益氣升清方調(diào)節(jié)HIF-1α/NLRP3信號(hào)通路對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元焦亡的影響

摘要：目的 探究益氣升清方調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）信號(hào)通路對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元焦亡的影響。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組），模型組（M組），益氣升清方低、中、高劑量組（3.465、6.930、13.860 g/kg）及益氣升清方高劑量+HIF-1α激活劑DMOG組（13.860 g/kg益氣升清方+40 mg/kg DMOG），每組15只。采用線栓法構(gòu)建腦卒中模型。造模成功后進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)估；TTC染色評(píng)估腦梗死體積；ELISA法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18水平；HE染色檢測(cè)缺血皮質(zhì)區(qū)病理變化；TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡；Western blot檢測(cè)焦亡及HIF-1α/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果 與S組比較，M組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、梗死體積、IL-1β含量、IL-18含量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、胞膜穿孔蛋白D-N端（GSDMD-N）、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、HIF-1α、NLRP3蛋白水平均上升（P＜0.05）；與M組比較，低、中、高劑量益氣升清方組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、梗死體積、IL-1β含量、IL-18含量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、GSDMD-N、Caspase-1、HIF-1α、NLRP3蛋白水平均下調(diào)（P＜0.05）；DMOG減弱了高劑量益氣升清方對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元焦亡的改善作用。結(jié)論 益氣升清方可能通過下調(diào)HIF-1α/NLRP3信號(hào)通路減輕缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元焦亡。

關(guān)鍵詞：卒中；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；NLR家族，熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3；神經(jīng)元；細(xì)胞焦亡；益氣升清方

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231141

Influence of Yiqi Shengqing recipe on neuron pyroptosis in ischemic stroke rats by regulating HIF-1α/NLRP3 signal pathway

WANG Yue1， QUAN Xingmiao1， WANG Yu2， SONG Chunxia1△， SHAO Yue3， XU Liwei1

1 Department of Traditional Chinese Medicine， the Affiliated Hospital of Chengde Medical University Chengde 067000， China; 2 Department of Acupuncture and Massage， Chengde Hospital of Traditional Chinese Medicine; 3 Department of

Orthopedics and Traumatology， the Affiliated Hospital of Chengde Medical University

Corresponding Author E-mail： scx-scx-001@163.com

Abstract： Objective To investigate the influence of Yiqi Shengqing recipe on neuronal pyroptosis in ischemic stroke rats by regulating hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）/NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 （NLRP3） signal pathway. Methods SD rats were randomly divided into the sham operation group （S group）， the model group （M group）， the low， medium and high dose （3.465， 6.930 and 13.860 g/kg） Yiqi Shengqing recipe groups， and high-dose Yiqi Shengqing recipe+HIF-1α activator DMOG （13.860 g/kg Yiqi Shengqing recipe+40 mg/kg DMOG） group， 15 animals in each group. The stroke model was constructed by thread plug method. After successful modeling， neural function defects were evaluated including TTC staining for evaluating the volume of cerebral infarction， ELISA for detecting the serum interleukin （IL）-1β and IL-18 levels， HE staining for detecting pathological changes of ischemic cortex， TUNEL staining for detecting neuronal apoptosis and Western blot assay for detecting the expression of pyroprotein and HIF-1α/NLRP3 pathway protein. Results Compared with the S group， the neurological deficit score， infarct volume， IL-1β， IL-18 contents， apoptosis rate of nerve cells， GasderminD-N （GSDMD-N）， Caspase-1， HIF-1α and NLRP3 protein levels were increased in the M group （P＜0.05）. Compared with the M group， the neurological defect score， infarct volume， IL-1β， IL-18 contents， neuronal apoptosis rate， GSDMD-N， Caspase-1， HIF-1α and NLRP3 protein levels were decreased in the low， medium and high dose Yiqi Shengqing recipe groups （P＜0.05）. DMOG attenuated the improvement effect of high-dose Yiqi Shengqing recipe on neuronal death in ischemic stroke rats. Conclusion Yiqi Shengqing recipe may reduce the neuronal pyroptosis in ischemic stroke rats by down-regulating HIF-1α/NLRP3 signal pathway.

Key words： stroke; hypoxia-inducible factor 1， alpha subunit; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; neurons; pyroptosis; Yiqi Shengqing recipe

缺血性腦卒中是腦卒中的常見類型，有較高的發(fā)病率和病死率［1］。目前，治療缺血性腦卒中的主要手段是使用溶栓藥物來恢復(fù)供血［2］，但溶栓藥物須在癥狀發(fā)生5 h以內(nèi)給藥，且約50%接受該治療的患者出現(xiàn)腦缺血/再灌注損傷，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［3］。因此，迫切需要新的和更可靠的治療方法。炎癥和細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷的關(guān)鍵因素［4］。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的重要因子，在缺血性腦卒中大鼠腦組織呈高表達(dá)，抑制其表達(dá)可減輕神經(jīng)元凋亡［5］。最近研究表明，HIF-1α可通過激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小體誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腦卒中后的神經(jīng)元焦亡［6］。因此，靶向HIF-1α/NLRP3信號(hào)通路是治療腦卒中的潛在靶點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為，缺血性腦卒中應(yīng)以補(bǔ)氣、化痰、活血化瘀為主要治則［7］。益氣升清方具有補(bǔ)氣活血、化痰益氣的功效，切合缺血性腦卒中的主要病機(jī)。研究顯示，益氣升清方聯(lián)合針刺可改善腦卒中患者的吞咽和神經(jīng)功能［8］。然而，益氣升清方對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)元焦亡的影響及機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討該方對(duì)缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 95只8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠由廣州銳格生物科技有限公司提供，體質(zhì)量（220±20）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0059。本研究已獲得承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)CYFYLL2020242），實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守3R原則。

1.2 主要試劑 益氣升清方由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供（組成：黃芪15 g、炙甘草9 g、南沙參9 g、升麻9 g、葛根9 g等）；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18試劑盒購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液購(gòu)自北京康瑞納生物科技有限公司；兔源胱天蛋白酶1（Caspase-1）、NLRP3、HIF-1α、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology；胞膜穿孔蛋白D-N端（GSDMD-N）購(gòu)自HuaBio。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取15只大鼠記為假手術(shù)組（S組），其余80只大鼠采用線栓法阻塞動(dòng)脈90 min建立腦卒中模型。將大鼠麻醉后固定在操作臺(tái)上，在頸正中做1.5 cm左右切口，分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸外動(dòng)脈（ECA）。用尼龍線栓消毒后結(jié)扎CCA和ECA，動(dòng)脈夾夾閉ICA，用注射器針頭輔助線栓插入CCA，拔出針頭后，繼續(xù)推進(jìn)線栓，松開動(dòng)脈夾，使線栓于分叉處進(jìn)入ICA 20 mm左右，線栓固定結(jié)扎后，逐層縫合消毒，90 min后將線栓拔出后用激光多普勒血流儀測(cè)量腦血流量，大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）期間血流量減少80%，再灌注后血流量恢復(fù)。S組不插入線栓，其余步驟與造模大鼠相同。造模過程中有3只大鼠死亡，2只造模失敗，共75只造模成功。

將75只造模成功大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組（M組）、益氣升清方低劑量（L-Med，3.465 g/kg，1/2臨床劑量）、中劑量（M-Med，6.930 g/kg，臨床劑量）和高劑量（H-Med，13.860 g/kg，2倍臨床劑量）組［9］以及益氣升清方高劑量+HIF-1α激活劑DMOG（H-Med+DMOG，灌胃13.860 g/kg益氣升清方+腹腔注射40 mg/kg DMOG）組［10］，每組15只。造模成功第2天開始藥物治療，每日1次，L-Med、M-Med、H-Med組灌胃藥物同時(shí)腹腔注射40 mg/kg生理鹽水，連續(xù)給藥8周。S組和M組給予等量生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)功能缺陷評(píng)估 藥物治療結(jié)束第2天，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分來評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：行為正常記0分，左前肢無法完全伸展記1分，向左轉(zhuǎn)圈記2分，向左摔倒記3分，不能自發(fā)行走或失去知覺記4分。

1.3.3 樣本采集 神經(jīng)功能缺陷評(píng)估后將大鼠麻醉，通過腹主動(dòng)脈采集血液3 mL，取血后將大鼠處死，5只大鼠的全腦用于腦梗死體積評(píng)估，5只大鼠的缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)用于HE染色和TUNEL染色，5只大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)用于Western blot檢測(cè)。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清IL-1β、IL-18水平 將血液經(jīng)離心機(jī)4 000 r/min離心10 min后分離血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清IL-1β、IL-18水平。

1.3.5 腦梗死體積評(píng)估 取大鼠全腦，用手術(shù)刀制作2 mm左右的冠狀切片，用TTC染色20 min后，4%多聚甲醛固定24 h，紅色區(qū)域?yàn)檎?，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ啦课?。由圖像分析軟件Image J分析梗死體積（%）。梗死體積（%）=（梗死面積之和/切片面積之和）×100%。

1.3.6 HE染色觀察缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理變化 將保存在4%多聚甲醛的缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)脫水、包埋后制成5 μm石蠟切片，脫蠟至水后，用蘇木精和伊紅染色，最后脫水、封片，顯微鏡下觀察缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理變化。

1.3.7 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況 將石蠟切片脫蠟至水后與100 μL Equilibration Buffer混合，靜置20 min，隨后加入TUNEL反應(yīng)混合液孵育1 h，PBS沖洗后用DAPI染色10 min，甘油封固后置于熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞為綠色，細(xì)胞核用DAPI染色。細(xì)胞凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.8 Western blot檢測(cè)焦亡蛋白以及HIF-1α/NLRP3通路蛋白表達(dá) 提取上述保存的大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)總蛋白，總蛋白經(jīng)變性、定量、電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜，之后用5%BSA將膜封閉2 h，加入一抗GSDMD-N、Caspase-1、NLRP3、HIF-1α和GAPDH（均1︰1 000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗（1︰2 000）繼續(xù)孵育4 h，加入顯色劑顯影后，Image Lab?軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布時(shí)，組間比較使用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及腦梗死體積比較 與S組相比，M組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及梗死體積均顯著增加（P＜0.05）；與M組相比，L-Med、M-Med、H-Med組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及梗死體積顯著減?。≒＜0.05），且H-Med組作用效果最佳；H-Med+DMOG組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及梗死體積較H-Med組顯著增加（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 M組較S組IL-1β、IL-18含量均顯著上升（P＜0.05）；與M組相比，L-Med、M-Med、H-Med組IL-1β、IL-18含量均依次下降（P＜0.05）；H-Med+DMOG組較H-Med組IL-1β、IL-18含量顯著增加（P＜0.05），見表2。

2.3 各組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)病理變化 HE染色結(jié)果顯示，S組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，染色清晰，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞排列整齊，未見病理?yè)p傷現(xiàn)象；M組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)變形、壞死、腫脹現(xiàn)象，細(xì)胞排列雜亂無序；L-Med、M-Med、H-Med組均改善了以上現(xiàn)象，且H-Med組改善效果最好，與S組結(jié)構(gòu)類似；H-Med+DMOG組與M組結(jié)構(gòu)相似，見圖2。

2.4 各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況比較 M組較S組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率（%）顯著升高（31.32±3.21 vs. 4.76±0.34）；與M組相比，L-Med、M-Med、H-Med組（23.76±2.35、15.23±1.53、7.33±0.82）神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低；H-Med+DMOG組（24.34±2.34）較H-Med組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著上升（n=5，F(xiàn)=134.423，P＜0.01）。TUNEL染色結(jié)果見圖3。

2.5 各組大鼠腦組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 M組較S組GSDMD-N、Caspase-1蛋白水平均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與M組相比，L-Med、M-Med、H-Med組GSDMD-N、Caspase-1蛋白水平均依次下調(diào)（P＜0.05）；H-Med+DMOG組較H-Med組GSDMD-N、Caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05），見圖4、表3。

2.6 各組大鼠腦組織HIF-1α/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 M組較S組HIF-1α、NLRP3蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與M組相比，L-Med、M-Med、H-Med組HIF-1α、NLRP3蛋白水平均依次下降（P＜0.05）；H-Med+DMOG組較H-Med組蛋白水平升高（P＜0.05），見圖5、表4。

3 討論

3.1 益氣升清方減輕缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)損傷 缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重威脅患者生命的腦血管疾病，中藥復(fù)方制劑具有不良反應(yīng)少、作用靶點(diǎn)多的特點(diǎn)，在缺血性腦卒中的治療中可發(fā)揮積極作用，如補(bǔ)陽(yáng)還五湯［11］、蘇合香丸［12］。益氣升清方以“補(bǔ)氣諸藥之最”—黃芪為君藥；南沙參，化痰益氣為臣藥；升麻，助君藥升舉清陽(yáng)；葛根，益氣生津；升麻與葛根共為佐使；炙甘草，補(bǔ)中益氣?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，黃芪可通過抗炎、抗凋亡作用改善缺血性腦卒中［13］。升麻的主要活性成分升麻素苷和葛根的活性成分葛根素可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕腦卒中大鼠神經(jīng)損傷［14-15］。本研究結(jié)果顯示，益氣升清方可降低模型大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及腦梗死體積，改善腦組織病理?yè)p傷，提示該方可能對(duì)缺血性腦卒中具有保護(hù)作用。

3.2 益氣升清方抑制缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)細(xì)胞焦亡 炎癥是缺血性腦卒中必不可少的病理過程之一，NLRP3炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是缺血性卒中炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)［16］。細(xì)胞焦亡作為一種新型細(xì)胞死亡方式，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物釋放激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，依賴Caspase-1是細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)NLRP3可以激活Caspase-1，而腦缺血后Caspase-1、NLRP3均高表達(dá)，下調(diào)Caspase-1、NLRP3可改善腦缺血損傷［17］。NLRP3除了激活Caspase-1外還可以使促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18釋放以及焦亡誘導(dǎo)蛋白GSDMD裂解和分泌［18］。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-18含量，腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和Caspase-1、GSDMD-N蛋白水平均升高，表明模型大鼠神經(jīng)元出現(xiàn)焦亡；而給予益氣升清方治療后，模型大鼠血清炎性因子水平、神經(jīng)元凋亡率、焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、GSDMD-N水平均降低，提示益氣升清方可能通過降低炎癥反應(yīng)、減輕細(xì)胞焦亡進(jìn)而緩解缺血性腦卒中。

3.3 益氣升清方通過抑制HIF-1α/NLRP3信號(hào)軸改善缺血性腦卒中 HIF-1α對(duì)缺氧環(huán)境中細(xì)胞的重要性已被證實(shí)，HIF-1α通過調(diào)控超過100個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，參與復(fù)雜的腦損傷過程，如細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)［19］。研究顯示，抑制HIF-1α信號(hào)通路可能會(huì)逆轉(zhuǎn)缺血性腦損傷的有害影響［20］；且HIF-1α可通過抑制NLRP3炎性小體復(fù)合物減輕炎癥反應(yīng)，從而緩解卒中后的神經(jīng)細(xì)胞焦亡［6］。在本研究中，模型大鼠腦組織中HIF-1α、NLRP3蛋白水平均升高；而給予益氣升清方干預(yù)后，兩種蛋白水平降低，因此推測(cè)益氣升清方對(duì)缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與調(diào)控HIF-1α/NLRP3信號(hào)軸有關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)此推測(cè)，本研究在益氣升清方干預(yù)的基礎(chǔ)上使用HIF-1α激活劑DMOG來激活HIF-1α/NLRP3信號(hào)軸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMOG減弱了益氣升清方對(duì)腦卒中大鼠的保護(hù)作用，提示該方可通過抑制HIF-1α/NLRP3信號(hào)軸改善缺血性腦卒中。

綜上所述，益氣升清方緩解缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)損傷的作用機(jī)制可能與抑制HIF-1α/NLRP3通路、改善神經(jīng)炎癥和焦亡有關(guān)。本研究為益氣升清方作為抗缺血性腦卒中藥物提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，將有助于指導(dǎo)其臨床應(yīng)用。但由于益氣升清方的藥物組成復(fù)雜，仍需進(jìn)一步明確其抗缺血性腦卒中的主要活性成分與分子機(jī)制。此外，本研究為基礎(chǔ)研究，下一步將進(jìn)行臨床研究對(duì)該方的療效加以驗(yàn)證。

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基金項(xiàng)目：河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2022154）

作者單位：1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科（郵編067000）;2承德市中醫(yī)院針灸推拿科;3承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨傷科

作者簡(jiǎn)介：王月（1990），女，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)學(xué)方面研究。E-mail：lucksong8@163.com

通信作者 E-mail：scx-scx-001@163.com

（本文編輯 李鵬）