噬菌體藥物開發(fā)及質(zhì)控研究進(jìn)展

楊蓉，趙晨，李端華，饒峻，王輅

(成都大學(xué)藥學(xué)院，成都 610106)

自1915年Frederick Twort發(fā)現(xiàn)噬菌體[1]，1917年D'Herelle發(fā)現(xiàn)并命名其為“Bacteriophage”[2]以來(lái)，噬菌體就被研究用于治療各種細(xì)菌引起的感染性疾病。特別是1923年后，歐洲的格魯吉亞Eliava噬菌體、微生物學(xué)和病毒學(xué)研究所和弗羅茨瓦夫(波蘭)的Hirszfeld研究所通過(guò)噬菌體成功治療了許多病原菌引起的感染。盡管20世紀(jì)中葉由于抗生素的發(fā)現(xiàn)并大量運(yùn)用使得噬菌體治療的發(fā)展受阻，但科學(xué)家對(duì)噬菌體治療的研究從未停止。也正是由于抗生素的大規(guī)模生產(chǎn)及使用，催生出了大量耐藥性細(xì)菌，并最終導(dǎo)致多重耐藥菌甚至超級(jí)耐藥菌ESKAPE(屎腸球菌，金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，銅綠假單胞菌和腸桿菌屬)的出現(xiàn)[3]。這時(shí)，噬菌體又重新引起了科學(xué)家們的興趣。

然而，D'Herelle時(shí)期制定的相關(guān)噬菌體治療法規(guī)由于受到現(xiàn)代藥物立法的阻礙已經(jīng)不再適用，這也影響了噬菌體臨床試驗(yàn)的開展及相關(guān)專利的申請(qǐng)。盡管目前尚無(wú)完善的噬菌體相關(guān)法規(guī)頒布，但在西方國(guó)家針對(duì)患者的個(gè)性化噬菌體治療已被用于同情用藥[4-6][按照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的定義，同情用藥指對(duì)于患有嚴(yán)重或危及生命疾病的患者，在不能通過(guò)現(xiàn)有藥品或入選臨床試驗(yàn)來(lái)得到有效治療時(shí)，可以申請(qǐng)?jiān)谂R床試驗(yàn)之外使用末經(jīng)上市許可的試驗(yàn)用藥物]，在美國(guó)和歐洲一些國(guó)家已經(jīng)有噬菌體治療的相關(guān)專利被授權(quán)[7-9]，并且可在歐洲某些國(guó)家的授權(quán)藥店購(gòu)買到人用噬菌體藥物，這些現(xiàn)象都展現(xiàn)了噬菌體具有良好的應(yīng)用前景。

在我國(guó)，藥物制劑需按《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(Good manufacturing practice, GMP)進(jìn)行制備，但目前我國(guó)尚無(wú)完善的噬菌體藥物監(jiān)管法規(guī)，多數(shù)噬菌體治療還僅限于動(dòng)物治療。噬菌體具有生物制品的相關(guān)特征，因此在制備噬菌體用于研究時(shí)可參考我國(guó)有關(guān)生物制品制定的標(biāo)準(zhǔn)?；谝陨厦枋?，本文嘗試結(jié)合我國(guó)現(xiàn)行藥典關(guān)于生物制品生產(chǎn)、制備及質(zhì)量控制要求和歐洲藥品管理局(European medicines agency,EMA)近年來(lái)對(duì)噬菌體治療藥物批準(zhǔn)途徑(包括對(duì)細(xì)胞庫(kù)、噬菌體庫(kù)的質(zhì)量控制和噬菌體藥品的管制)的探索為參照，著重對(duì)噬菌體庫(kù)構(gòu)建與控制、噬菌體制備與質(zhì)控和臨床前測(cè)試等進(jìn)行綜述分析。

1 噬菌體庫(kù)

噬菌體庫(kù)構(gòu)建是噬菌體治療研究的基礎(chǔ)工作。首先創(chuàng)建噬菌體文庫(kù)和高濃度儲(chǔ)存的噬菌體制劑庫(kù)，以保證能快速實(shí)現(xiàn)噬菌體藥物遞送。前者主要包含相關(guān)噬菌體的基本信息，如基因組信息、分類、生命周期和裂解性能等；后者是以穩(wěn)定制劑形式存放的高濃度噬菌體藥物。

1.1 噬菌體庫(kù)制備

通常，在噬菌體庫(kù)構(gòu)建時(shí)，噬菌體擴(kuò)增所用的宿主菌選擇、培養(yǎng)基組成以及合適的培養(yǎng)條件對(duì)制備和獲得用于治療的高濃度噬菌體至關(guān)重要。在生產(chǎn)制備噬菌體的過(guò)程中應(yīng)盡最大可能降低污染和噬菌體降解，并在基因?qū)用嫔蠙z查噬菌體，以確定噬菌體基因組中是否具有編碼抗生素抗性、溶原性(如整合酶、轉(zhuǎn)座酶)、毒性和毒性決定因子的基因。此外，適當(dāng)?shù)氖删w/細(xì)菌比例[多重感染復(fù)數(shù)(Multiple infection complex，MOI)]、噬菌體爆發(fā)量和吸附效率對(duì)噬菌體生產(chǎn)也起著關(guān)鍵作用。對(duì)于治療用途的噬菌體，應(yīng)優(yōu)選吸附率高、爆發(fā)量大和潛伏期短的噬菌體，這樣有利于縮短噬菌體制備周期并快速達(dá)到治療目的。最關(guān)鍵的是，用于治療的噬菌體應(yīng)選擇毒性噬菌體(也稱裂解性噬菌體)，而非溫和噬菌體[10]。因?yàn)槟承睾褪删w編碼的基因能將它們所感染的細(xì)菌轉(zhuǎn)化為致病性更強(qiáng)的菌株[11]；其次，溫和噬菌體的存在能在相同或相關(guān)噬菌體(具有相同的免疫類型)重復(fù)感染時(shí)使細(xì)菌產(chǎn)生免疫現(xiàn)象；另外，溫和噬菌體還能參與細(xì)菌間的轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]，使細(xì)菌DNA從一個(gè)宿主轉(zhuǎn)移至另一個(gè)宿主，這將可能增加細(xì)菌的致病性。

1.2 文庫(kù)質(zhì)量控制

噬菌體文庫(kù)構(gòu)建時(shí)的質(zhì)量控制對(duì)治療的有效性、安全性及可追溯性具有重要作用。應(yīng)對(duì)包括噬菌體形態(tài)、基因組特征信息及活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

1940年Ruska首次使用電子顯微鏡(Electron microscope，EM)觀察到噬菌體[12]，自此開啟了對(duì)噬菌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類的研究[13-14]。根據(jù)尾部形態(tài)，科學(xué)家們將噬菌體分為三個(gè)科：具有短而不收縮的尾巴(Podoviridae)、具有長(zhǎng)而不收縮的尾巴(Siphoviridae)和具有長(zhǎng)而可收縮尾巴(Myoviridae)[15]。

如今隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International committee on taxonomy of viruses，ICTV)對(duì)各噬菌體家族進(jìn)行了匯編(http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)，使得噬菌體分類得到了擴(kuò)展，主要包括根據(jù)宿主范圍、結(jié)構(gòu)、衣殼大小和形狀、基因組類型(單鏈/雙鏈DNA或RNA)、基因組大小和對(duì)有機(jī)溶劑的耐受能力等進(jìn)行分類。

1.2.2 基因組特征分析

Hershey等[16]在1952年對(duì)大腸埃希菌噬菌體T2的研究結(jié)果證明了噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA，而非蛋白質(zhì)，并經(jīng)研究表明噬菌體的遺傳物質(zhì)可以是任何一種核酸類型。隨后，基因組測(cè)序和限制性內(nèi)切酶消化作為噬菌體分類和治療過(guò)程中的分子工具一直被沿用。隨著基因測(cè)序所需成本降低，該項(xiàng)技術(shù)逐漸成為新噬菌體鑒別的重要依據(jù)。基因測(cè)序技術(shù)在噬菌體上的應(yīng)用將噬菌體基于形態(tài)學(xué)分類轉(zhuǎn)變至基于基因和蛋白質(zhì)之間的關(guān)系這種更精確的方式進(jìn)行分類，為新噬菌體的發(fā)現(xiàn)提供了可靠的依據(jù)。

基因測(cè)序在研究菌株對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性方面也提供了很大幫助。如Ishino等[17]和Jansen等[18]在細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas基因，并證明了這是一種噬菌體抗性機(jī)制。此外，噬菌體在感染細(xì)菌時(shí)具有導(dǎo)致有害或有毒基因在細(xì)菌群體中傳播的風(fēng)險(xiǎn)[19]，因此在噬菌體用于治療前應(yīng)先通過(guò)基因測(cè)序檢測(cè)其轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

盡管近年來(lái)由于基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得噬菌體相關(guān)的研究得到許多突破，但關(guān)于噬菌體如何識(shí)別宿主、如何將有害基因轉(zhuǎn)至宿主細(xì)菌以及如何應(yīng)對(duì)宿主細(xì)菌產(chǎn)生抗性等問(wèn)題仍需進(jìn)行深入探索。

1.2.3 活性檢測(cè)

為保證噬菌體文庫(kù)治療的有效性，活性測(cè)定是必不可少的，包括宿主范圍和生長(zhǎng)周期等[20]。

噬菌體的宿主范圍是其能感染宿主菌的分類多樣性，與宿主表面受體結(jié)構(gòu)相關(guān)，由于細(xì)菌間表面受體的差異使得噬菌體具有特異性感染宿主菌的特征，這也是噬菌體宿主范圍窄的一個(gè)重要原因[21-22]。目前，在作為治療手段時(shí)，通常將具有不同窄宿主范圍的噬菌體進(jìn)行混合，以擴(kuò)展其應(yīng)用范圍并提高治療效果[23]。

雖然噬菌體宿主范圍窄，但隨著技術(shù)的發(fā)展，已有研究表明可通過(guò)對(duì)噬菌體進(jìn)行基因?qū)用娴母脑靵?lái)擴(kuò)展其宿主范圍[22]，這為噬菌體的應(yīng)用提供了重要參考。

而對(duì)于其生長(zhǎng)周期的測(cè)定，一步生長(zhǎng)曲線[The one-step growth (OSG) curve]可使噬菌體的生長(zhǎng)以數(shù)據(jù)的形式可視化。噬菌體的OSG曲線最早由Ellis[24]于1939年提出，作為新分離噬菌體活性測(cè)定的一部分，用于表征噬菌體的生長(zhǎng)周期。噬菌體的生長(zhǎng)周期主要包含7個(gè)步驟：(1)噬菌體與敏感菌碰撞；(2)噬菌體附著；(3)噬菌體核酸攝入；(4)噬菌體蛋白和核酸合成；(5)噬菌體成熟；(6)子代噬菌體釋放期；(7)子代噬菌體在細(xì)胞外搜尋細(xì)菌進(jìn)行吸附(擴(kuò)散期)。

2 噬菌體制備與質(zhì)量控制

2.1 噬菌體培養(yǎng)

目前已有專門的機(jī)構(gòu)為臨床或研究提供大規(guī)模且高純度的噬菌體，如噬菌體技術(shù)中心(Center for phage technology, CPT)和第比利斯的Eliava研究所[25]。噬菌體擴(kuò)增所用宿主菌通常是實(shí)驗(yàn)室使用的菌株，但這將導(dǎo)致噬菌體應(yīng)用范圍受到限制，因此在實(shí)際用于治療時(shí)，可通過(guò)使用更多宿主菌(包括一些臨床菌株)來(lái)生產(chǎn)制備高濃度噬菌體，并且在生產(chǎn)過(guò)程充分探索合適的生產(chǎn)條件，如培養(yǎng)溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基組成、MOI和宿主菌引入密度等，這樣才可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)噬菌體制劑的目的。

2.2 噬菌體純化精制

噬菌體作為一種病毒，只能在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)繁殖。因此，制備治療用噬菌體的一個(gè)主要障礙是將噬菌體從細(xì)菌粗裂解物(內(nèi)毒素、肽聚糖、外毒素、鞭毛、核酸等)中分離出來(lái)，如果不充分除去這些雜質(zhì)，將在人體中引發(fā)炎癥、敗血癥和感染性休克等嚴(yán)重后果[26-28]。

從粗培養(yǎng)物中獲取高純度噬菌體的傳統(tǒng)方法包括離心、過(guò)濾、超濾、聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)沉淀，CsCl梯度超速離心和透析[29]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，科學(xué)家們將陰離子交換色譜(Anion exchange chromatography)[30]、體積排除色譜(Size exclusion chromatography，SEC)[31]、脫鹽柱(Desalting spin column)[32]、甲基丙烯酸酯整體柱(Methacrylate monolith column)[32]等方法用于噬菌體的純化，并得到了不錯(cuò)的純化結(jié)果。

然而，單一的純化方法并不能立即得到高濃度純噬菌體，因此需根據(jù)不同純化方法的特點(diǎn)進(jìn)行組合使用。通常將噬菌體從粗裂解物中純化噬菌體的第一步是運(yùn)用離心、過(guò)濾去除較大雜質(zhì)(如細(xì)胞碎片)，再通過(guò)透析、超濾等方法對(duì)體系進(jìn)行濃縮。若宿主菌為革蘭陰性菌時(shí)，還應(yīng)考慮去除內(nèi)毒素或脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的步驟[29]。

2.3 噬菌體質(zhì)量控制

噬菌體制劑的質(zhì)量控制在參考我國(guó)現(xiàn)行藥典關(guān)于生物制品生產(chǎn)、制備及質(zhì)量控制要求和EMA近年來(lái)對(duì)噬菌體治療藥物批準(zhǔn)途徑的探索的基礎(chǔ)上，還應(yīng)考慮到噬菌體的保存穩(wěn)定性及吸附效率。

2.3.1 穩(wěn)定性

維持噬菌體制劑的穩(wěn)定性對(duì)于實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期有效的噬菌體給藥至關(guān)重要。許多科學(xué)家將穩(wěn)定性研究(例如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、溶劑等)作為噬菌體的基礎(chǔ)研究，這些條件對(duì)噬菌體的濃度及感染活性等的影響和對(duì)生產(chǎn)及保存符合治療目的噬菌體制劑具有重要意義[33]。

噬菌體的穩(wěn)定性通常使用雙層平板測(cè)定噬菌體濃度來(lái)表征[34]。但該法耗時(shí)且費(fèi)力，如果濃度變化能用更簡(jiǎn)單方便，且快速的方法進(jìn)行檢測(cè)，那將節(jié)約很多時(shí)間，為此，許多簡(jiǎn)化的實(shí)驗(yàn)方法如單層瓊脂平板測(cè)定噬菌斑等被開發(fā)并應(yīng)用于濃度測(cè)定。

2.3.2 吸附效率

Bertozzi等[35]認(rèn)為測(cè)定噬菌體對(duì)宿主細(xì)胞的吸附效率對(duì)應(yīng)用(主要為治療用途)噬菌體時(shí)的有效性具有重要意義。作為治療用途的噬菌體必須具有高吸附效率才能在施用時(shí)快速裂解病原菌達(dá)到治療效果。因此，在表征新噬菌體時(shí)應(yīng)及早驗(yàn)證吸附效率以節(jié)省更多的時(shí)間和資源。而吸附效率通常又與宿主菌大小、噬菌體顆粒有效半徑、噬菌體擴(kuò)散速率和噬菌體與宿主菌碰撞條件下附著的概率等有關(guān)。

3 臨床前研究

目前，已建立了幾種最常見并且與人類細(xì)菌感染相關(guān)的動(dòng)物模型，這些動(dòng)物模型被用于測(cè)試新分離噬菌體及其在體內(nèi)對(duì)抗病原菌的效力[36]。

3.1 動(dòng)物模型

用于噬菌體治療研究的動(dòng)物模型包括無(wú)脊椎動(dòng)物或低等脊椎動(dòng)物模型：線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、蠟蛾(Galleriamellonella)和斑馬魚(Daniorerio)；和高等脊椎動(dòng)物：雞(GallusGallus)、兔(Oryctolagus Cuniculas)、倉(cāng)鼠(Mesocricetusauratus)和小鼠(musculus)模型[37](圖1)。

圖1 用于細(xì)菌感染和噬菌體治療應(yīng)用的動(dòng)物模型[46]

這些動(dòng)物模型主要用于研究感染銅綠假單胞菌[38-42]、沙門菌[43]、金黃色葡萄球菌[43-44]、洋蔥伯克菌[45]、糞腸球菌[40-41]、艱難梭菌[46]、大腸埃希菌[47]和彎曲桿菌[48-49]等細(xì)菌后噬菌體治療的安全性及有效性，為噬菌體治療的有效性、不良反應(yīng)的發(fā)生和與宿主相互作用等提供支撐。

3.2 給藥途徑

只有當(dāng)足夠且合適數(shù)量的噬菌體到達(dá)感染部位并殺死病原菌時(shí)，噬菌體治療才算是成功的[50]。在運(yùn)用噬菌體進(jìn)行治療時(shí)，通常還與抗生素聯(lián)合使用[51]，這樣能減少抗生素的施用時(shí)間和劑量，緩解抗生素耐藥菌的發(fā)展和藥物對(duì)宿主的不良影響(包括破壞微生物群的平衡)。根據(jù)感染部位和類型，噬菌體治療包括：局部、靜脈和口服給藥途徑進(jìn)行。

局部治療主要涉及：潰瘍、外科傷口或燒傷相關(guān)的細(xì)菌感染[52]。已有相關(guān)報(bào)道稱噬菌體治療能有效緩解糖尿病足部潰瘍[53-54]，這種治療方式有效地解決了患者免疫功能受損而不能長(zhǎng)期施用抗生素的難題。另外，吸入噬菌體溶液已被證明可在人類[55]和小鼠模型中有效對(duì)抗多藥耐藥的細(xì)菌性肺部感染[56]。

靜脈注射是治療菌血癥的理想途徑。Speck等[57]的研究表明噬菌體治療是安全有效的，但當(dāng)噬菌體宿主為革蘭陰性菌時(shí)應(yīng)關(guān)注宿主菌可能釋放內(nèi)毒素導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)。此外，在通過(guò)靜脈注射噬菌體時(shí)，其可能在血液中被免疫細(xì)胞清除，Dabrowska[58]的研究證明了這一點(diǎn)。

而口服途徑涉及胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)，這一過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致噬菌體失活，但已有相關(guān)研究[38,59]結(jié)果證明噬菌體可與食物一起服用并經(jīng)胃腸道后仍有活性。

為了解決以上可能存在的問(wèn)題，研究人員通過(guò)改變噬菌體給藥劑型來(lái)實(shí)現(xiàn)噬菌體到達(dá)感染部位并有效裂解病原菌。包括使用脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)現(xiàn)噬菌體遞送[60-62]增強(qiáng)噬菌體活性。

4 展望

越來(lái)越多的研究表明噬菌體具有應(yīng)用于人類感染治療的潛力，盡管目前為止沒(méi)有統(tǒng)一的噬菌體制劑監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，但在臨床試驗(yàn)和同情治療研究中，它們的使用越來(lái)越多。另外，如本文所述，在將噬菌體治療應(yīng)用于人類臨床之前，應(yīng)保證噬菌體制劑制備的濃度和純度，充分了解噬菌體文庫(kù)中每一株噬菌體的生物學(xué)特征，并獲得足夠多的動(dòng)物模型研究數(shù)據(jù)以充分了解噬菌體治療的有效性、安全性及不良反應(yīng)，為噬菌體應(yīng)用于人類病菌感染治療提供更多的參考依據(jù)。

另外，值得注意的是，同為天然生物實(shí)體的益生菌早在2002年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization, FAO/WHO)就頒布了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)用于監(jiān)管生產(chǎn)，那么在研究噬菌體制備時(shí)或許也可以適當(dāng)參考益生菌的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，這樣就能往更符合藥物制劑生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的方向靠近。

考慮到目前抗生素耐藥形勢(shì)的嚴(yán)峻性，噬菌體作為潛在的替代療法應(yīng)得到更多重視。在研究噬菌體治療時(shí)，可靠的噬菌體文庫(kù)是必不可少的，因此，此文庫(kù)所涉及的文庫(kù)構(gòu)建、噬菌體藥物制備、安全性及有效性評(píng)價(jià)都應(yīng)被充分考慮到。更完善且更系統(tǒng)地研究噬菌體制備過(guò)程涉及的各個(gè)方面、制備時(shí)與宿主菌的相互作用機(jī)制、施用時(shí)與病原菌的相互作用機(jī)制及對(duì)人體的影響(包括對(duì)原駐微生物組的影響及相互作用的機(jī)制)等對(duì)噬菌體的應(yīng)用極其重要。因?yàn)橹挥芯哂腥嬗行У难芯繑?shù)據(jù)才能為噬菌體治療的廣泛應(yīng)用提供可能。