耐鉻厭氧膠原蛋白水解菌的篩選及應(yīng)用研究

丁紹蘭，劉云，李重遙

（陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

引言

中國 的制革產(chǎn)業(yè)每年要產(chǎn)生超過 100萬噸鉻革屑[1]，雖然膠原蛋白的含量非常高，但其中含有重金屬鉻，而被列為危險固體廢物。目前常用的填埋、焚燒以及化學(xué)處理方法，處理過程復(fù)雜 、反應(yīng)條件苛刻、還容易造成大量的膠原蛋白可用資源的浪費以及氧化成六價鉻的二次污染。所以生物法處理鉻革屑的研究應(yīng)運而生，現(xiàn)有的研究主要是通過酶法和耐鉻微生物水解鉻革屑。

因此，本論文從制革廠含鉻污泥中篩選、分離、培養(yǎng)、純化得到耐鉻優(yōu)勢厭氧菌，然后將其用于消解鉻革屑脫鉻后的含鉻膠原蛋白液，探討消解效果和產(chǎn)氣性能，開發(fā)生物法消解含鉻膠原廢棄物的新技術(shù)。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 含鉻污泥及鉻革屑的來源

含鉻污泥取自福建晉江秋夏皮革有限公司初沉池，置于冰箱備用。鉻革屑取自福建晉江秋夏皮革有限公司。

1.1.2 儲備液的配置

三價鉻儲備液的配置：稱取 25.52 g 的堿式硫酸鉻[Cr(OH)SO4]，溶于水，用濃度為 1 mol/L 的 H2SO4調(diào)節(jié) pH 約為 1，轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶，定容，得4000 mg/L 的三價鉻的儲備液，4 ℃保存，稀釋一定倍數(shù)后使用。

1.1.3 含鉻膠原蛋白液的制備

稱取 100 g 鉻革屑溶于 2000 mL 水中，加入 20 g 氧化鈣，于 90 ℃、200 r/min 條件下攪拌 3 h 后用濃度為 1 mol/L 的 H2SO4調(diào)節(jié) pH 約為 7，加入 20 g中性蛋白酶（天津市福晨化學(xué)試劑廠），于 40 ℃、200 r/min 下攪拌 2 h 后用高速冷凍離心機離心 15 min (8000 r/min)，得上清液，測得其含氮量為 3066 mg/L，鉻含量為 65.58 mg/L，蛋白質(zhì)含量為 20.39 g/L。4 ℃保存，備用。

1.1.4 培養(yǎng)基的制備

（1）富集培養(yǎng)基

明 膠 1.0% ， 葡 萄 糖 0.5% ，NaCL 0.5% ，pH 7.2～7.5 。

（2）細(xì)菌培養(yǎng)基

5.0 g 牛肉膏，10.0 g 蛋白胨，5.0 g 氯化鈉，20.0 g 瓊脂。加熱攪拌，定容至 1 L，NaOH 或 HCl 調(diào) pH，分裝，121 ℃，蒸壓 20 min。

（3）真菌培養(yǎng)基

真菌固體培養(yǎng)基：稱取成品孟加拉紅培養(yǎng)基 36.7 g（內(nèi)含 5.0 g 蛋白胨，1.0 g KH2PO4，0.5 g MgSO4，10.0 g葡 萄 糖，0.1 g 氯 霉素 ，0.033 g 孟 加拉 紅 ，20.0 g 瓊脂），煮沸溶解，加水至 1 L，121 ℃蒸壓 20 min。

真菌液體培養(yǎng)基：除不加瓊脂外（滅菌前濾紙過濾），配置成分與步驟均與固體培養(yǎng)基一致。

注：培養(yǎng)基中的堿式硫酸鉻單獨滅菌，使用時按比例加入培養(yǎng)基混勻。

1.1.5 孢子懸浮液的制備

鉤取真菌，接種至平板，培養(yǎng) 3 d 后，接種環(huán)輕刮孢子，置于含有無菌水的錐形瓶（內(nèi)含 30 顆玻璃珠），搖晃，并稀釋至 OD600=0.1。

1.2 耐鉻微生物的分離純化與篩選

稱取 2 g 含鉻污泥，用 20 mL 生理鹽水浸泡并搖勻后，取 1 mL 加入到裝有 50 mL 的富集培養(yǎng)基的三角瓶中，35 ℃、180 r /min 恒溫振蕩培養(yǎng) 1～2 d。

吸取 1 mL 的富集培養(yǎng)液，移至含有 9 mL 的無菌蒸餾水的試管中，即得 10-1混合液，逐梯度稀釋，得到 10-1～10-5的混合液，各梯度做 3 組平行。吸取濃度為 10-1～10-5的混合液各 100 μL，滴入到相應(yīng)編號的平板，用三角刮刀（已滅菌）在平板上均勻涂布，最后用 PARAFILM 沿平板邊緣進行封口。平板先正置24 h，后倒置于 35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5～7 d，設(shè)置對照組。觀察不同菌落生長情況，編號記錄。

用接種環(huán)挑選單菌落，培養(yǎng)皿半揭劃線，每個菌落設(shè)置 3 個平行，并設(shè)置對照組，倒置培養(yǎng) 3 d。多次分離純化。

用接種環(huán)刮取固體培養(yǎng)基中的單菌落的純種菌接種至添加三價鉻質(zhì)量濃度為 50 mg/L 的平板中，置于恒溫鼓風(fēng)培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為 35 ℃，倒置培養(yǎng)（設(shè)置三組平行）。培養(yǎng) 5 d 后，挑選出生長較好的菌株接種至三價鉻質(zhì)量濃度為 100 mg/L 的平板中，按此方法，依次將菌株分別接種到三價鉻質(zhì)量濃度為 100、200、400、600、800 mg/L 的培養(yǎng)基中，觀察不同菌株在含不同濃度的三價鉻的培養(yǎng)基中的生長情況，挑選出耐鉻能力最強的菌株。

1.3 菌種的生物學(xué)鑒定

將菌株培養(yǎng) 3 d 后的平板，封口，寄至上海生工生物工程股份有限公司。由上海生工生物工程股份有限公司完成測序結(jié)果，并將本實驗菌株的 ITS 序列結(jié)果在 NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）上進行 BLAST 分析，挑選 15 株同源序列，用 MEGA 6.0軟 件 中的 ClustalxW 軟 件進 行 序 列對 比 ， 并 采 用Bootstrap 方法重復(fù)計算 1000 次進行自檢分析，采用“鄰接法”構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（phylogenetic tree），得出鑒定結(jié)果。

1.4 耐鉻菌厭氧消解含鉻膠原蛋白液

采用恒溫水浴搖床控制厭氧發(fā)酵瓶內(nèi)的溫度為 35 ℃，往發(fā)酵瓶內(nèi)通入氮氣吹掃 3 min 連接排水集氣裝置。在厭氧發(fā)酵瓶中加入含鉻膠原蛋白液、蒸餾水、耐鉻菌孢子懸浮液、葡萄糖，控制耐鉻菌不同的接種量不同的碳氮比，用 1∶1 的稀硫酸和30%的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的 pH 約為 7.0。然后將厭氧發(fā)酵瓶放入到恒溫水浴搖床，設(shè)定溫度 35℃，轉(zhuǎn)速 110 r/min，進行厭氧消化實驗，每隔 24 h 記錄產(chǎn)氣量，直到幾乎沒有排出來的液體，判斷消化反應(yīng)達到終點，停止實驗。用 0.2 L 集氣袋采集適量反應(yīng)產(chǎn)生的氣體，注入氣相色譜儀檢測氣體組分，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)氣體曲線計算氣體各組分含量。每三天對消化液進行取樣，測定 pH、鉻濃度和蛋白質(zhì) 濃 度 。計算累積產(chǎn)氣量并考察反應(yīng)過程中體 系 的 pH、鉻含量、蛋白質(zhì)含量變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鉻厭氧微生物的篩選

經(jīng)過富集與梯度稀釋培養(yǎng)后 ， 在 真 菌培養(yǎng)基（不含鉻）和細(xì)菌培養(yǎng)基（不含鉻）中進行了 4 次分離與純化，從含鉻污泥中總共得到細(xì)菌 3 株、真菌 1株 、 放 線 菌 1 株 ， 細(xì) 菌 分 別 命 名 為 BN1、BN2 和BN3，真菌命名為 FN，放線菌命名為 AN。

在平板篩選的過程中，觀察到平板中三價鉻的濃度越高，毒性越大，對細(xì)菌的正常生長代謝影響較大，與細(xì)菌相比，放線菌與真菌對三價鉻的耐受性更好。在進一步實驗過程中，毒性較大的培養(yǎng)基中 FN受到的影響較小。而 AN 的生長幾乎完全受到抑制，說明放線菌的生長受到三價鉻的抑制。相比較而言，真菌對三價鉻的耐受性明顯優(yōu)于其他菌。經(jīng)篩選最終得到 1 株優(yōu)勢真菌 FN，進行后續(xù)實驗。

2.2 菌種的形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

真 菌 FN 鑒 定 所 用 引 物 序 列 ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’， 所用引物序列 ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，擴增序列為 ITS1與 ITS4 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1 和 2，DNA 經(jīng) PCR 擴增后，菌株 FN 的 ITS 產(chǎn)物片段大小為 569 bp。將本實驗菌株 FN 的 ITS 序列結(jié)果在 NCBI （美國國立生物技術(shù)信息中心）上進行 BLAST 分析，挑選 15 株同源序列，用 MEGA 6.0 軟件中的 ClustalxW 軟件進行序列對比，并采用 Bootstrap 方法重復(fù)計算 1000 次進行自檢分析，采用“鄰接法”構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖 1 所示。

基于 ITS 的系統(tǒng)進化樹如圖 1 所示，菌株 FN與 2 株黃曲霉菌 (Aspergillus flavus strain USMG09與 Aspergillus flavus strain Af01) 和 2 株米曲霉菌(Aspergillus oryzae strain sscl-3 和 Aspergillus oryzae isolate MH2)的可靠值高達到 99%，與其他菌株 Aspergillus pseudotamarii、Aspergillus caelatus等的差異性較大。由于黃曲霉和米曲霉的基因組非常接近，所以只根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹單一的鑒定法較難判斷。只能推斷菌株 FN 為黃曲霉或米曲霉。根據(jù)白飛榮等[2-3]對黃曲霉與米曲霉辨別的研究，結(jié)合菌株FN 的 3 種顯微 鏡 下的形態(tài)觀察與平板中 生 長情況，真菌 FN 的孢子在平板培養(yǎng) 3～4 d 時，孢子呈黃綠色，在第 5～8 d 培養(yǎng)時，孢子顏色逐漸變?yōu)樯詈稚c齊祖同[4]中所描述的米曲霉的特征一致，所以確定本實驗分離的菌株 FN 為米曲霉。

圖1 菌株 FN 與相近菌株基于 ITS 序列系統(tǒng)進化樹Fig. 1 phylogenetic tree of strain FN and similar strains based on its sequence

2.3 耐鉻菌厭氧消化含鉻膠原蛋白液

2.3.1 碳氮比對厭氧消化的影響

對 碳 氮 比 為 20 ∶1 （A1）、25 ∶1 （A2）、30 ∶1（A3） 的耐鉻菌與含鉻膠原蛋白液的厭氧消化進行了探究，同時與不投加碳源組（A4）的厭氧消化進行對比。實驗結(jié)果見圖 6。

由圖 2 可知，隨著碳氮比逐漸升高 （從 20 至30），反應(yīng)系統(tǒng) pH 逐漸降低，碳氮比為 30 時降至4.30～4.50。這是由于提高碳氮比會導(dǎo)致消化液中的有機氮濃度減少，而在厭氧消化中是由有機氮脫氮后產(chǎn)生的氨氮來控制消化液不過度酸化，以維持pH 的穩(wěn)定[5]。有機氮濃度的減少會使消化液中的氨氮濃度也隨之降低，系統(tǒng) pH 無法再保持中性開始下降，但是在反應(yīng)后期消化液中仍有堿度讓 pH 不再繼續(xù)下降。當(dāng)碳氮比為 30 時，pH 過低已經(jīng)不適宜于厭氧微生物的生長，產(chǎn)氣過程受到抑制。

圖2 不同碳氮比下厭氧消化的 pH 變化Fig. 2 pH change of anaerobic digestion under different C/N ratios

由圖 3 可知，A1、A2、A3 的日產(chǎn)氣量均在第二天達到峰值，在 3～4 d 產(chǎn)氣量急劇下降，這表明 A1、A2、A3 有明顯的生物代謝，原因可能是反應(yīng)開始時消化蛋白液中含有溶解氧，有機物消解速率快，從第二天開始，溶解氧消耗完后開始厭氧消化，由于有機物的分解使鉻膠原蛋白液中有機酸的濃度升高，消化液呈酸化狀態(tài)，所以導(dǎo)致產(chǎn)氣量急劇下降的情況。這三組的日產(chǎn)氣量基本呈平穩(wěn)趨勢，且產(chǎn)氣量低。原因可能是 pH 過低，不利于微生物的生長，導(dǎo)致整個厭氧發(fā)酵緩慢。A4 在第 8 天日產(chǎn)氣量出現(xiàn)峰值后趨于平穩(wěn)，且產(chǎn)氣量低。原因是含鉻膠原蛋白液中本身的碳源不足以維持厭氧微生物的正常生長代謝，導(dǎo)致厭氧微生物生長受到抑制，厭氧發(fā)酵過程啟動緩慢，隨著碳源的不斷消耗，產(chǎn)氣過程在 20 d 之后停止。

圖3 不同碳氮比下厭氧消化的日產(chǎn)氣量Fig. 3 Daily gas production of anaerobic digestion under different C/N ratios

由圖 4 可知，A2 日累積產(chǎn)氣量最多且增速最快，產(chǎn)氣能力最強，所以控制碳氮比為 25 時最適宜耐鉻厭氧微生物對含鉻膠原蛋白液的消化作用。這一實驗結(jié)果與許多文獻中提到的厭氧消化的最適碳氮比為 25 一致[6-7]，與單一底物的厭氧消化相比，添加額外碳源并在碳氮比為 25 時進行厭氧共消化，反應(yīng)系統(tǒng)運行狀況最好，產(chǎn)氣量最高，而且可以在一定程度上保留消化液的養(yǎng)分，同時實現(xiàn)沼氣 和沼液資源的利用。

圖4 不同碳氮比下厭氧消化的日累積產(chǎn)氣量Fig. 4 Daily cumulative gas production of anaerobic digestion under different C/N ratios

研究表明，添加碳源后耐鉻菌對含鉻膠原蛋白液中的鉻具有一定的去除作用，耐鉻菌通過代謝途徑或物理 - 化學(xué)吸附途徑去除膠原蛋白液中的三價鉻。由圖 5（a）可知 A1、A2、A3 在 9 d 后去除率基本不再變化，原因是長期接觸三價鉻，導(dǎo)致生長代謝減弱，這與 Ksheminska[8]等的研究結(jié)果一致，三價鉻對真菌 Pichia guilliermondii 的生長有抑 制 作 用 ，同時微生物表面官能團的吸附位點有限，限制了微生物對重金屬三價鉻的進一步去除。繼續(xù)增加接種時間，去除率不再升高。機制研究表明，三價鉻大部分通過主動吸收進入原生質(zhì)體，少數(shù)集中在細(xì)胞壁。很多學(xué)者對真菌去除水溶液中的三價鉻也進行了研究，Sepehr 等[9]在不同培養(yǎng)條件下，研究了 2 株活曲菌(黑曲霉 Aspergillus niger、米曲霉 Aspergillus oryzae)對三價鉻去除效果的影響。結(jié)果表明：在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下，真菌的初始接種量為 0.8 g/L（以干菌絲質(zhì)量計算），黑曲霉和米曲霉的最大吸附量分別為 185 mg/g 和 208 mg/g，在實際含三價鉻廢水中的脫鉻率分別為 72 %和 67 %。在本研究中耐鉻菌的作用對象為革屑經(jīng)堿酶法 預(yù)處理后的含鉻膠原蛋白液，其中大部分三價鉻與膠原纖維中的羧基通過配位的方式結(jié)合，所以導(dǎo)致對鉻的去除率在膠原蛋白液中不如在含游離鉻的廢水中。

圖5 不同碳氮比下厭氧消化對鉻的去除率和對蛋白的水解率Fig. 5 Removal rate of chromium and hydrolysis rate of protein by anaerobic digestion under different carbon nitrogen ratio

除不額外添加碳源的 A4 組外，A1、A2、A3 對鉻的去除率幾乎不存在差別，這說明只要能保證足夠的碳源，耐鉻菌對鉻的去除效率不受碳氮比的影響。

由圖 5（b）可知，在厭氧消化的反應(yīng)初期，微生物對蛋白質(zhì)的消耗比較快，說明此時微生物代謝旺盛，分解有機物快。而在消化反應(yīng)中后期，由于 pH的降低與有機物含量不斷減少，厭氧微生物的活性降低，反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)含量幾乎不發(fā)生變化。A2蛋白質(zhì)水解率最高，30 d 水解率為 65.2%，說明碳氮比為 25 時最適宜耐鉻菌的生長。其次為 A1，30 天水解率為 54.9%。A3 在 3 d 水解率達到 20.59%后，體系中的蛋白質(zhì)含量只在小范圍內(nèi)變化，這是因為碳氮比過高導(dǎo)致蛋白液過度酸化，過低的 pH 不再適宜厭氧微生物的生存。沒有添加碳源的 A4 組對蛋白質(zhì)的水解率比較低，在 12 d 達到 20.7%后由于蛋白液中本身含有的碳源被消耗完，微生物的代謝停滯，蛋白質(zhì)含量不再減少。

2.3.2 接種量對厭氧消化的影響

對耐鉻菌接種量分別為 10%、25%、50%時含鉻膠原蛋白液的厭氧消化效果進行了探究，同時與以含鉻膠原蛋白液為單一底物（B4）厭氧消化進行對比。實驗結(jié)果見圖 6～8。

由圖 6 可知，耐鉻菌對含鉻膠原蛋白液進行厭氧消化極易出現(xiàn)酸化現(xiàn)象，pH 迅速降低，會對體系內(nèi)厭氧消化過程產(chǎn)生抑制，甚至導(dǎo)致反應(yīng)停止。隨著接種量的升高，反應(yīng)體系 pH 下降，原因是接種的耐鉻厭氧膠原蛋白水解菌在反應(yīng)初期對有機物的分解積累了大量的有機酸，使 pH 急劇下降，產(chǎn)氣也受到抑制。發(fā)酵 7 d 之后，pH 小幅度回升使得酸化現(xiàn)象得到緩解，日產(chǎn)氣量也出現(xiàn)了小高峰，之后 pH穩(wěn)定在 5.0 左右，且產(chǎn)氣量低。

圖6 不同接種量下厭氧消化的 pH 變化Fig. 6 pH change of anaerobic digestion under different inoculation amounts

由圖 7 可知，各處理組日產(chǎn)氣量趨勢基本相同，均是在厭氧發(fā)酵的第二天達到峰值，其中接種量最高的 B3 組達到峰值時日產(chǎn)氣量最高，達到 414 mL，沒有投加耐鉻菌的 B4 組整體產(chǎn)氣量最低，最高日產(chǎn)氣量只有 56 mL。在發(fā)酵到18 d 之 后 各 組 的 日 產(chǎn) 氣 量趨于平穩(wěn)且低，厭氧消化的過程基本停滯，原因是反應(yīng)體系 pH 過低抑制了厭氧消化的過程。說明接種耐鉻優(yōu)勢 菌 可 以 有 效 地 提 高 消 化反應(yīng)的產(chǎn)氣量。在一定范圍內(nèi)，添加的耐鉻優(yōu)勢菌的接種量越多，產(chǎn)氣量越高。

圖7 不同接種量下厭氧消化的日產(chǎn)氣量Fig. 7 Daily gas production of anaerobic digestion under different inoculation amounts

由圖 8（a）可知，在一定范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，耐鉻菌對三價鉻的去除幾乎呈線性增加。沒有投加耐鉻菌的 B4 中三價鉻的濃度幾乎不發(fā)生變化。雖然三價鉻是微生物所必須的微量元素，在營養(yǎng)物質(zhì)充足時，耐鉻菌孢子對外界不良因子抵抗的能力較強，能夠通過微生物的正常新陳代謝吸附去除三價鉻，增加耐鉻菌孢子的用量，相當(dāng)于增加了有效吸附位點和生物作用，但長期接觸高濃度的三價鉻，微生物生長受到限制，導(dǎo)致去除率難以增加。B1、B2 在 9 d 后對鉻的去除率幾乎不再變化，而 B1 對鉻的去除率還稍有增加，最高可達到 25.15%，原因是 B1 接種量低，消化體系中營養(yǎng)物質(zhì)消耗慢，微生物還可以在一定程度上維持代謝活動。

由圖 8（b），接種量越大，蛋白質(zhì)的水解率越高，B1、B2、B3 在 30 d 內(nèi) 對 蛋 白 質(zhì) 的 水 解 率 分 別 為48.78%，65.2%，86.49%，而不投加耐鉻菌的 B4 水解率非常低。與圖 6 相似，在厭氧消化前期微生物快速繁殖，蛋白質(zhì)的水解趨勢較為明顯，在厭氧消化進行到中后期時由于 pH 的降低以及有機底物的消耗，微生物生長緩慢，對蛋白質(zhì)的水解能力降低，微生物對蛋白質(zhì)水解程度基本達到飽和。

圖8 不同接種量下厭氧消化對鉻的去除率和對蛋白質(zhì)的水解率Fig. 8 Removal rate of chromium and hydrolysis rate of protein by anaerobic digestion under different inoculation amounts

3 結(jié)論

根據(jù)本論文的實驗結(jié)果，可以得到以下結(jié)論：經(jīng)過富集、分離、純化、篩選得到優(yōu)勢耐鉻菌株 FN。通過梯度實驗確定優(yōu)勢菌在鉻膠原蛋白液中的最大耐鉻質(zhì)量濃度為 1000 mg/L，并對耐鉻菌株進行厭氧馴化。光學(xué)顯微鏡下觀察到真菌 FN 孢子完整的多細(xì)胞形狀。掃描電鏡圖觀察到孢子呈圓顆粒狀。熒光顯微鏡圖片看到菌絲及孢子的立體結(jié)構(gòu)，菌絲互相纏繞連接，初步鑒定真菌 FN 為曲霉。經(jīng) PCR 擴增后，采用“鄰接法”構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和在平板生長情況中培養(yǎng)時間延長孢子顏色逐漸變?yōu)樯詈稚?，最終鑒定得到FN 為米曲霉(Aspergillus oryzae)。

耐鉻菌接種量為 25%、初始 pH 約為 7，溫度 35℃ ， 震 蕩 110 r/min 條 件 下 控 制 碳 氮 比 分 別 為 20、25、30。實驗結(jié)果表明：碳氮比為 25 時厭氧消化體系產(chǎn)氣性能最佳，第二天達到最高日產(chǎn)氣 量 295 mL，30 天累計產(chǎn)氣 1292.5 mL，甲烷含量 52.57%，蛋白液 pH 降至 5.04， 鉻 去 除 率 為31.02%，蛋白質(zhì)水解率為65.2%。碳氮比為 25、初始pH 約為 7，溫度 35 ℃，震蕩110 r/min 條件下，投加耐鉻菌量分別為 10%、25%、50%。實驗結(jié)果表明：投加量為 50%時厭氧消化體系產(chǎn)氣性能最佳，第二天達到最高日產(chǎn)氣量 414 mL，30 d 累計產(chǎn)氣 1648 mL，甲烷含量 45.18%，蛋白液 pH 降至 4.95，鉻去除率為41.96%，蛋白質(zhì)水解率 86.49%。在一定范圍內(nèi)，提高耐鉻菌投加量可以提高產(chǎn)氣性能和消化效果。