熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測腦脊液中結(jié)核分枝桿菌DNA對鑒別診斷結(jié)核性腦膜炎的應(yīng)用價(jià)值分析

周冬梅 王洲

【摘要】 目的 探究熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測腦脊液中結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）DNA對鑒別診斷結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）的應(yīng)用價(jià)值。方法 選擇2019年7月—2021年6月于安陸市普愛醫(yī)院就診的存在腦膜刺激征的80例患者作為研究對象，所有患者均經(jīng)MTB培養(yǎng)后明確診斷，將確診為TBM的37例患者分入腦膜炎組，疑似TBM的18例患者分入疑似組，非TBM的25例患者分入非TBM組，對3組患者行腰椎穿刺，留取5 mL腦脊液及時(shí)送檢，分別行MTB培養(yǎng)法、抗酸染色涂片法、熒光定量PCR檢測。對比3種檢測方法在MTB中的陽性檢出率，對比腦膜炎組與疑似組患者M(jìn)TB的DNA檢測數(shù)值。結(jié)果 腦膜炎組應(yīng)用熒光定量PCR檢測MTB的陽性檢出率高于疑似組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腦膜炎組與疑似組采用MTB培養(yǎng)法、抗酸染色涂片法的MTB陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦膜炎組患者M(jìn)TB的DNA檢測數(shù)值為（4.71±0.97），疑似組患者M(jìn)TB的DNA檢測數(shù)值為（4.35±0.83），2組患者M(jìn)TB的DNA檢測值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.351，P=0.183）。結(jié)論 應(yīng)用熒光定量PCR檢測腦脊液中MTB的DNA，有助于判斷TBM患者病情嚴(yán)重程度，在鑒別診斷TBM中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，為臨床診療提供新思路及方向，值得臨床推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)核性腦膜炎；腦脊液；結(jié)核分枝桿菌；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

文章編號：1672-1721（2024）04-0127-03? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?中國圖書分類號：R446.5

結(jié)核性腦膜炎（TBM）是結(jié)核分枝桿菌（MTB）經(jīng)血行或其他途徑播散至蛛網(wǎng)膜下腔，對腦膜及脊髓膜造成侵犯的非化膿性炎癥疾病。該病發(fā)生率約占全身結(jié)核疾病的6%，病死率及致殘率均較高[1-2]。MTB為兼性細(xì)胞內(nèi)致病菌，可引發(fā)進(jìn)行性疾病或無癥狀的潛伏感染。初染MTB的3～6個月，TBM發(fā)病率較高，極易被臨床誤診為化膿性腦膜炎、病毒性腦炎、腦腫瘤等其他腦部疾病[3]。早期準(zhǔn)確且快速的診斷對改善TBM患者病情及預(yù)后具有重要作用。腦脊液檢查是臨床診斷MTB DNA的“金標(biāo)準(zhǔn)”。近年來熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在臨床上應(yīng)用，具有檢測速度快、診斷準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，可為腦脊液中MTB DNA的鑒別診斷提供可靠的參考依據(jù)[4]。鑒于此，本研究采用熒光定量PCR檢測腦脊液中MTB的DNA，旨在探究PCR在鑒別診斷TBM的臨床應(yīng)用價(jià)值，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年7月—2021年6月于安陸市普愛醫(yī)院就診的80例存在腦膜刺激征的患者作為研究對象，男性47例，女性33例；年齡11～68歲，平均（40.09±2.16）歲。所有患者均經(jīng)MTB培養(yǎng)后明確診斷，將確診為TBM的37例患者分入腦膜炎組，疑似TBM的18例患者分入疑似組，非TBM的25例患者分入非TBM組（包括9例化膿性腦膜炎、10例病毒性腦膜炎、6例腦部腫瘤）。腦膜炎組男性20例，女性17例；年齡15～65歲，平均（39.94±2.86）歲。疑似組男性8例，女性10例；年齡16～68歲，平均（40.08±2.07）歲。非TBM組男性19例，女性6例；年齡11～66歲，平均（40.11±2.10）歲。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：TBM患者均經(jīng)影像學(xué)檢查顯示大腦外側(cè)裂或基底池中存在滲出物，伴有腦積水或腦回增強(qiáng)，

在腦膜炎病變基礎(chǔ)上于腦脊液中可檢測到MTB；行腦脊液檢測可見蛋白定量升高明顯，氯化物、葡萄糖水平較低，皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)呈陽性，給予抗結(jié)核治療有效。疑似患者發(fā)病時(shí)間超過5 d，伴有明顯的神志改變，行腦脊液檢查可見葡萄糖與腦脊液比值超過0.5，且以淋巴細(xì)胞為主；行顱腦磁共振成像（magnetic resonance?imaging，MRI）及CT掃描可見結(jié)果異常，眼底檢查異常，伴有其他部位結(jié)核。非TBM患者均已明確診斷為化膿性或病毒性腦膜炎及腦部腫瘤。患者及家屬均知曉，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤；其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病；凝血及造血功能異常；其他感染或傳染性疾??；意識障礙，無法配合完成本次研究。

1.3 方法

對3組患者行腰椎穿刺，留取5 mL腦脊液及時(shí)送檢，分別行MTB培養(yǎng)法、抗酸染色涂片法、熒光定量PCR檢測。（1）MTB培養(yǎng)法。采用液體培養(yǎng)方式，使細(xì)菌與營養(yǎng)物質(zhì)充分融合接觸，促進(jìn)MTB快速增長，將MTB培養(yǎng)陽性結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。（2）抗酸染色涂片法。留取腦脊液2 mL，對腦脊液行離心處理，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心時(shí)間15 min，留取沉渣行抗酸染色鏡檢。（3）熒光定量PCR檢測。采用ABI-PCR擴(kuò)增儀（賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行檢測，所有操作均嚴(yán)格遵循試劑盒要求進(jìn)行。檢測時(shí)留取500 L腦脊液，對腦脊液行濃縮后取200 L濃縮液，充分震蕩混合均勻后行離心處理（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心時(shí)間3 min），離心完畢后去除上層清液，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉注射液，重懸沉淀，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速再次行離心處理，離心時(shí)間3 min，去除上層清液后沉淀備用。吸取50 L核酸釋放劑，震蕩混勻后于室溫環(huán)境下放置3～5 min，分別吸取36 L PCR反應(yīng)液、2 L酶結(jié)合物、1 L內(nèi)標(biāo)液制備成5 L樣本液。于94 ℃環(huán)境中行預(yù)變性5 min，隨后于94 ℃環(huán)境中持續(xù)15 s，57 ℃環(huán)境中持續(xù)30 s，由此往復(fù)行40個循環(huán)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CT值≤39，曲線表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)S形，則檢測結(jié)果判定為陽性；CT值＞39，內(nèi)標(biāo)檢測呈陽性，則檢測結(jié)果判定為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）對比3種檢測方法在MTB中的陽性檢出率。

（2）對比腦膜炎組與疑似組患者M(jìn)TB的DNA檢測數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對本次研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以x±s表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種檢測方法在MTB中的陽性檢出率

腦膜炎組應(yīng)用熒光定量PCR檢測在MTB中的陽性檢出率高于疑似組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腦膜炎組與疑似組采用MTB培養(yǎng)法、抗酸染色涂片法在MTB陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 2組患者M(jìn)TB DNA檢測值對比

腦膜炎組患者M(jìn)TB DNA檢測數(shù)值為（4.71±0.97），疑似組患者M(jìn)TB DNA檢測數(shù)值為（4.35±0.83）。2組患者M(jìn)TB DNA檢測值對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.351，P=0.183）。

3 討論

TBM是MTB引發(fā)的以腦膜為主的非化膿性炎癥性疾病，該病以腦實(shí)質(zhì)及腦血管受累為主。大量數(shù)據(jù)顯示[5-6]，TBM發(fā)病率約占所有活動性結(jié)核的1%，是臨床上常見的肺外結(jié)核性疾病。TBM病情表現(xiàn)較為復(fù)雜，行腦脊液檢查缺乏典型性，行病原學(xué)檢查及生化檢查缺乏靈敏度及特異度，極易影響臨床診斷及治療[7-8]。選擇一種特異性及靈敏度均較高的方法在TBM診斷中具有積極作用。

依據(jù)TBM的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核性的細(xì)菌學(xué)檢查是診斷TBM的主要依據(jù)。既往臨床對于結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要采用MTB培養(yǎng)法與抗酸染色涂片法。MTB培養(yǎng)法具有診斷準(zhǔn)確度高、結(jié)果可靠、特異性高等特點(diǎn)，但所耗費(fèi)的時(shí)間較長，檢測通常需要4～8周才出結(jié)果，培養(yǎng)過程中僅可培養(yǎng)出活菌，嚴(yán)重影響TBM的診斷及治療[9]。抗酸染色涂片法具有操作簡單、檢測速度快、檢測費(fèi)用低等優(yōu)勢，但該方法檢測靈敏度及特異度均較差，在臨床應(yīng)用中存在局限性[10]。近年來，熒光定量PCR法因?yàn)樵谂R床應(yīng)用上具有特異性及敏感性高、檢測快速等特點(diǎn)，在病原體檢測的多個領(lǐng)域得到應(yīng)用[11]，但熒光定量PCR法對技術(shù)要求較高，檢測費(fèi)用較高，推廣應(yīng)用難度較高。本研究結(jié)果顯示，腦膜炎組應(yīng)用熒光定量PCR檢測在MTB中的陽性檢出率高于疑似組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腦膜炎組與疑似組采用MTB培養(yǎng)法、抗酸染色涂片法在MTB陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腦膜炎組患者M(jìn)TB DNA檢測數(shù)值為（4.71±0.97），疑似組患者M(jìn)TB DNA檢測數(shù)值為（4.35±0.83），2組患者M(jìn)TB DNA檢測值對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.351，P=0.183）。表明相比于MTB培養(yǎng)法及抗酸染色涂片法，熒光定量PCR法在腦脊液MTB DNA檢測中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，陽性檢測率較高，可為臨床診療提供可靠的參考依據(jù)。

分析腦脊液MTB DNA檢測陰性出現(xiàn)的結(jié)果：（1）患者已接受抗結(jié)核治療，或部分患者經(jīng)由下級醫(yī)院轉(zhuǎn)入，經(jīng)不規(guī)范治療后影響陽性檢出率的判斷；（2）腦脊液中的MTB DNA拷貝數(shù)較低，由于TBM疾病早期MTB DNA拷貝數(shù)較低，未達(dá)到檢測試劑的下限，使得陽性檢出率較低，出現(xiàn)陰性結(jié)果[12]。

綜上所述，熒光定量PCR檢測腦脊液中MTB DNA在鑒別診斷TBM中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。該方法無法替代傳統(tǒng)檢測法作為診斷TBM的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法具有技術(shù)成熟等特點(diǎn)，對TBM診斷靈敏度及特異度均較高，可為TBM早期診斷提供更加可靠的參考，值得臨床推廣應(yīng)用。

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（編輯：肖宇琦）

作者簡介：周冬梅，女，本科，主管技師。