銀耳多糖抑菌效果研究

摘 要：采用抑菌圈試驗檢測古田銀耳多糖對5種常見致病菌的抑菌效果，結果表明，1.87 μg·mL-1銀耳多糖溶液對銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌均有一定的抑制作用，但是1.87～151.42 μg·mL-1銀耳多糖溶液對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均無明顯的抑制作用。

關鍵詞：抑菌圈試驗；古田銀耳；致病菌；抑菌效果

Research on the Antibacterial Effect of Polysaccharides from Tremella fuciformis

SONG Yang， PAN Lixiu， CHEN Jie， GUO Linkai， SONG Dongxiao， HUANG Xunrui*

（Ningde Center for Food and Drug Control， Ningde 352100， China）

Abstract： The antibacterial effect of Gutian Tremella fuciformis polysaccharides on five common pathogenic bacteria was tested using the antibacterial circle test. The results showed that a 1.87 μg·mL-1 Tremella fuciformis polysaccharide solution had a certain inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa， Salmonella paratyphi B， and Escherichia coli， but a 1.87～151.42 μg·mL-1 Tremella fuciformis polysaccharide solution had no significant inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Candida albicans.

Keywords： antibacterial circle test; Gutian Tremella fuciformis; pathogenic bacteria; bacteriostatic effect

銀耳（Tremella fuciformis），也稱白木耳、雪耳等，是擔子菌門真菌銀耳的子實體，顏色多為白色或淡黃色，呈葉狀、凝膠狀，分布廣泛，特別是在熱帶地區(qū)，常見于闊葉樹的腐木上，在我國福建省、浙江省、廣東省、安徽省、四川省和江蘇省等地多有分布[1-2]。銀耳營養(yǎng)素豐富，多糖、膳食纖維、蛋白質(zhì)含量高，能量低，還含有鈣、鈉、硫、磷、鎂、鐵和鉀等多種微量元素，越來越受到人們的喜歡[3]。福建省古田縣是目前全國最大的銀耳商品生產(chǎn)基地和開發(fā)品種最齊全的食用菌生產(chǎn)基地縣[4]，2004年6月“古田銀耳”獲得“中國地理標志保護產(chǎn)品”榮譽稱號[5]。

銅綠假單胞菌是一種可引起燒傷感染、肺炎、腸炎和腦膜炎的致病菌，且容易引起院內(nèi)感染[6-7]；乙型副傷寒沙門菌容易引起急性胃腸炎或腹瀉等腸道疾病[8-9]；大腸埃希菌是人腸道中正常存在的條件性致病菌，其某些血清型能產(chǎn)生腸毒素，具有致病性[10]；金黃色葡萄球菌是引起感染和危及生命的主要病原體[11]；白色念珠菌是真菌感染常見致病菌，也容易導致院內(nèi)獲得性念珠菌感染[12-13]。

銀耳多糖是一種以甘露糖為主，包含鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、木糖和巖藻糖的酸性雜多糖，含量占銀耳的60%～70%，是銀耳中重要的活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂、降血糖和調(diào)節(jié)免疫等作用[14-16]，本文進一步研究了銀耳多糖在抑菌方面的作用，以期擴寬銀耳多糖的應用范圍。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

銀耳，購自福建古田縣戴氏果蔬專業(yè)合作社。

1.1.2 試劑

大腸埃希菌（產(chǎn)品號：33053，批號：230506）、金黃色葡萄球菌（產(chǎn)品號：33025，批號：230418）、銅綠假單胞菌（產(chǎn)品號：33034，批號：230223）、白色念珠菌（產(chǎn)品號：33045，批號：230302）、乙型副傷寒沙門菌（產(chǎn)品號：33307，批號：230209），以上5種菌株均購自北京三藥科技有限公司。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：2212202，北京三藥，TSB培養(yǎng)基，）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：221019，北京三藥，TSA培養(yǎng)基）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：220620，北京三藥，SDA培養(yǎng)基）；氯化鈉（NaCl，批號：20220514，國藥集團）；硫酸慶大霉素注射液（批號：20061001，山東魯抗醫(yī)藥集團）；氟康唑片（批號：21121541，揚子江藥業(yè)）；0.22 μm無菌PES膜（天津市領航）；空白藥敏紙片（規(guī)格：直徑6.0 mm，厚1.0 mm，山東百世微生物）；石油醚（30～60 ℃）（國藥集團）；無水乙醇（國藥集團）。

1.1.3 儀器設備

MLS-3751L-PC型高壓蒸汽滅菌器（日本三洋電子）；DKM410C型鼓風烘干箱（重慶雅馬拓）；HFsafe-1200型生物安全柜（上海力申）；UV2600i型紫外分光光度計（島津）；GNP-9270型隔水氏恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；DensiCHEK Plus型電子比濁儀（生物梅里埃）；YP3002型電子天平（余姚金諾）。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀耳多糖的提取

將購買的銀耳子實體分散后，置于50 ℃烘箱烘干至水分含量在5.0%以內(nèi)，粉碎過40目篩。以料液比1∶4（m/v）加入石油醚，充分振蕩2 h后真空抽濾。濾渣中加入料液比1∶2（m/v）無水乙醇，充分攪拌12 h。沉淀用無水乙醇洗滌2次后，45 ℃ 烘干得脫脂后的銀耳粉末，裝棕色廣口瓶-20 ℃ 儲存?zhèn)溆肹17]。將上述銀耳粉經(jīng)熱水浸提后取上清液定容至50 mL，稀釋至一定濃度后測定銀耳多糖的含量。

1.2.2 銀耳多糖含量的測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法進行測定[18]。在490 nm波長下讀取被測溶液的OD值。

1.2.3 銀耳多糖抑菌試驗

（1）菌懸液制備和使用。將白色念珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和乙型副傷寒沙門菌用0.5 mL已回溫的菌株復溶水溶解后，用接種環(huán)分別取2環(huán)，將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌和銅綠假單胞菌接種至TSA培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌接種至SDA培養(yǎng)基上，23 ℃培養(yǎng)3 d。上述菌株的新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌NaCl溶液制成菌懸液。用電子比濁儀檢測上述菌懸液和孢子懸液濁度值，按0.5濁度值代表1.5×108 cfu·mL-1濃度計算，用0.9%無菌NaCl溶液對懸液進行梯度稀釋至1.0×106 cfu·mL-1備用。上述懸液中菌株傳代次數(shù)為2代（按從公司購買的冷凍干燥菌種為第1代計算），使用時將菌懸液加入培養(yǎng)基中制成含菌量為1.0×104 cfu·mL-1的帶菌培養(yǎng)基。

（2）銀耳多糖溶液制備。將提取的銀耳多糖溶液，用無菌超純水稀釋為原液1/30濃度，經(jīng)過0.22 μm過濾器過濾除菌后得到A1濃度銀耳多糖溶液，再將A1濃度銀耳多糖溶液按3倍法梯度稀釋成A1的1/3、1/9、1/27、1/81濃度銀耳多糖溶液。

（3）抑菌圈試驗。在平皿中預先分別倒入約15 mL相應培養(yǎng)基，制成平板后，再加入5 mL相應帶菌培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基表面干后，呈三角形放入直徑為6 mm的圓形濾紙片，立即加入20 μL銀耳多糖溶液，每個濃度重復3次，靜置30 min后放入33 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)（接有白色念珠菌的SDA平板需要放在23 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)）18 h后，開始觀察抑菌效果，待觀察到培養(yǎng)基表面長滿菌落，按“十字交叉法”用游標卡尺測量抑菌圈直徑。無菌超純水作為空白對照。硫酸慶大霉素（40.00 μg·mL-1）對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和乙型副傷寒沙門菌具有較好的抑制效果，氟康唑（1.00 mg·mL-1）對白色念珠菌具有較好抑制效果，分別作為相應陽性對照。

2 結果與分析

2.1 銀耳多糖溶液濃度

以溶液OD值（y）為縱坐標，以葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線。線性回歸方程為y=0.066 169 4 x+0.006 083 03，r2=0.996 91，說明線性關系良好，說明該方法適合測定樣品中的多糖含量，詳見圖1。通過回歸方程測定1.2.3（2）中銀耳多糖溶液A1濃度，測得A1濃度為151.42 μg·mL-1。

2.2 銀耳多糖抑菌效果

觀察銀耳多糖對5種常見致病菌的抑菌效果，見表1。由表1可知，銀耳多糖對銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌有抑制作用，對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌無明顯抑制作用，其中1.87 μg·mL-1銀耳多糖溶液對銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌都能產(chǎn)生抑菌效果，16.82 μg·mL-1銀耳多糖溶液對乙型副傷寒沙門菌抑菌效果最好。

3 結論與討論

在試驗所研究的1.87～151.42 μg·mL-1的古田銀耳多糖溶液中，1.87 μg·mL-1銀耳多糖溶液對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌均有一定抑制作用，16.82 μg·mL-1銀耳多糖溶液對乙型副傷寒沙門菌的抑制效果最好，而這一范圍濃度的銀耳多糖溶液對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均無明顯抑制作用，對于銀耳多糖在抑菌活性的研究有一定參考價值，同時本試驗僅對5種常見致病菌開展研究，銀耳多糖對其他微生物的抑制作用有待研究。YIN等[19]研究發(fā)現(xiàn)植物多糖通過親水和疏水作用、靜電吸附或糖受體的存在與細菌相互作用。植物多糖的抗菌活性可以通過增加細胞膜的通透性、抑制病原菌對宿主細胞的吸附或阻斷營養(yǎng)物質(zhì)、能量物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運來發(fā)揮。本試驗發(fā)現(xiàn)相對較低的銀耳多糖（1.87 μg·mL-1）溶液反而可以產(chǎn)生一定的抑菌效果，可能與上述原因有關，值得探討。

參考文獻

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基金項目：福建省市場監(jiān)管局科技計劃項目（FJMS2022043）。

作者簡介：宋洋（1990—），男，福建南平人，碩士，工程師。研究方向：食品藥品檢驗。

通信作者：黃訓瑞（1972—），男，福建寧德人，本科，主任藥師。研究方向：食品藥品分析檢測。E-mail： 121607430@qq.com。