陳玲玲和環(huán)形RNA結(jié)緣的故事

本篇報(bào)道圍繞2022年上海市自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)項(xiàng)目“環(huán)形RNA生成和功能機(jī)制的研究”展開，該獎(jiǎng)項(xiàng)由中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心陳玲玲研究員領(lǐng)銜獲得。

神秘的SC35核斑

1989年的秋天，哈佛醫(yī)學(xué)院湯姆·馬尼亞蒂斯（Tom Maniatis）實(shí)驗(yàn)室的博士后付向東在篩選了幾百株單克隆細(xì)胞系后，終于鑒定出了一個(gè)全新的剪切因子——SC35。

付向東發(fā)現(xiàn)，SC35在細(xì)胞核中的分布呈現(xiàn)出有規(guī)律的斑點(diǎn)狀。經(jīng)過與冷泉港實(shí)驗(yàn)室的大衛(wèi)·斯佩克特（David Spector）的合作，他們發(fā)現(xiàn)SC35組成的斑點(diǎn)與大衛(wèi)早先發(fā)現(xiàn)的“核斑”結(jié)構(gòu)高度重合。他們推測(cè)，SC35核斑為RNA分子的剪切提供了特殊的活動(dòng)場(chǎng)所。

但SC35核斑的復(fù)雜程度遠(yuǎn)不止于此。

將近20年以后，借著基因組學(xué)技術(shù)發(fā)展的東風(fēng)，哈佛醫(yī)學(xué)院的安德魯·切斯（Andrew Chess）團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了兩條名為NEAT1和NEAT2的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。顧名思義，非編碼RNA本身并不能編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)，但能以其他方式調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。安德魯團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，NEAT2（人類肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1，簡(jiǎn)稱MALAT1）集中在SC35核斑內(nèi)部，而NEAT1分布在SC35核斑外圍的一處名為“旁斑”的結(jié)構(gòu)之中。

2009年，包括康涅狄格大學(xué)戈登·卡邁克爾（Gordon Carmichael）在內(nèi)的四個(gè)不同的研究團(tuán)隊(duì)相繼獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)NEAT1對(duì)于維持旁斑結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定至關(guān)重要。陳玲玲彼時(shí)正是戈登指導(dǎo)的博士研究生，她在博士階段研究發(fā)現(xiàn)NEAT1是旁斑的形成所必需的RNA，在人胚胎干細(xì)胞發(fā)育分化的過程中，NEAT1能通過影響旁斑的形成，進(jìn)而對(duì)信使RNA轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核的效率進(jìn)行調(diào)控。

陳玲玲關(guān)注到了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：在當(dāng)時(shí)已經(jīng)鑒定出的上萬(wàn)種長(zhǎng)鏈非編碼RNA之中，NEAT1和NEAT2是唯二在末端不存在多聚腺嘌呤“poly（A）尾巴”的例外。

這令她不禁好奇：在茫茫的基因組中，“poly（A）尾巴”缺失的NEAT1和NEAT2是否還有其他“親戚”呢？

從sno-lncRNA的發(fā)現(xiàn)到“滴血驗(yàn)病”的臨床可能

2009年博士畢業(yè)以后，陳玲玲作為獨(dú)立研究員獲得康涅狄格州干細(xì)胞研究經(jīng)費(fèi)的種子基金，與當(dāng)時(shí)在同一研究機(jī)構(gòu)工作的楊力博士（現(xiàn)任復(fù)旦大學(xué)教授）合作，開始對(duì)“poly（A）尾巴”缺失的長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。2010年陳玲玲回國(guó)，在中國(guó)科學(xué)院原上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所組建了自己的研究團(tuán)隊(duì)。

隨著研究進(jìn)展，陳玲玲和楊力推測(cè)，NEAT1和NEAT2這兩個(gè)特例的背后很可能還隱藏著一類新型的RNA分子。經(jīng)過兩年的研究，他們一共找到了超過300種“poly（A）尾巴”缺失的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。

有趣的是，其中表達(dá)量比較高的幾個(gè)有代表性的RNA分子，在基因組中的位置竟然也非常集中，都坐落于15號(hào)染色體q11到q13間一段跨度為100 kb左右的區(qū)域之中。

這幾個(gè)“poly（A）尾巴” 缺失的新類型RNA分子，由于在它們的頭尾都具有snoRNA的特征序列，因此被陳玲玲命名為“sno-lncRNA”。

隨后的研究中，陳玲玲團(tuán)隊(duì)又揭示了一類特別的分子家族，稱為SPA（5’snoRNA capped， 3’polyadenylated RNA），它們特別之處在于：5’末端是snoRNA ，但3’末端則具有poly（A）尾巴。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)sno-lncRNA和SPA，為一種名為“小胖威利癥”罕見遺傳病的臨床診斷提供了新的希望。

在人群中，平均每一萬(wàn)到三萬(wàn)人之中就會(huì)有一人不幸患有“小胖威利癥”，病童往往身材異常肥胖，神經(jīng)發(fā)育遲緩。

幸運(yùn)的是，如果病童能及時(shí)得到生長(zhǎng)激素的治療，病癥就能得到有效緩解。

但臨床上的困難在于，很多病童在被診斷出病癥的時(shí)候，已經(jīng)錯(cuò)過了接受生長(zhǎng)激素治療的最佳時(shí)期。

那么，是否能在孩子剛剛出生的時(shí)候通過基因水平的診斷就對(duì)疾病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)呢？

事實(shí)上，人類遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，15號(hào)染色體q11到q13間一段跨度為100 kb 左右區(qū)域的片段缺失是導(dǎo)致絕大部分“小胖威利癥”發(fā)病的病因。

很遺憾，這一段和“小胖威利癥”相關(guān)的基因片段中并沒有編碼蛋白質(zhì)的序列，因此不存在蛋白水平的疾病診斷靶點(diǎn)。同時(shí)，因?yàn)椴∪藘蓷l15號(hào)染色體中，只有一條染色體存在片段缺失，并通過“基因印記”的機(jī)制，片段缺失的那份拷貝會(huì)被表達(dá)出RNA，所以也難以通過DNA水平直接對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

如今，這些新RNA的發(fā)現(xiàn)則令人看到了另一種可能性：是否可以對(duì)15號(hào)染色體q11到q13間的sno-lncRNA水平進(jìn)行測(cè)量，并將其發(fā)展為一種新型的“小胖威利癥”診斷手段呢？

2023年，這一臨床轉(zhuǎn)化方向的努力初奏凱歌：陳玲玲團(tuán)隊(duì)與浙江省兒童醫(yī)院鄒朝春教授團(tuán)隊(duì)合作發(fā)現(xiàn)，在正常人體內(nèi)的1微升血液樣品中存在上千個(gè)sno-lncRNA分子，而這些sno-lncRNA分子在“小胖威利癥”患者中的含量則可微乎其微！

總之，這些新分子家族的發(fā)現(xiàn)為人們認(rèn)識(shí)“小胖威利癥”病理和發(fā)展新型檢測(cè)手段提供了源頭依據(jù)。

被低估的環(huán)形RNA：一條新型免疫通路的發(fā)現(xiàn)

除了以上新類型長(zhǎng)鏈非編碼RNA，陳玲玲和楊力對(duì)于另一類特殊的長(zhǎng)鏈非編碼RNA很感興趣。此前就有研究者發(fā)現(xiàn)，在一些信使RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA成熟的過程中，其中的一小部分會(huì)頭尾相連在一起，形成環(huán)形RNA分子。相較線性RNA分子，這些環(huán)形RNA分子表達(dá)水平低，但同時(shí)在體內(nèi)會(huì)更加穩(wěn)定。

這些環(huán)形RNA分子是隨機(jī)產(chǎn)生的嗎？陳楊團(tuán)隊(duì)合作相繼報(bào)道了內(nèi)含子來(lái)源的環(huán)形RNA和外顯子反向剪接來(lái)源的環(huán)形RNA的普遍存在，提出了可變環(huán)化的現(xiàn)象（一個(gè)基因可以產(chǎn)生多個(gè)環(huán)形RNA）及其發(fā)生機(jī)制。

那么這些普遍表達(dá)的環(huán)形RNA是否具有生物學(xué)功能呢？通過解析環(huán)形RNA分子家族“生老病死”的規(guī)律，他們揭示了環(huán)形RNA具有重要功能和應(yīng)用潛能。

首先，陳玲玲實(shí)驗(yàn)室的博士研究生張楊設(shè)計(jì)了一個(gè)新生環(huán)形RNA捕獲檢測(cè)體系，發(fā)現(xiàn)了環(huán)形RNA產(chǎn)生效率低，但是穩(wěn)定性好。

陳玲玲實(shí)驗(yàn)室的博士研究生李響設(shè)計(jì)了一個(gè)遺傳學(xué)篩選實(shí)驗(yàn)：他通過一套誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，讓一段基因序列在刺激下高水平表達(dá)。如果表達(dá)出的序列是線性的，那么不會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)；與之相反，如果表達(dá)出的序列形成了環(huán)形RNA，則會(huì)產(chǎn)生出來(lái)自環(huán)形RNA蛋白表達(dá)產(chǎn)物的強(qiáng)烈紅色熒光信號(hào)。

在這套表達(dá)系統(tǒng)中，李響讓細(xì)胞感染了siRNA病毒文庫(kù)，嘗試對(duì)各個(gè)基因逐一敲低。他猜想，如果存在調(diào)節(jié)環(huán)形RNA生成的基因，那么通過siRNA破壞這些基因，會(huì)降低環(huán)形RNA的產(chǎn)生效率。因此他將興趣集中在那些被敲除后會(huì)導(dǎo)致紅色熒光信號(hào)變?nèi)醯幕颍瑢⑵渥鳛楹罄m(xù)研究的候選基因。

完整的一輪篩選過后，李響發(fā)現(xiàn)了103個(gè)候選基因，它們可以表達(dá)出能與RNA進(jìn)行結(jié)合的蛋白產(chǎn)物。出乎他意料的是，其中竟然有16個(gè)與免疫系統(tǒng)響應(yīng)病毒感染的通路相關(guān)。

難道說，環(huán)形RNA的產(chǎn)生多少，會(huì)由免疫通路的激活程度來(lái)決定嗎？

實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了這個(gè)令人興奮的猜想，病毒的感染的確會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞中環(huán)形RNA的數(shù)量下降。

接下來(lái)，研究者將注意力集中在了一個(gè)名為ILF3的候選基因上。

ILF3基因可以編碼表達(dá)出NF90和NF110兩個(gè)不同的免疫分子。有趣的是，NF90和NF110可以在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，處于從線性向環(huán)形轉(zhuǎn)化過渡階段的RNA分子，通過穩(wěn)定其構(gòu)象促進(jìn)環(huán)形RNA分子的產(chǎn)生。

當(dāng)病毒感染入侵免疫系統(tǒng)時(shí)，大量的NF90和NF110免疫因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)對(duì)病毒的遺傳物質(zhì)進(jìn)行圍剿。這樣一來(lái)，細(xì)胞核內(nèi)的NF90和NF110數(shù)量減少，環(huán)形RNA的產(chǎn)生效率也隨之降低；與此同時(shí)，陳玲玲團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)激活的核酸內(nèi)切酶RNase L，可以快速降解細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)形RNA。

兩個(gè)因素合在一起，環(huán)形RNA產(chǎn)生效率降低，分解速度提高，總體的數(shù)目自然也隨之快速降低下來(lái)。

那么問題來(lái)了，受到如此精細(xì)調(diào)控的環(huán)形RNA分子，在細(xì)胞中究竟發(fā)揮著怎樣的生物學(xué)功能呢？

對(duì)于免疫分子NF90而言，它結(jié)合環(huán)形RNA的親和度要比同樣序列的線性RNA更加強(qiáng)。

那么在其他免疫分子之中，是否也有類似NF90、具有更偏好結(jié)合環(huán)形RNA的情況存在呢？

利用生物化學(xué)手段，陳玲玲團(tuán)隊(duì)的博士研究生劉楚霄系統(tǒng)地篩選了免疫通路中RNA結(jié)合蛋白對(duì)環(huán)形RNA的結(jié)合能力——研究者最終發(fā)現(xiàn)免疫分子PKR能緊密結(jié)合環(huán)形RNA，并且活性也會(huì)隨著結(jié)合環(huán)形RNA而被抑制。

為什么環(huán)形RNA會(huì)抑制PKR呢？劉楚霄設(shè)計(jì)了化學(xué)方法標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的環(huán)形RNA分子的單鏈和雙鏈的區(qū)域，并結(jié)合高通量測(cè)序等手段，預(yù)測(cè)環(huán)形RNA在細(xì)胞內(nèi)的折疊狀態(tài)。這使得團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)很多不同的環(huán)形RNA分子具有類似的折疊方式，即形成分子內(nèi)的短雙鏈結(jié)構(gòu)（這完全不同于具有一樣序列的線性RNA）。這一環(huán)形RNA獨(dú)具的特征使其特異結(jié)合并抑制免疫分子如PKR等在正常情況下的過度激活。

有趣的是，免疫分子PKR活性的過度激活，正是一部分紅斑狼瘡患者的重要特征。

陳玲玲團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的沈南教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在紅斑狼瘡患者的免疫細(xì)胞中的環(huán)形RNA水平要低于對(duì)照人群。

那么是否有可能將環(huán)形RNA設(shè)計(jì)成具有特殊折疊構(gòu)象的RNA藥物，通過抑制免疫分子PKR來(lái)緩解紅斑狼瘡患者的癥狀呢？

陳玲玲團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出了低免疫活性的環(huán)形RNA分子，并初步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了它們對(duì)于PKR免疫通路的抑制作用。

環(huán)形RNA分子未來(lái)是否能在PKR異常激活的炎癥性疾病模型中乃至人體臨床試驗(yàn)取得成效呢？最近陳玲玲團(tuán)隊(duì)的研究表明，體外合成的環(huán)形RNA不僅是PKR的高效抑制劑，更重要的是，體外合成的環(huán)形RNA無(wú)需像mRNA一樣進(jìn)行額外修飾去除免疫原性，環(huán)形RNA本身就是低免疫原性的，因此具有良好的應(yīng)用前景。

我們樂觀地等待它們接受事實(shí)的檢驗(yàn)。

本文作者黃宇翔是密歇根大學(xué)在讀博士研究生，主要研究“細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制”，科普作品主要圍繞生命科學(xué)及相關(guān)學(xué)科方向

術(shù)語(yǔ)對(duì)照

snoRNA""""""""""""""""""""""""""""""" 小核仁RNA

sno-lncRNA"""""""" 含有小核仁RNA的長(zhǎng)非編碼RNA

siRNA""""""""""""""""""""""""""""""""" 小干擾RNA

PKR""""""""""""""""""""""" 雙鏈RNA活化的蛋白激酶

EIF2α"""""""""""""""""""""""""""""" 真核起始因子2α