基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)分析膽通膠囊治療膽汁淤積癥作用機制

王欽，金智華，蔡亮亮

南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南通 226001

膽汁淤積癥是指由膽汁分泌及排泄障礙所引起的一系列病理生理過程，臨床表現(xiàn)為鞏膜、皮膚顏色變黃，乏力，尿液顏色加深變黃，由于血清膽紅素、膽汁酸水平升高，還會導(dǎo)致不同程度的皮膚瘙癢[1-2]。常見的病因有藥物性肝炎、病毒性肝炎、膽結(jié)石、酒精性肝病、先天性膽管狹窄、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性疾病、轉(zhuǎn)移性肝惡性腫瘤等。出現(xiàn)膽汁淤積癥的癥狀后，應(yīng)給予積極的對癥處理和利膽藥物治療?？赏ㄟ^CT、超聲、磁共振、肝穿刺活檢等檢查明確發(fā)生膽汁淤積的具體病因，從而給予對因治療[3]。如果得不到妥善的治療，膽汁淤積的情況持續(xù)加重，可能會對肝臟造成損傷，進展為肝纖維化與肝硬化[4-5]。

中醫(yī)藥治療膽汁淤積癥有較好的療效，常用的具有疏肝利膽、清熱化濕、消除黃疸功效的方劑有茵陳蒿湯、麻黃連翹赤小豆湯、大柴胡湯等，常用的中成藥有茵梔黃顆粒、茵陳退黃膠囊、膽寧片、逍遙丸、龍膽瀉肝丸、疏肝丸、消炎利膽片、柴胡疏肝丸等。膽通膠囊是南通大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，有清熱利濕退黃、活血化瘀功效，適用于肝膽濕熱型膽汁淤積癥患者，還可用于慢性膽囊炎、膽管炎等疾病的治療，主要組成為大黃、山楂2味中藥的粉末，制備工藝簡便，在南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床中應(yīng)用已有近30年的歷史，臨床療效得到長期驗證。為探尋膽通膠囊治療膽汁淤積癥的藥理學(xué)作用機制，本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對接技術(shù)相結(jié)合，以期能為膽通膠囊的臨床應(yīng)用提供研究數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分收集和藥物靶點獲取 將膽通膠囊中的“大黃”輸入中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中收集所有化合物成分，再根據(jù)藥物代謝動力學(xué)原理，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性指數(shù)（DL）≥0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取同時符合以上2 個條件的所有化合物。由于TCMSP 數(shù)據(jù)庫未收錄“山楂”，因而山楂的化學(xué)成分在本草組鑒（HERB）數(shù)據(jù)庫（http：//herb.ac.cn/）中查找。大黃、山楂的靶點數(shù)據(jù)來源于PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對獲取的藥物靶點名稱進行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 獲取膽汁淤積癥的靶點 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www. genecards. org/）中， 物種選擇“人”（Homo sapiens），并以“Cholestasis”為關(guān)鍵詞篩選膽汁淤積癥的靶點。

1.3 獲取藥物-疾病的交集靶點 將1.1項、1.2項中獲取的藥物靶點基因與疾病靶點基因分別輸入VENNY 2.1 工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），獲取藥物-疾病的交集靶點，繪制出韋恩圖。

1.4 構(gòu)建膽通膠囊單味藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.10.0 軟件構(gòu)建膽通膠囊活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，各節(jié)點代表膽通膠囊所含大黃、山楂的活性成分及靶點，各個邊則代表活性成分與靶點之間的相互作用。其中度值較高者為膽通膠囊的主要活性成分。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將膽通膠囊的活性成分、藥物-疾病的交集靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）與Cytoscape 3.10.0 軟件進行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。將藥物-疾病的交集靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫的“Multiple proteins”，物種選擇“Homo sapiens”， meaning of network edges 選擇“evidence”，隱去網(wǎng)絡(luò)中游離的靶點，minimum required interaction score 選擇“high confidence”，導(dǎo)出TSV 格式的“source-target” 數(shù)據(jù)表。 應(yīng)用Cytoscape 3.10.0 軟件打開TSV 數(shù)據(jù)表，利用Network Analyze 插件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，選取度值較高的靶點作為核心靶點[6]。

1.6 基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）對核心靶點進行GO 功能富集分析，獲得膽通膠囊治療膽汁淤積癥的主要生物功能。對核心靶點進行KEGG通路富集分析，獲得膽通膠囊治療膽汁淤積癥的主要信號通路。P＜0.05 表示富集分析結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異，選擇P＜0.05且P值較低的前30個主要信號通路，在微生信工具網(wǎng)站（https：//www.bioinformatics.com.cn/）制作富集分析圖[6]。

1.7 分子對接 將1.4項篩選的膽通膠囊主要活性成分與1.5 項篩選的核心靶點進行分子對接驗證。在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢膽通膠囊主要活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，并保存為SDF 文件格式。將SDF 文件導(dǎo)入ChemBio3D Ultra 14.0.0117 軟件中，應(yīng)用MM2 算法得到能量最低的三維結(jié)構(gòu)式，保存為MOL2 格式。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（PDB）數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖，保存為PDB 文件格式。應(yīng)用PyMol 2.5.5軟件刪除核心靶點蛋白結(jié)構(gòu)中的小分子配體與水分子，導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7 軟件進行加氫等處理，將主要活性成分與核心靶點蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為PDBQT 文件格式，并確定每種核心靶點蛋白的活性口袋坐標(biāo)參數(shù)。最后使用AutoDock Vina 軟件對主要活性成分與核心靶點蛋白進行分子對接，保存最低結(jié)合能的對接數(shù)據(jù)。結(jié)合能越低說明化學(xué)物質(zhì)和蛋白的結(jié)合能力越強，通常認(rèn)為結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol時結(jié)合活性較好[7-8]。

2 研究結(jié)果

2.1 膽通膠囊活性成分 共收集膽通膠囊的活性成分25 個，預(yù)測靶點434 個。膽通膠囊各活性成分基本信息見表1。

表1 膽通膠囊的活性成分

2.2 膽汁淤積癥靶點 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以“Cholestasis”為關(guān)鍵詞進行檢索，共獲得疾病靶點1 039個，將其作為候選靶點來源。

2.3 藥物-疾病交集靶點 得到92個藥物-疾病的交集靶點，韋恩圖見圖1。

圖1 膽通膠囊-膽汁淤積癥交集靶點韋恩圖

2.4 膽通膠囊活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape 3.10.0 軟件的Network Analyze 插件構(gòu)建膽通膠囊活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。外側(cè)環(huán)形排列的淡藍(lán)色節(jié)點為藥物-疾病的交集靶點，環(huán)形內(nèi)的橙色、綠色節(jié)點分別為大黃、山楂的活性成分。每條邊表明藥物主要活性成分與交集靶點存在的關(guān)系?？梢姡? 個藥物活性成分往往與多個交集靶點有關(guān)，1 個交集靶點也往往對應(yīng)多個藥物活性成分，而這些活性成分又屬于不同的中藥，這表明膽通膠囊治療膽汁淤積癥是通過多靶點、多成分、多重通路發(fā)揮作用的。

圖2 膽通膠囊活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

膽通膠囊的活性成分中，蘇齊內(nèi)酯、決明內(nèi)酯、番瀉苷E、20-殷金醇棕櫚酸、（-）-兒茶素和棕櫚胺A 有較高的度值，為膽通膠囊的主要活性成分，見表2。

表2 膽通膠囊的主要活性成分

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫與Cytoscape 3.10.0 軟件構(gòu)建藥物-疾病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。圖中各個節(jié)點代表交集蛋白，各個邊代表蛋白之間的相互作用，度值越高，表明該蛋白與別的蛋白之間的關(guān)系越緊密。

圖3 膽通膠囊-膽汁淤積癥PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將STRING 數(shù)據(jù)庫生成的TSV 文件導(dǎo)出至Cytoscape 3.10.0 軟件，應(yīng)用CytoHubba 插件對蛋白的關(guān)鍵性進行分析，越靠近中心、顏色越深的蛋白，其關(guān)鍵性越高。白蛋白（ALB）、有絲分裂原-活化蛋白激酶1（MAPK1）、類視黃醇X 受體α（RXRA）、HRas 原癌基因、三磷酸鳥苷（GTP）酶（HRAS）、胰島素樣生長因子1（IGF1）、雌激素受體1（ESR1）、內(nèi)皮一氧化氮合成酶3（NOS3）、ras 同源物家族成員A（RHOA）等蛋白在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的度值最高，表明以上蛋白是膽通膠囊治療膽汁淤積癥的核心靶點。

2.6 核心靶點的GO 功能富集分析結(jié)果 見圖4。藥物-疾病交集靶點在人體內(nèi)主要參與精氨酸分解代謝（Arginine catabolic process）、尿素循環(huán)（Urea cycle）、雌激素反應(yīng)（Response to estrogen）、嗜苯胺藍(lán)顆粒腔（Azurophil granule lumen）、富纖維膠凝蛋白1 顆粒腔（Ficolin-1-rich granule lumen）、血液微粒（Blood microparticle）、精氨酸酶活性（Arginase activity）、類固醇激素受體（Steroid hormone receptor activity），以及RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA 結(jié)合（RNA polymeraseⅡtranscription factor activity，ligand-activated sequence-specific DNA binding）等生物過程。

圖4 GO功能富集分析圖

2.7 核心靶點的KEGG 通路富集分析結(jié)果 見圖5。顯示交集靶點在體內(nèi)主要涉及精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、甲狀腺癌（Thyroid cancer）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路（VEGF signaling pathway）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、 催乳素信號通路（Prolactin signaling pathway）、黑色素瘤（Melanoma）、膠質(zhì)瘤（Glioma）等信號通路。

圖5 KEGG通路富集分析圖

2.8 分子對接驗證結(jié)果 將2.4項篩選的膽通膠囊主要活性成分與2.5 項篩選的核心靶點蛋白進行分子對接，見表3 和圖6。膽通膠囊主要活性成分與核心靶點蛋白的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，提示均有較好的結(jié)合活性。膽通膠囊的主要活性成分可對核心靶點蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。

圖6 主要活性成分與核心靶點蛋白的分子對接圖

表3 主要活性成分與核心靶點蛋白的對接結(jié)合能 kcal/mol

3 討論

膽汁淤積癥歸屬于中醫(yī)學(xué)瘟黃范疇，常見病機為濕熱蘊結(jié)于肝膽，氣機不暢，導(dǎo)致膽汁排泄失常，出現(xiàn)膽汁淤積，氣機郁滯日久則可導(dǎo)致血行瘀阻。對于以上病因?qū)е碌哪懼俜e癥患者，治則應(yīng)以清熱利濕退黃、活血化瘀為主。膽通膠囊的主要成分為大黃、山楂2味中藥的粉末，有清熱利濕退黃、活血化瘀功效。大黃具有瀉下攻積、清熱凉血、瀉火解毒、疏肝利膽、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等功效，可用于治療血熱出血、積滯便秘、胃腸積滯、癰腫疔瘡、濕熱黃疸、產(chǎn)后瘀阻、瘀血經(jīng)閉等癥。大黃含有的主要成分為游離型與結(jié)合型蒽醌/蒽酮類、苯丁酮類、黃酮類、二苯乙烯類和色原酮類等[9]。大黃中的結(jié)合型蒽醌/蒽酮類化合物具有瀉下作用，而游離型蒽醌類化合物有清熱、利濕、退黃作用[10]。大黃可使大鼠的膽汁排泄能力顯著增強[11]，大黃中的大黃酸、大黃素等化合物能擴張膽管，促進分泌膽汁，防止肝壞死，舒張奧狄氏括約肌[12]。本研究獲得的大黃主要活性成分為決明內(nèi)酯、番瀉苷E、（-）-兒茶素和棕櫚胺A，屬于游離型蒽醌類化合物。Seo Y 等[13]的研究報道指出，決明內(nèi)酯對叔丁基氫過氧化物誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞死亡具有很明顯的肝保護作用，這種肝保護作用是通過核因子-紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（Nrf2）依賴的抗氧化信號通路發(fā)揮的。Le JM 等[14]撰寫的綜述介紹了番瀉苷具有多種藥理學(xué)特性，如緩解乏力、抗肥胖、降血糖、保護肝臟、抗纖維化、抗炎癥、抗腫瘤和抗神經(jīng)退行性疾病。兒茶素是黃酮類化合物，是活性氧清除劑和金屬離子螯合劑，具有抗氧化活性，其機制主要包括抑制前氧化酶以及誘導(dǎo)產(chǎn)生抗氧化酶，可預(yù)防和治療氧化應(yīng)激引起的疾病[15]。

山楂具有活血化瘀、健脾開胃、行氣散瘀、消食導(dǎo)滯等功效，使?jié)駸嶂皬亩惴窒?，可用于治療胃脘脹滿、肉食積滯、腹痛瀉痢、疝氣疼痛等癥[16]。山楂含有的主要成分為黃酮類和三萜類等[17]。本研究獲得的山楂主要活性成分為蘇齊內(nèi)酯和20-殷金醇棕櫚酸。Pei HM 等[18]發(fā)現(xiàn)，山楂中的牡荊苷7-葡萄糖苷、蘇齊內(nèi)酯和20-殷金醇棕櫚酸等均是治療消化不良的主要活性化合物，涉及環(huán)加氧酶2（PTGS2）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、MAPK1、有絲分裂原-活化蛋白激酶3（MAPK3）、ESR1 等核心靶點，其分子機制主要與減輕炎癥反應(yīng)、促進細(xì)胞增殖和存活、增加腸道水分、促進腸道運動有關(guān)。林道斌等[19]發(fā)現(xiàn)山楂中的主要活性成分可通過抑制炎癥因子表達(dá)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)等機制，作用于環(huán)加氧酶1（PTGS1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、NOS3、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、B型單胺氧化酶（MAOB）等靶點，發(fā)揮肝保護作用，可用于治療非酒精性脂肪性肝病。

HRAS為一種GTP酶，結(jié)合GTP 后，會與絲蘇氨酸蛋白（Raf）激酶結(jié)合，進一步激活有絲分裂原-活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（MAPK/ERK）通路。MAPK1 是MAPK 家族的一個成員，是多種生物化學(xué)信號的整合點，經(jīng)上游激酶的磷酸化激活后，可參與到細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、增殖、分化與發(fā)育等多種過程。Xiang D 等[20]研究了雌激素導(dǎo)致的膽汁淤積誘導(dǎo)的肝臟、腸道損傷與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)聯(lián)，誘導(dǎo)雌激素膽汁淤積大鼠發(fā)生肝臟炎癥，包括腸道和肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激和肝臟、腸道細(xì)胞凋亡，參與激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和MAPK 信號通路。

RXRA 是人類的核受體，參與視黃酸介導(dǎo)的基因激活，進而介導(dǎo)類視黃醇的生化效應(yīng)[21]。類視黃醇X受體（RXR）是膽汁形成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是目前正在研究的膽汁淤積疾病的治療靶點[22]。有研究表明，雄性SD 大鼠接受膽道結(jié)扎后，觀察到肝臟中的多重耐藥相關(guān)蛋白2（Mrp2）下調(diào)，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）上調(diào)，這與肝臟RXRA 蛋白水平的下調(diào)和結(jié)合Mrp2啟動子順式元件有關(guān)；經(jīng)過治療后，肝細(xì)胞的IL-1β、Mrp2 和RXRA 的表達(dá)趨于正常水平，可見發(fā)生阻塞性膽汁淤積時，肝臟中Mrp2、IL-1β參與的特異性調(diào)節(jié)與RXRA的細(xì)胞因子依賴性改變有關(guān)[23]。

IGF1 是一種在肝臟中產(chǎn)生的具有內(nèi)分泌特性的單鏈多肽，生長激素可促進IGF1 的生成，機體內(nèi)有多種細(xì)胞具有IGF1 受體。IGF1 受體與細(xì)胞應(yīng)激、衰老有關(guān)，參與肝臟疾病的發(fā)病過程[24]。Cadoret A 等[25]通過肝臟特異性IGF1 基因敲除小鼠膽管結(jié)扎誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷，與對照組相比，基因敲除小鼠表現(xiàn)出較少的膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，但血清膽汁酸水平比較，兩者沒有統(tǒng)計學(xué)差異；基因敲除小鼠的細(xì)胞角蛋白19、轉(zhuǎn)化生長因子β1、α-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白α1 的表達(dá)水平均低于對照組，表明基因敲除后膽汁淤積耐受性降低，纖維化反應(yīng)增加，因此，IGF1 蛋白參與了膽汁淤積性肝應(yīng)激損傷。

NOS3 主要參與脯氨酸、精氨酸的代謝，代謝產(chǎn)物有一氧化氮（NO）[26]。NO 是一種內(nèi)皮松弛因子，具有舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制白細(xì)胞黏附等功能，參與多種疾病的病理過程[27]。Wang Y 等[28]探討了內(nèi)皮NO 合成酶（NOS）和妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積之間的關(guān)聯(lián)，測定了母體血漿NOS 水平、胎盤mRNA 水平和NOS 的細(xì)胞特異定位，采用多元線性回歸模型確定血清總膽汁酸的獨立因素；結(jié)果表明NOS 在胎盤血管灌注不良和不良妊娠結(jié)局中起重要作用，因而NOS 可預(yù)測妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積的嚴(yán)重程度。

RHOA 是一種小GTP 酶的ras 同源物家族成員（RHO）家族成員，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中發(fā)揮分子開關(guān)的功能[29]。Zhou Q 等[30]進行了一項關(guān)于RHOA/RHO激酶介導(dǎo)調(diào)節(jié)肝硬化大鼠肝內(nèi)血管張力的研究，發(fā)現(xiàn)膽管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)肝硬化大鼠的肝RHOA、RHO 激酶表達(dá)水平增加，因而認(rèn)為RHOA、RHO 激酶的上調(diào)增加了肝硬化大鼠的肝內(nèi)阻力，提高了肝臟對血管收縮劑的敏感性。

通過以上文獻報道可發(fā)現(xiàn)，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出的核心靶點與膽汁淤積癥的發(fā)病過程有關(guān)聯(lián)。而分子對接的結(jié)果表明，膽通膠囊的主要活性成分可對ALB、MAPK1、RXRA、HRAS、IGF1、ESR1、NOS3、RHOA 蛋白發(fā)揮調(diào)控作用，初步闡明了膽通膠囊療效的機制，為后續(xù)的實驗研究提供參考。

綜上所述，膽通膠囊可通過多種活性成分作用于膽汁淤積癥的多個靶點，發(fā)揮多通路治療的作用。南通大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室近年來致力于開發(fā)皮膚科外用制劑和中藥制劑[31-32]，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)給新制劑的開發(fā)、研究提供了除動物實驗、臨床試驗以外的科學(xué)研究手段。