋白解旋酶選擇性位點(diǎn)并與蛋白形成更加穩(wěn)定的復(fù)合物體系。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基于DDX3X蛋白解旋酶上一段獨(dú)特的基序構(gòu)建選擇性位點(diǎn)，針對(duì)該選擇性位點(diǎn)對(duì)中藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選，篩選分析得到強(qiáng)效DDX3X蛋白解旋酶選擇性抑制劑。通過分子對(duì)接、自由結(jié)合能計(jì)算以及互作模式分析的方法確定選擇性位點(diǎn)以親水性氨基酸為主且多數(shù)為帶正電荷氨基酸?；衔?、2、5和14（ZINC4096316、ZINC33861462、ZINC67903526、ZINC85530944）可與選擇性位點(diǎn)內(nèi)的Glu249、Glu256、Arg262、Gln265以及Arg315關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵以及靜電作用，與氨基酸Arg296、Arg315以及Gly316等形成范德華力。兩種保守的作用力使得這4種化合物可以與DDX3X蛋白解旋酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物體系，4種化合物可作為潛在的高選擇性DDX3X蛋白解旋酶抑制劑進(jìn)一步開發(fā)。