乳酸菌計數(shù)能力驗證的結(jié)果與分析

摘 要：為了展示實驗室具備乳酸菌計數(shù)的檢測能力，加強(qiáng)實驗室質(zhì)量控制，提高實驗室檢驗結(jié)果的可信度。本實驗室參加英國政府化學(xué)家實驗室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）組織的能力驗證。參照LGC方提供的檢測作業(yè)指導(dǎo)書和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016）對測試樣品進(jìn)行檢驗，最終報送結(jié)果為8.2×104 CFU·g-1，得出Z值為0.44，反饋為滿意。由此可知，實驗室具備對乳酸菌計數(shù)的檢測能力。

關(guān)鍵詞：能力驗證；乳酸菌；質(zhì)量控制

Results and Analysis of Lactic Acid Bacteria Count Ability Verification

LIU Qiuting， CHEN Peihong

（Guangdong Provincial Institute of Food Inspection， Guangzhou 510435， China）

Abstract： In order to show that the laboratory has the detection ability of lactic acid bacteria count， the quality control of the laboratory is strengthened to improve the credibility of the laboratory test results. The laboratory participated in the capability verification of laboratory of the government chemist （LGC）. The test samples were tested according to the test instructions provided by LGC and GB 4789.35—2016， and the final reported result was 8.2×104 CFU·g-1， with a Z value of 0.44， and the feedback was satisfactory. It can be seen that the laboratory has the ability to detect the lactic acid bacteria count.

Keywords： ability verification; lactic acid bacteria; quality control

乳酸菌屬是一類無芽孢，呈革蘭氏陽性，分為需氧型和厭氧型，主要發(fā)酵各種碳水化合物（主要為糖類），釋放能量并生成大量乳酸的微生物。它對酸類和膽鹽有較強(qiáng)的耐受性，但在高溫、高濃度的胃酸和一些消化酶等的作用下容易失活[1-2]，主要存在于發(fā)酵乳制品、動物體腸道、人體腸道、飼料，以及其他食品中。乳酸菌在微生物界中普遍存在，絕大部分寄居在動、植物體中[3-5]，它們對抗生素有一定的耐藥性[6]，能維持腸道微生物的平衡，改善腸胃功能，具備抗氧化、促進(jìn)和加強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)、防止食品腐敗的作用。此外，潘慧青等[7]、劉延英等[8]的研究中表明，該菌可以去除惡臭，可以促進(jìn)生產(chǎn)性能。在食品界中，乳酸菌主要被用于酸奶、醬腌菜、保健食品、嬰幼兒配方奶粉和輔食、啤酒等中，另外在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)界等領(lǐng)域乳酸菌都發(fā)揮重要作用，說明乳酸菌的存在與人類的生活息息相關(guān)。

為了提高實驗室的乳酸菌計數(shù)檢測能力和檢驗員的檢驗水平，實驗室參加了英國政府化學(xué)家實驗室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）實驗室舉辦的乳粉中乳酸菌計數(shù)能力驗證活動。

1 材料與方法

1.1 樣品

LGC實驗室提供的乳粉樣品，樣品編號為PT-MC-24D。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；均質(zhì)器（IUL）；顯微鏡（卡爾蔡司）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；厭氧罐（日本三菱化學(xué)）；質(zhì)譜儀（梅里埃公司）。

1.3 試劑

生理鹽水（北京陸橋）；MRS瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋）；莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基（北京陸橋）；MC培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱）；革蘭氏染色液（廣東環(huán)凱）。

1.4 方法

待測乳粉樣品的水化方法按照英國LGC實驗室提供的乳酸菌計數(shù)的作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行處理，后續(xù)檢驗流程和數(shù)據(jù)處理按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016）操作。

1.4.1 樣品處理

實驗前先對10 g樣品進(jìn)行水化處理，于4 ℃冰箱中取出樣品，使其恢復(fù)至室溫（約30 min），準(zhǔn)備

90 mL滅菌的0.85%生理鹽水。在紫外線照射過的超凈工作臺進(jìn)行實驗，先用酒精棉球擦拭樣品瓶口，開啟瓶蓋，用移液槍從90 mL的滅菌生理鹽水中吸取20 mL加入樣品瓶進(jìn)行水化溶解，待充分混勻后移到另一無菌瓶中，剩余的無菌生理鹽水按以上操作重復(fù)清洗樣品瓶，轉(zhuǎn)移到無菌瓶中，此時的待測液體相當(dāng)于10-1的乳粉樣品。

1.4.2 樣品稀釋

將樣液混勻后吸取25 mL到225 mL生理鹽水均質(zhì)袋中，拍打1～2 min，制成10-2稀釋液。吸取1 mL 10-2稀釋液到9 mL生理鹽水試管中，混勻制成10-3樣品稀釋液。按上述操作到10-5梯度為止，每個稀釋度吸取1 mL樣品液于平皿內(nèi)，每個梯度做3種菌屬，分別為乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌，每種菌屬做2個平行。

1.4.3 平板傾注和培養(yǎng)

將MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基按121 ℃，20 min高壓滅菌后冷卻到適宜溫度，將一半的MRS培養(yǎng)基加莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽配套試劑，制成改良MRS培養(yǎng)基，每個平皿傾注20～25 mL培養(yǎng)基使其覆蓋均勻。

觀察到平皿凝固后，將改良MRS平板，MRS平板倒置于厭氧罐，放置厭氧包36 ℃±1 ℃培養(yǎng)72 h±2 h，MC平板倒置于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h±2 h后計數(shù)。

1.4.4 鏡檢

挑取平板上的單菌落進(jìn)行鏡檢，乳桿菌為革蘭氏陽性，呈長桿狀、彎曲桿狀等，無芽孢。嗜熱鏈球菌菌體呈球狀，成對或成鏈排列，無芽孢，為革蘭氏染色陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 計數(shù)

實驗結(jié)果見表1、表2。檢驗員①和②在相同的實驗條件下對樣品進(jìn)行獨立實驗，改良MRS平板數(shù)為零，計數(shù)方法為選取10-3梯度MRS平板和MC平板上的菌落數(shù)。參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016）中6.3.1和6.4.1選取10-3稀釋度進(jìn)行計算。分別計算MRS平板、MC平板上的菌落數(shù)的平均值，乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，再將兩者的總數(shù)相加，作為每克乳粉中乳酸菌總數(shù)結(jié)果。按照《食品和動物飼料微生物學(xué) 30 ℃菌落計數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）[9]要求，兩者的絕對差值為0.13，小于復(fù)現(xiàn)性限R值0.45，說明實驗人員的檢測結(jié)果符合再現(xiàn)性要求。

2.2 結(jié)果評定

能力驗證評定方式采用CNAS—GL002：2018中4.5條款“Z比分?jǐn)?shù)”[10]進(jìn)行評價：|Z|≤2，表明結(jié)果滿意；2＜|Z|＜3，表明結(jié)果有問題；|Z|≥3，表明結(jié)果不滿意。依據(jù)組織方反饋的中位值4.76，標(biāo)準(zhǔn)差0.35，算出人員①和人員②的|Z|值分別為0.80和0.44，兩者結(jié)果都小于2，說明本實驗室檢驗人員具備在乳酸菌計數(shù)領(lǐng)域的檢測能力。

（1）

式中：χ為檢驗人員的檢測數(shù)值（對數(shù)值）；X為中位值；σ為標(biāo)準(zhǔn)差值。

3 結(jié)論與討論

乳酸菌主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌屬，PT-MC-24D樣品在改良MRS平板生長數(shù)為零，說明未添加雙歧桿菌屬，乳粉中的乳酸菌僅包括乳桿菌屬和嗜熱鏈球菌屬，即乳酸菌總數(shù)為MRS平板和MC平板總數(shù)之和，按照GB 4789.35—2016對乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行計數(shù)。由表1和2可知，人員①和人員②兩者對數(shù)的差值小于復(fù)現(xiàn)性限R值0.45，說明兩個實驗結(jié)果是在可接受范圍內(nèi)，結(jié)果有效，基于檢驗員②操作熟練，實驗過程無誤差，實驗數(shù)據(jù)平行性較好，綜合報送結(jié)果為8.2×

104 CFU·g-1。經(jīng)能力驗證提供者反饋，PT-MC-24D乳酸菌總數(shù)|Z|＜2，結(jié)果滿意。人員比對指在同一時段，由兩名檢驗人員采用相同的儀器設(shè)備和檢驗方法對同一測試樣品進(jìn)行實驗，通過實驗數(shù)據(jù)的差異分析“人、機(jī)、料、法、環(huán)”5個環(huán)節(jié)，從中識別產(chǎn)生不符合項問題的原因，并找到解決問題的方法。本次采取這種質(zhì)控方式是為了評價監(jiān)控在崗人員技術(shù)能力，增加結(jié)果的可靠性。

通過分析本次能力驗證檢測過程，總結(jié)了乳酸菌計數(shù)的幾個質(zhì)量控制點。①樣品管理。在接收樣品后應(yīng)檢查標(biāo)簽和包裝的完整性，按照說明書放置

-4 ℃冰箱中冷藏并及時進(jìn)行實驗，有問題及時反饋給能力驗證組織方。②樣品處理。定量計數(shù)的樣品在進(jìn)行水化時要恒溫到室溫方可進(jìn)行實驗，以免升溫過快造成菌體破裂[11]，導(dǎo)致結(jié)果偏低。樣品均質(zhì)時要在1～2 min完成，以免樣品溶解不徹底影響計數(shù)結(jié)果。③稀釋過程。此過程檢驗員應(yīng)獨立進(jìn)行無菌操作，嚴(yán)格按照比例進(jìn)行樣液稀釋，自行分裝

9 mL和225 mL無菌稀釋液，減少因高壓滅菌后稀釋液體積減少帶來的誤差。④培養(yǎng)基配制。實驗所用的試劑和培養(yǎng)基應(yīng)按照GB 4789.28—2013標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行驗收。培養(yǎng)基配制應(yīng)按試劑供應(yīng)商的配制要求，稱量加水溶解干粉后應(yīng)在電熱板上進(jìn)行加熱，充分溶解后高壓滅菌，保證溶液體系均勻性和傾注平板后菌落生長良好，增加計數(shù)的穩(wěn)定性。⑤操作時間。由于微生物增長速度過快，還易受其他環(huán)節(jié)交叉污染，因此稀釋樣液到平板傾注過程應(yīng)在15 min內(nèi)完成。⑥培養(yǎng)條件。乳桿菌和雙歧桿菌都是厭氧的革蘭氏陽性菌，須在無氧環(huán)境下生存，所以要改良MRS平板。MRS平板倒置培養(yǎng)時應(yīng)在厭氧罐放置厭氧包并密封，如培養(yǎng)過程密封性不好則需及時更換厭氧包繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。

按照《能力驗證規(guī)則》（CNAS—RL02：2023）[12]4.1總則要求，參加能力驗證是檢驗機(jī)構(gòu)的責(zé)任和義務(wù)，需考慮實驗室在某些項目取得資質(zhì)要求，按內(nèi)外部質(zhì)控計劃安排參加能力驗證，評估實驗室能力。只有持續(xù)性參加外部實驗室能力驗證活動才能識別實驗室存在的風(fēng)險問題，確認(rèn)與其他檢驗檢測實驗室的差距，提升實驗室檢驗員的能力，從而使實驗室整體檢驗水平不斷提高。

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作者簡介：劉秋婷（1995—），女，廣東潮州人，本科，助理工程師。研究方向：食品微生物檢驗。