活細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中線粒體和核仁微環(huán)境動(dòng)力學(xué)的熒光壽命成像研究*

楊志剛 劉穎超 張仕青 羅瑞鑒 趙需謙 連加榮 屈軍樂(lè)

(深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

核仁和線粒體在維持細(xì)胞平衡發(fā)揮重要作用,研究其生理過(guò)程有助于深入了解生物學(xué)功能.本文采用一種紅色熒光的芘羅丹明熒光探針在不同條件下靶向標(biāo)記細(xì)胞線粒體和核仁.通過(guò)激光共聚焦成像和熒光壽命成像技術(shù)分析HeLa 細(xì)胞在光照和藥物刺激下細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化,并利用相圖定量分析了線粒體與核仁的微環(huán)境變化,確定在穩(wěn)態(tài)HeLa 細(xì)胞中探針標(biāo)記到的線粒體的平均熒光壽命約為3.65 ns,線粒體黏度約為66×10-3 Pa·s.在激光光照后,探針標(biāo)記到HeLa 細(xì)胞線粒體的熒光壽命降至3.61 ns,對(duì)應(yīng)線粒體黏度增至約131×10-3 Pa·s;使用紫杉醇和秋水仙堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,觀察到探針標(biāo)記于HeLa 細(xì)胞核仁的熒光壽命先增加后降低,反映了在HeLa 細(xì)胞凋亡過(guò)程中核仁微環(huán)境的變化,證明HeLa 細(xì)胞在非穩(wěn)態(tài)情況下核仁和線粒體的功能變化,為線粒體和核仁功能障礙相關(guān)疾病研究提供了新的研究方法.

1 引言

核仁被稱為“細(xì)胞的核糖體工廠[1],主要由纖維中心、致密纖維組分和顆粒組分構(gòu)成[2],是核糖體合成和RNA 組裝的場(chǎng)所[3],與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān),核仁的異常通常導(dǎo)致疾病如癌癥的發(fā)生[4,5].同時(shí),黏度作為細(xì)胞微環(huán)境的重要參數(shù)之一,為維持細(xì)胞器生理過(guò)程的正常運(yùn)行提供保障,對(duì)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著顯著的影響,細(xì)胞微環(huán)境黏度變化對(duì)RNA 的擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)影響深遠(yuǎn),甚至可以改變活細(xì)胞中RNA 的功能[6-8].此外,線粒體作為細(xì)胞中重要的“能量工廠”,受到外界刺激損傷會(huì)發(fā)生黏度變化[9],線粒體異常是代謝或神經(jīng)退行性疾病等發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志[10-17].在阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病中,腦組織中神經(jīng)細(xì)胞線粒體黏度明顯增大[18],并且核仁的形態(tài)也與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[19,20].此外,DNA 損傷、熱刺激、病毒入侵等各種壓力刺激下,核仁的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生如崩解等形態(tài)學(xué)變化[20,21].因此,研究線粒體和核仁形態(tài)變化和量化局部黏度值將有助于深入研究核仁和線粒體的生物學(xué)功能.

近年來(lái),不同熒光探針被用于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)記與成像,其中有機(jī)染料作為構(gòu)建熒光探針的主要部分[22-25],相比于熒光蛋白、納米材料等在細(xì)胞器標(biāo)記與成像方面具有顯著優(yōu)勢(shì).有機(jī)熒光分子探針具有體積小、成像分辨率高等優(yōu)勢(shì)可用于活細(xì)胞線粒體和核仁的標(biāo)記成像及外界刺激下的應(yīng)激反應(yīng)研究,如線粒體微環(huán)境黏度定量變化[26-28],線粒體和核仁之間可逆遷移成像,監(jiān)測(cè)在紫外光照射、秋水仙堿及紫杉醇等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體膜電位變化[8].Dutta 等[1]研究線粒體和核仁在非偶聯(lián)氧化磷酸化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯過(guò)程中微黏度變化,指出同時(shí)存在于線粒體和核仁的特定蛋白引導(dǎo)了這兩種細(xì)胞器之間的相互關(guān)聯(lián).對(duì)線粒體和核仁受到上述刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的定量研究有利于深入了解其相關(guān)生物學(xué)功能.因此,開(kāi)展基于小分子熒光探針的線粒體與核仁成像研究,對(duì)局部環(huán)境中線粒體和核仁形態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量分析具有重要意義.

在本工作中,為了跟蹤線粒體和核仁并量化細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中線粒體和核仁的局部環(huán)境變化,采用了一種基于芘羅丹明熒光染料 (RH) 作為標(biāo)記線粒體與核仁的標(biāo)記探針,RH 具有紅色熒光,在不同實(shí)驗(yàn)條件下可以靶向標(biāo)記活細(xì)胞的線粒體和核仁,通過(guò)熒光成像和熒光壽命成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM) 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)線粒體和核仁形態(tài)及微環(huán)境變化.此外,通過(guò)FLIM 定量線粒體黏度可以研究細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中線粒體微環(huán)境的變化,同時(shí)在研究過(guò)程中應(yīng)用相圖技術(shù)進(jìn)行定量分析[29],為更好地了解細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中線粒體和核仁微環(huán)境變化在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的作用提供研究手段.

2 實(shí)驗(yàn)測(cè)試與熒光成像材料

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

ER-Tracker Blue,Lyso-Tracker Green,Mito-Tracker Deep Red FM 和Hochest 33342 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS) 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司,雙抗 (penicillin streptomycin,PS),DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS) 和其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;小牛胸腺DNA、酵母RNA、DNase I 和RNase A 購(gòu)自美國(guó)Aldrich公司.

2.2 熒光探針測(cè)試儀器及制備方法

RH 探針在不同溶劑、不同極性、不同pH 值和黏度環(huán)境中的吸收、發(fā)射光譜和熒光壽命研究,分別使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (GBC Cintra2020)和模塊化熒光光譜儀 (HORIBA Fluorolog-3) 記錄紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜及熒光壽命.不同極性的溶劑由四氫呋喃和水按體積分?jǐn)?shù)遞增10%的比例混合而成,不同黏度溶劑由甘油和甲醇按照體積分?jǐn)?shù)遞增10%的比例混合制備而成,不同pH 值的溶劑由在去離子水中滴加鹽酸或氫氧化鈉溶液配制而成.參考Zhang 等[30]工作,吸收光譜所用探針濃度為5 μmol/L,發(fā)射光譜和熒光壽命所用探針濃度均為1 μmol/L.染料分子的熒光信號(hào)比吸收光譜信號(hào)靈敏,因此,一般吸收光譜使用的濃度比熒光光譜的高.吸收光譜使用的濃度如果過(guò)低,則吸光度小,光譜波動(dòng)較大,導(dǎo)致的誤差也較大.

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和共定位實(shí)驗(yàn)

將HeLa 細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)、COS-7 細(xì)胞(非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞)和ID-8 細(xì)胞(小鼠卵巢上皮癌細(xì)胞)以約1.5×105的密度接種在玻璃底培養(yǎng)皿上,添加10% FBS 和1% PS 的DMEM 混合培養(yǎng)基,將細(xì)胞皿置于5% CO2,37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞密度達(dá)到60%后,將細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞皿取出進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).將HeLa 細(xì)胞分別與RH 探針、商品化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針、溶酶體探針、線粒體探針和細(xì)胞核探針共孵育,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min.其中,RH 探針(0.5 μmol/L) 分別與商品化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針ERTracker Blue (0.5 μmol/L),溶酶體探針Lyso-Tracker Green (0.05 μmol/L) 和線粒體探針(Mito-Tracker Deep Red FM) (0.5 μmol/L) 共孵育,RH 探針 (2 μmol/L) 和商用細(xì)胞核探針Hoechst 33342 (0.2 μmol/L) 共孵育.細(xì)胞成像前,用PBS洗滌兩次后,用于共聚焦激光掃描顯微 (confocal laser scanning microscope,CLSM) 成像 (Nikon A1,60×油鏡,數(shù)值孔徑1.49).然后分別采集以下通道的圖像: 425—475 nm (ER-Tracker Blue 和Hoechst 33342),500—550 nm (Lyso-Tracker Green),570—620 nm (RH),667.5—732.5 nm (Mito-Tracker Deep Red),共定位分析結(jié)果的Pearson 系數(shù)由Image J 軟件計(jì)算獲得.

2.4 核酸消化實(shí)驗(yàn)

加入1 mL 的4%多聚甲醛溶液用來(lái)固定HeLa細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 min,之后取出用PBS清洗兩次.固定后的細(xì)胞分別加入1 mL 的無(wú)DNase I 的RNase A (100 μg/mL) 和無(wú)RNase A 的DNase I (100 U/mL),空白對(duì)照組僅加入1 mL 的PBS,置于培養(yǎng)箱2 h 之后用PBS 沖洗兩次,再與RH 探針(2 μmol/L) 和Hoechst 33342 (0.2 μmol/L)共孵育30 min.細(xì)胞成像前用PBS 洗滌兩次,之后加入新的PBS,留待使用.

2.5 CLSM 成像和FLIM 成像

為了研究RH 在標(biāo)記不同細(xì)胞線粒體和核仁的情況,分別將HeLa 細(xì)胞、COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞分別與RH (0.5,2 μmol/L) 共孵育,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,之后用PBS 洗滌兩次,并加入新鮮培養(yǎng)基,進(jìn)行相應(yīng)培養(yǎng)待用.為了研究線粒體和核仁在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化,使用紫杉醇和秋水仙堿誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡.細(xì)胞中分別加入含100 nmol/L 紫杉醇、10 nmol/L 和100 nmol/L 秋水仙堿的培養(yǎng)基,然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),其中加入秋水仙堿的置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min,加入紫杉醇的則培養(yǎng)0.5,1,2,4 h,之后用PBS 清洗兩次,然后用2 μmol/L 的RH 探針?lè)跤?0 min.細(xì)胞成像前用PBS 洗滌兩次,加入新鮮培養(yǎng)基.為了研究光照對(duì)細(xì)胞線粒體和核仁的影響,CLSM 成像過(guò)程使用“時(shí)間序列”功能采集熒光圖像.同時(shí),使用FLIM 系統(tǒng)(DCS120,100倍油鏡,數(shù)值孔徑1.49) 研究線粒體在光照刺激下發(fā)生的斷裂、融合等形態(tài)變化以及核仁在紫杉醇和秋水仙堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況下發(fā)生的微環(huán)境變化,使用SPCImage (8.4 版本,Becker&Hickl GmbH) 進(jìn)行熒光壽命擬合和相圖分析,采用雙指數(shù)擬合.

3 結(jié)果與討論

首先,為了研究熒光探針的光物理特性,分別測(cè)試了RH 在不同溶劑極性、pH 值及不同黏度環(huán)境中的紫外吸收、熒光發(fā)射光譜和熒光衰減壽命,如圖1 所示.RH 在二氯甲烷、丙酮、甲醇等溶劑中的吸收、發(fā)射光譜變化較小,隨著溶劑極性增大,最大吸收波長(zhǎng) ((576±3) nm) 或發(fā)射峰值(590 nm),位移較小(圖1(a),(b)和表1);另外,進(jìn)一步測(cè)試RH 在四氫呋喃與水混合溶劑中的熒光變化,隨著四氫呋喃的比例逐漸增大,溶劑的極性(介電常數(shù))連續(xù)減小,探針的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化較小,最大變化幅度不超過(guò)10%.隨著水含量的增大(＞90%),RH 的熒光強(qiáng)度顯著降低,可能是由于RH 在水中溶解度低,發(fā)生聚集導(dǎo)致熒光減弱 (見(jiàn)圖1(c),(d)).此外,在覆蓋細(xì)胞生理pH 值3—12的范圍內(nèi)RH 的熒光壽命變化僅為0.06 ns (圖1(e),(f)),環(huán)境pH 值對(duì)RH 的熒光壽命的影響較小.相較極性和pH 的影響,RH 在不同黏度環(huán)境中的熒光強(qiáng)度和熒光壽命變化較大,如圖1(g)—(h)所示,隨著甘油含量的增大(甲醇與甘油混合溶劑),環(huán)境黏度從甲醇(0.6×10-3Pa·s)增至甘油(0.945 Pa·s),探針的熒光強(qiáng)度和熒光壽命均呈現(xiàn)規(guī)律下降趨勢(shì),熒光強(qiáng)度降低幅度超過(guò)50%,熒光壽命從3.95 ns下降到3.45 ns,降低幅度達(dá)到0.5 ns.因此,探針RH 受到環(huán)境黏度影響更大,而可以忽略環(huán)境極性和pH 變化對(duì)探針的影響.溶劑極性對(duì)熒光壽命的影響主要包括溶劑分子介電常數(shù)、氫鍵等因素對(duì)熒光染料分子的作用.首先,RH 分子帶一個(gè)正電荷,能量比較低,溶劑的極性(介電常數(shù))對(duì)RH 分子的影響較小;另外,RH 分子中沒(méi)有氫鍵活性結(jié)構(gòu),溶劑分子也不能與染料發(fā)生氫鍵作用,因此RH 分子對(duì)溶劑極性不敏感,環(huán)境極性對(duì)RH 探針熒光壽命的影響可以忽略.在分子設(shè)計(jì)上,我們采用芘與間氨基酚合成羅丹明衍生物,旨在構(gòu)造對(duì)黏度響應(yīng)的熒光探針,芘的相對(duì)振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng),可以影響羅丹明衍生物的熒光效應(yīng),參照課題組以前的黏度分子轉(zhuǎn)子研究工作[27,31,32].本文采用芘作為振動(dòng)部分(不能完全轉(zhuǎn)動(dòng))來(lái)調(diào)控?zé)晒夥肿拥臒晒庑盘?hào),通過(guò)分子模擬(高斯計(jì)算),在低黏度環(huán)境中,分子中芘與羅丹明衍生結(jié)構(gòu)處于垂直狀態(tài),二者之間沒(méi)有電子轉(zhuǎn)移淬滅效應(yīng),熒光壽命長(zhǎng),在黏度環(huán)境中,芘與羅丹明結(jié)構(gòu)發(fā)生一定轉(zhuǎn)動(dòng),增強(qiáng)電子轉(zhuǎn)移淬滅的效應(yīng),導(dǎo)致熒光壽命縮短.因此,可以將探針?lè)肿拥臒晒鈮勖c環(huán)境黏度關(guān)聯(lián)用于研究微環(huán)境的黏度效應(yīng).對(duì)探針的熒光強(qiáng)度或熒光壽命構(gòu)建與黏度的函數(shù)關(guān)系,可以通過(guò)測(cè)量熒光壽命定量分析所處環(huán)境的黏度.

圖1 熒光探針RH 光物理性能研究 (a) RH 在不同溶劑中的紫外吸收光譜;(b) RH 在不同溶劑中的熒光光譜;(c) RH 在不同比例的四氫呋喃和水混合溶劑中的發(fā)射光譜,激發(fā)波長(zhǎng)495 nm;(d) 熒光強(qiáng)度與不同比例的四氫呋喃和水混合溶劑之間的關(guān)系;(e) RH 在不同pH 值溶劑環(huán)境中熒光壽命衰減曲線;(f) RH 的熒光壽命與pH 值的關(guān)系;(g) RH 在甲醇和甘油混合的黏度溶劑中的發(fā)射光譜(室溫20 ℃),激發(fā)波長(zhǎng)495 nm;(h) 熒光強(qiáng)度與黏度同時(shí)取對(duì)數(shù)后的線性關(guān)系;(i) RH 在甲醇和甘油混合的黏度溶劑中的熒光衰減曲線(室溫20 ℃),熒光壽命的激發(fā)波長(zhǎng)為456 nm;(j) RH 熒光壽命與黏度同時(shí)取對(duì)數(shù)后的線性關(guān)系Fig.1.Fluorescence spectra of RH in different solvents: (a) UV absorption spectrum of RH in different solvents;(b) fluorescence spectra of RH in different solvents;(c) the emission spectrum of RH in the mixture of tetrahydrofuran and water with an excitation wavelength of 495 nm;(d) the relationship between fluorescence intensity and different proportions of the mixture of tetrahydrofuran and water;(e) RH fluorescence lifetime decay curves of RH in solvents with different PH values;(f) relationship between the fluorescence lifetime of RH and PH value;(g) emission spectrum of RH in the viscous solvent mixed with methanol and glycerol (room temperature 20 ℃),excitation wavelength is 495 nm;(h) linear relationship between fluorescence intensity and viscosity after taking logarithm simultaneously;(i) the fluorescence attenuation curve of RH in a viscous solvent mixed with methanol and glycerol (room temperature 20 ℃),the excitation wavelength of the fluorescence lifetime is 456 nm;(j) linear relationship between fluorescence lifetime and viscosity after taking logarithm simultaneously.

表1 探針RH 在不同溶劑中的吸收發(fā)射波長(zhǎng)及熒光壽命Table 1.Absorption,emission wavelength and fluorescence lifetime of probe RH in different solvents.

此外,還研究了探針RH 分別對(duì)DNA 與RNA的熒光滴定分析,分別獲得了RH 的熒光光譜和熒光壽命響應(yīng)曲線,如圖2 所示.向RH 的水溶液中剛加入DNA 或RNA 時(shí),RH 的發(fā)射強(qiáng)度均顯著下降,之后隨著DNA 或RNA 的繼續(xù)滴加,產(chǎn)生不同幅度的增強(qiáng).可能是剛加入DNA 或RNA 時(shí),RH 探針因正負(fù)電荷吸引被吸附到DNA 或RNA表面發(fā)生熒光淬滅(圖2(a)—(d)),隨著DNA 或RNA 的繼續(xù)增加,探針又逐漸分散并嵌入DNA或RNA 中,使得熒光強(qiáng)度產(chǎn)生增強(qiáng).同樣,RH 的熒光壽命也隨著DNA 或RNA 的增加而發(fā)生相應(yīng)的變化,如圖2(e)—(h)所示,RH 熒光壽命隨DNA含量增大而延長(zhǎng),從3.72 ns 增至5.02 ns;而RH探針與RNA 結(jié)合后壽命先由3.72 ns 降至2.97 ns,之后隨RNA 含量增大緩慢增至3.65 ns.可能因DNA/RNA 的單雙鏈結(jié)構(gòu)不同,發(fā)生作用的方式也不一樣.為了進(jìn)一步解釋探針的熒光變化,利用Autodocking 生物對(duì)接計(jì)算軟件分別模擬了探針RH 與DNA (CGCGATATCGCG 序 列),RNA(任選了有一個(gè)位置沒(méi)有配位的雙鏈RNA) 進(jìn)行了模擬計(jì)算.結(jié)果如圖2(i),(j)所示,探針只是附著在DNA 序列表面,沒(méi)有嵌入到DNA 的大溝、小溝或堿基序列中,這種作用的結(jié)合能較高(-5.25 eV)且只有一種結(jié)合方式,可能因?yàn)樘结樂(lè)肿游蛔栎^大,導(dǎo)致探針與DNA 作用力較弱;而對(duì)配位有缺失的雙鏈RNA 序列,通過(guò)對(duì)接計(jì)算可以明顯發(fā)現(xiàn),探針RH 與RNA 的作用構(gòu)型有兩種,都嵌入到缺失的配位點(diǎn),并且是探針帶正電荷的羅丹明部分插入RNA 中,疏水的芘基團(tuán)分別伸向小溝和大溝中,結(jié)合能分別是-11.2 eV 和-11.62 eV,結(jié)合能較低,說(shuō)明探針與RNA 具有較強(qiáng)的結(jié)合力,具有穩(wěn)定的結(jié)合模式,這也相應(yīng)解釋探針與DNA 和RNA 作用后的熒光與熒光壽命的變化.

圖2 探針RH (1 μmol/L) 的DNA/RNA 熒光滴定光譜及熒光壽命衰減曲線以及生物計(jì)算對(duì)接模擬探針與DNA/RNA 的結(jié)合模式 (a) RH 的RNA 熒光滴定光譜;(b) RH 的熒光強(qiáng)度隨RNA 濃度變化曲線;(c) RH 的DNA 熒光滴定光譜;(d) RH 的熒光強(qiáng)度隨DNA 濃度的變化曲線;(e) RH 的RNA 熒光滴定的熒光壽命衰減曲線;(f) RH 的熒光壽命隨RNA 濃度的變化曲線;(g) RH的分子結(jié)構(gòu)模型以及RH 的DNA 熒光滴定的熒光壽命衰減曲線;(h) RH 的熒光壽命隨DNA 濃度的變化曲線,激發(fā)光波長(zhǎng)456 nm;(i) RH 與DNA 的生物對(duì)接模擬計(jì)算;(j) RH 與RNA 的生物對(duì)接模擬計(jì)算,橫坐標(biāo)為分子結(jié)合能,縱坐標(biāo)為分子結(jié)構(gòu),使用開(kāi)源的Windows 版Autodocking 軟件Fig.2.The DNA/RNA fluorescence titration spectrum and fluorescence lifetime decay curve of probe RH (1 μmol/L) and the binding mode of probe with DNA/RNA were simulated by biocomputation: (a) RNA fluorescence titration spectroscopy of RH;(b) the fluorescence intensity of RH varies with the concentration of RNA;(c) DNA fluorescence titration spectroscopy of RH;(d) the fluorescence intensity of RH varies with the concentration of DNA;(e) fluorescence lifetime decay curve for RNA fluorescence titration of RH;(f) the fluorescence lifetime of RH varies with RNA concentration;(g) molecular structure model of RH and fluorescence lifetime decay curve for DNA fluorescence titration of RH;(h) the fluorescence lifetime of RH varies with DNA concentration;excitation light wavelength 456 nm;(i) biological docking simulation of RH and DNA;(j) biological docking simulation of RH and RNA;where the horizontal coordinate is the molecular binding energy,and the vertical coordinate is the molecular structure,using the open source Windows version of Autodocking software.

為了研究探針在細(xì)胞內(nèi)的定位情況,分別采用兩種不同濃度的RH (0.5,2 μmol/L)與HeLa 細(xì)胞進(jìn)行孵育,經(jīng)過(guò)30 min 的培養(yǎng)后,通過(guò)復(fù)染與共定位成像發(fā)現(xiàn)RH 探針在較低濃度 (0.5 μmol/L)時(shí)主要定位到線粒體上;在高濃度(2 μmol/L) 時(shí),除了定位線粒體也明顯定位在細(xì)胞核仁.

圖3(a)—(l)分別是商用溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體探針和RH 探針標(biāo)記HeLa 細(xì)胞的熒光成像及迭加圖和Pearson 相關(guān)系數(shù)分析;RH 探針在低濃度 (0.5 μmol/L) 情況下與線粒體探針的Pearson共定位系數(shù)最高(達(dá)到0.89) (圖3(i)—(l)),高于與溶酶體探針的共定位系數(shù)(0.23) (圖3(a)—(d))和與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針的共定位系數(shù)(0.50) (圖3(e)—(h)).由此說(shuō)明RH 探針在低濃度(0.5 μmol/L) 情況下優(yōu)先標(biāo)記到活細(xì)胞內(nèi)的線粒體.當(dāng)使用高濃度(2 μmol/L) 時(shí),先和Hoechst 探針一起與HeLa 細(xì)胞共孵育,RH 探針標(biāo)記的細(xì)胞核區(qū)域與Hoechst探針標(biāo)記的區(qū)域重合(圖3(m)—(p)),說(shuō)明RH 探針在高濃度時(shí)除了標(biāo)記線粒體外,還能標(biāo)記細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)構(gòu).

圖3 共定位實(shí)驗(yàn) (a)—(c) RH 探針 (0.5 μmol/L) 和溶酶體熒光探針 (0.05 μmol/L) 共定位結(jié)果;(e)—(g) RH 探針 (0.5 μmol/L和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針 (0.5 μmol/L) 共定位結(jié)果;(i)—(k) RH 探針 (0.5 μmol/L) 和線粒體熒光探針 (0.5 μmol/L) 共定位結(jié)果;(m)—(p) RH 探針 (2 μmol/L) 分別與細(xì)胞核探針Hoechst (0.2 μmol/L)和線粒體熒光探針 (0.5 μmol/L) 共定位結(jié)果;標(biāo)尺20 μm;(d),(h),(l) 由Image J 軟件計(jì)算得到的相應(yīng)通道圖像的Pearson 共定位系數(shù)Fig.3.Cell colocalization imaging: (a)-(c) The colocalization images of RH probe (0.5 μmol/L) and lysosomal fluorescence probe(0.05 μmol/L);(e)-(g) the colocalization images of RH probe (0.5 μmol/L) and ER fluorescence probe (0.5 μmol/L);(i)-(k) the colocalization images of RH probe (0.5 μmol/L) and mitochondrial fluorescence probe (0.5 μmol/L);(m)-(p) the co-localization images of the probe (RH) (2 μmol/L) with the commercial nuclear probe of Hoechst (0.2 μmol/L) and mitochondrial fluorescent probe of Mito-Tracker (0.5 μmol/L);scale bar is 20 μm;(d),(h),(l) the Pearson co-location coefficient of the corresponding channel image calculated by Image J software set,respectively.

為進(jìn)一步證明RH 探針在較高濃度 (2 μmol/L)時(shí)標(biāo)記細(xì)胞核內(nèi)核仁,分別使用DNA 和RNA 水解酶進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)的DNA 和RNA 水解實(shí)驗(yàn)與熒光成像,如圖4 所示.圖4(a)—(c)是探針與商用Hoechst 探針的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共定位成像的對(duì)照實(shí)驗(yàn)圖,可見(jiàn)RH 探針標(biāo)記到細(xì)胞核區(qū)域的圓形目標(biāo);經(jīng)過(guò)RNase A 酶消化后,核仁內(nèi)的RNA 被分解,RH 探針標(biāo)記細(xì)胞核內(nèi)的熒光區(qū)域也隨之消失,如圖4(d)—(f)所示;經(jīng)過(guò)DNase I 酶消化后,細(xì)胞內(nèi)的DNA 被分解,如圖4(g)—(i)所示,Hoechst 標(biāo)記的細(xì)胞核區(qū)域熒光明顯減弱,而RH 探針在細(xì)胞核區(qū)域標(biāo)記的圓形目標(biāo)熒光還在,由此說(shuō)明RH 探針標(biāo)記的細(xì)胞核內(nèi)目標(biāo)為核仁.

圖4 DNA 與RNA 水解酶水解實(shí)驗(yàn) (a)—(c) 空白對(duì)照組;(d)—(f) 固定的HeLa 細(xì)胞經(jīng)過(guò)RNase A 消化后的結(jié)果;(g)—(i) 固定的HeLa 經(jīng)過(guò)DNase I 消化后的結(jié)果,細(xì)胞先用4%多聚甲醛處理20 min 固定,之后分別用DNase I 和RNase A 消化2 h,最后與RH 探針(2 μmol/L)和Hoechst 探針(0.2 μmol/L)共孵育30 min,細(xì)胞成像前用PBS 清洗兩次,標(biāo)尺20 μmFig.4.Hydrolytic experiment on DNA and RNA using hydrolase: (a)-(c) Control group;(d)-(f) result of digestion of fixed HeLa cells by RNase A;(g)-(i) the result of digestion of fixed HeLa by DNase I;the cells were treated with 4% paraformaldehyde for 20 min,then digested with DNase I and RNase A for 2 h,respectively,and incubated with RH probe (2 μmol/L) and Hoechst probe(0.2 μmol/L) for 30 min;cells were washed twice with PBS before imaging.Scale bar is 20 μm.

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,RH 探針在低濃度情況下標(biāo)記到HeLa 細(xì)胞的線粒體并研究了活HeLa 細(xì)胞線粒體的黏度變化.圖5 為通過(guò)FLIM 研究活HeLa細(xì)胞線粒體在長(zhǎng)時(shí)間光照下微環(huán)境的變化.圖5(a)所示的活HeLa 細(xì)胞線粒體內(nèi)探針的平均壽命為3.65 ns,計(jì)算可知活HeLa 細(xì)胞線粒體的黏度為66×10-3Pa·s,與文獻(xiàn)[33]報(bào)道相接近.此外,我們研究了HeLa 細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間激光照射刺激下,線粒體發(fā)生的融合和斷裂等形態(tài)變化,結(jié)果如圖5(b)—(h)紅色邊框標(biāo)記處所示.其中,圖5(b)所示的線粒體熒光壽命平均值為3.64 ns,圖5(h)中的線粒體熒光壽命平均值為3.61 ns,可得到線粒體的黏度由78×10-3Pa·s 增至131×10-3Pa·s,均與已有報(bào)道結(jié)果一致[27],證明探針RH 通過(guò)FLIM 定量成像線粒體微環(huán)境黏度結(jié)果的可靠性.

圖5 活HeLa 細(xì)胞線粒體FLIM (a) RH 探針(0.5 μmol/L)染色30 min 后標(biāo)記的HeLa 細(xì)胞;(b)—(h) 圖(a)中紅色邊框選中的區(qū)域放大的圖像,記錄了線粒體在光照刺激下30 min 時(shí)間內(nèi)發(fā)生的融合和斷裂變化.標(biāo)尺5 μmFig.5.Fluorescence lifetime imaging of mitochondria in living cells: (a) HeLa cells labeled after 30 min staining with RH probe(0.5 μmol/L);(b)-(h) the enlarged images of the region selected by the red border in panel (a),which record the fusion and fracture changes of mitochondria within 30 min under the stimulation of light.Scale bar is 5 μm.

由前面的共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (圖3(o)—(p)) 可知,RH 探針在高濃度 (2 μmol/L) 情況下標(biāo)記到活HeLa 細(xì)胞的核仁和線粒體.為了研究長(zhǎng)時(shí)間光照對(duì)核仁和線粒體的影響,我們使用CLSM 和FLIM 對(duì)活HeLa 細(xì)胞的核仁和線粒體同時(shí)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的成像研究,如圖6 所示.隨著激光光照時(shí)間的增加 (圖6(a)—(d)),定位到線粒體上的紅色熒光信號(hào)逐漸減弱,定位到核仁上的紅色熒光信號(hào)幾乎保持不變.可能是激光誘導(dǎo)線粒體膜電位發(fā)生變化,導(dǎo)致探針?lè)肿訌木€粒體脫離.接著,使用FLIM研究活HeLa 細(xì)胞的核仁和線粒體在長(zhǎng)時(shí)間光照下發(fā)生的熒光強(qiáng)度和熒光壽命變化,如圖6(e)—(h)所示,藍(lán)色區(qū)域?yàn)榫€粒體,淺綠色或紅色區(qū)域?yàn)楹巳?隨著激光光照時(shí)間的增加,線粒體和核仁分別發(fā)生不同的變化: 一方面,RH 探針標(biāo)記的線粒體所在的藍(lán)色區(qū)域逐漸減少,定位到的線粒體熒光信號(hào)逐漸減弱,這與前面共聚焦成像結(jié)果相一致;另一方面,RH 探針標(biāo)記的核仁以及周?chē)募?xì)胞核區(qū)域強(qiáng)度逐漸增加,淺藍(lán)色 (短壽命區(qū)域) 逐漸減少,綠色和橙紅色區(qū)域 (長(zhǎng)壽命區(qū)域) 逐漸增多.對(duì)應(yīng)地,探針定位于核仁平均壽命也從4.23 ns 增至4.32 ns.此外,對(duì)活HeLa 細(xì)胞的FLIM 成像進(jìn)行相圖分析(圖6(i)—(l))[34],發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)壽命區(qū)域處在相圖邊界上,對(duì)應(yīng)探針定位在細(xì)胞核仁區(qū)域,短壽命處于相圖內(nèi)部,對(duì)應(yīng)的探針定位于線粒體上,探針的熒光壽命符合雙指數(shù)衰減模式,二者所示的變化與熒光壽命圖像變化一致.

圖6 熒光壽命隨光照時(shí)間變化 (a)—(d) RH 探針(2 μmol/L)標(biāo)記的HeLa 細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間光照的共聚焦成像結(jié)果;(e)—(h) RH 探針(2 μmol/L)標(biāo)記HeLa 細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間光照的熒光壽命變化情況;(i)—(l)分別為圖(e)—(h)相應(yīng)的熒光壽命的相位圖,熒光信號(hào)數(shù)據(jù)落在一個(gè)以坐標(biāo)(0.5,0)為中心,0.5 為半徑的半圓軌跡上,其中 G 和S 分別為相位圖的橫縱坐標(biāo)(G=1/(ω2+τ2),S=ωτ/(ω2+τ2),ω 為激發(fā)光調(diào)制角頻率,τ 為熒光壽命)[34],坐標(biāo)(0,0)代表壽命為無(wú)窮大,坐標(biāo)(1,0)代表壽命為0;標(biāo)尺為10 μmFig.6.Fluorescence lifetime changes with illumination time: (a)-(d) Confocal imags of HeLa cells labeled with RH probe(2 μmol/L) under prolonged illumination;(e)-(h) the change in fluorescence lifetime of RH probe (2 μmol/L) labeled HeLa cells under prolonged illumination;(i)-(l) the phase diagram of the corresponding fluorescence lifetime of panels (e)-(h),respectively,and the fluorescence signal data falls on a semicircular trajectory with coordinates (0.5,0) as the center and 0.5 as the radius,where G and S are the horizontal and vertical coordinates of the phase diagram (G=1/(ω2+τ2),S=ωτ/(ω2+τ2),ω is the excitation light modulation angular frequency and τ is the fluorescence lifetime)[34],the coordinate (0,0) represents infinite lifetime,and the coordinate (1,0) represents 0 in lifetime;scale bar is 10 μm.

另外,還補(bǔ)充了RH 探針標(biāo)記活COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞線粒體和核仁的FLIM 成像,結(jié)果見(jiàn)圖7,再次驗(yàn)證RH 探針?lè)謩e靶向線粒體和核仁跟與其濃度有關(guān).如圖7(a),(b) 所示,RH 在低濃度(0.5 μmol/L)標(biāo)記到COS-7 細(xì)胞和ID8 細(xì)胞的線粒體,同時(shí)RH 標(biāo)記到COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞線粒體的平均熒光壽命分別為3.29 ns 和3.28 ns(圖7(i),(j)),跟標(biāo)記HeLa 線粒體時(shí)的熒光壽命有所差異,這可能為不同種類細(xì)胞的線粒體微環(huán)境差異導(dǎo)致.HeLa 細(xì)胞來(lái)源人的宮頸,對(duì)比COS-7細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞,三種細(xì)胞之間存在種屬和器官來(lái)源差異,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境存在一定的差異,從而導(dǎo)致了RH 在標(biāo)記HeLa 細(xì)胞與COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞線粒體時(shí)熒光壽命的差異.另外,如圖7(c),(d)所示,RH 在高濃度(2 μmol/L)標(biāo)記COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞的核仁和線粒體,圖中細(xì)胞內(nèi)橙紅色區(qū)域?yàn)镽H 標(biāo)記到的核仁結(jié)構(gòu),藍(lán)綠色區(qū)域?yàn)镽H標(biāo)記到的線粒體結(jié)構(gòu).圖7(k),(l)的相位圖也顯示RH 在高濃度的熒光壽命有兩個(gè)組分,藍(lán)色區(qū)域?yàn)榈蜔晒鈮勖M分,對(duì)應(yīng)RH 標(biāo)記到線粒體上,橙紅色區(qū)域?yàn)楦邿晒鈮勖M分,對(duì)應(yīng)RH 標(biāo)記到核仁上,其中RH 標(biāo)記到COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞核仁的熒光壽命分別為4.27 ns 和4.28 ns.由此可見(jiàn)RH 在不同細(xì)胞標(biāo)記線粒體和核仁的方式是一樣的.一方面,RH 因結(jié)構(gòu)上含有羅丹明基團(tuán)帶正電荷,因而能夠較為容易地標(biāo)記到線粒體上;另一方面,RH 結(jié)構(gòu)上含有疏水的芘基團(tuán),而核仁內(nèi)有一定的疏水空間,同時(shí)還含有帶負(fù)電荷RNA 結(jié)構(gòu),因而RH 能夠標(biāo)記到核仁上.RH 分別靶向線粒體和核仁由RH 的濃度介導(dǎo),在低濃度(0.5 μmol/L)時(shí)主要靶向線粒體,在高濃度 (2 μmol/L) 時(shí)同時(shí)標(biāo)記核仁和線粒體,標(biāo)記線粒體和核仁時(shí)探針的壽命存在較大差異,因而能夠很好地區(qū)分二者,為進(jìn)一步研究細(xì)胞在非穩(wěn)態(tài)過(guò)程中生理功能變化提供基礎(chǔ).

圖7 RH 探針標(biāo)記COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞的FLIM 成像 (a),(b) 分別為低濃度RH (0.5 μmol/L)標(biāo)記COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞線粒體的熒光壽命圖像;(c),(d) 分別為高濃度RH (2 μmol/L) 標(biāo)記COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞核仁的熒光壽命圖像;(e)—(h) 分別為圖(a)—(d)的熒光強(qiáng)度圖像;(i)—(l) 分別為對(duì)應(yīng)的熒光壽命圖像的相位圖Fig.7.Fluorescence lifetime imaging of COS-7 cells and ID-8 cells labeled by RH probe: (a),(b) With low concentration RH(0.5 μmol/L),fluorescence lifetime images of mitochondria of COS-7 cells and ID-8 cells labeled,respectively;(c),(d) with high concentration RH (2 μmol/L),fluorescence lifetime images of nucleolus of COS-7 cells and ID-8 cells labeled,respectively;(e)-(h) the fluorescence intensity image of panels (a)-(d);(i)-(l) the phase diagram of the corresponding fluorescence lifetime image.

為進(jìn)一步研究細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中核仁的動(dòng)力學(xué)變化,使用100 nmol/L 的紫杉醇誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡[35],CLSM 成像結(jié)果和FLIM 成像結(jié)果如圖8所示.相較于空白處理的HeLa 細(xì)胞(圖8(a)),紫杉醇處理過(guò)的HeLa 細(xì)胞(圖8(b))能夠更加明顯地觀察到核仁染色熒光.另外,隨著紫杉醇處理時(shí)間的增加,觀察到活HeLa 細(xì)胞的形態(tài)由梭形展開(kāi)狀態(tài)(圖8(b))過(guò)渡到橢圓形或圓形的收縮狀態(tài)(圖8(d)),說(shuō)明了紫杉醇誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡過(guò)程的發(fā)生.在紫杉醇誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡過(guò)程中,我們觀察到細(xì)胞內(nèi)的核仁位置的變化,如圖8(b)—(d)和圖8(j)—(l)白色箭頭所示.在正常HeLa 細(xì)胞內(nèi)(圖8(a)),核仁居于細(xì)胞核較為居中的位置;而紫杉醇處理過(guò)的HeLa 細(xì)胞,核仁向細(xì)胞核外移動(dòng)甚至進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中,如圖8(b)白色箭頭所示,另外還觀察到細(xì)胞表面的洞穿凹痕,如圖8(c)白色箭頭所示.Lieu 等[36]報(bào)道,紫杉醇的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果與其濃度和處理時(shí)間相關(guān),10—100 nmol/L 濃度范圍的紫杉醇可以抑制微管的組裝動(dòng)力學(xué),導(dǎo)致細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期中的G2/M 期;用60 nmol/L的紫杉醇處理1 h 或20 nmol/L 的紫杉醇處理12 h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.另外,FLIM 觀察到的HeLa細(xì)胞形態(tài)變化跟CLSM 成像系統(tǒng)的結(jié)果一致,如圖8(m)—(p)所示.同時(shí),在紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)RH 探針標(biāo)記HeLa 細(xì)胞核仁的平均壽命由4.19 ns (處理0.5 h,圖8(q)) 先增至4.38 ns (處理1 h,圖8(r))和4.47 ns (處理2 h,圖8(s)),最后降至4.42 ns (處理4 h,圖8(t)),反映了紫杉醇的作用效果與處理時(shí)間的相關(guān).在處理時(shí)間較短時(shí) (0.5 h),紫杉醇(100 nmol/L)積累在細(xì)胞微管上的量不足以抑制細(xì)胞分裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;隨著處理時(shí)間的增加(1 h),紫杉醇結(jié)合到微管的量可以抑制細(xì)胞分裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而且隨著處理時(shí)間的增加,更加容易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

圖8 紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的CLSM 成像圖像與FLIM 成像圖像 (a)空白對(duì)照;(b)—(d) 紫杉醇 (0.1 μmol/L) 分別預(yù)先處理0.5,1,2 h 后RH 探針 (2 μmol/L) 標(biāo)記的HeLa 細(xì)胞的共聚焦成像結(jié)果;(e)—(h) 對(duì)應(yīng)的明場(chǎng)圖像;(i)—(l) 紅色通道和明場(chǎng)通道的疊加結(jié)果;(m)—(p) 分別為紫杉醇 (0.1 μmol/L) 預(yù)先處理0.5,1,2,4 h 后,RH 探針 (2 μmol/L) 標(biāo)記的HeLa 細(xì)胞的熒光壽命圖像;(q)—(t) 相應(yīng)圖像的相位圖,標(biāo)尺10 μm.Fig.8.Laser confocal imaging images and fluorescence lifetime imaging images of paclitaxel-induced apoptosis: (a) As a blank control;(b)-(d) the confocal image of HeLa cells labeled with RH probe (2 μmol/L) after 0.5 and 1,2 hours of paclitaxel (0.1 μmol/L)pretreatment,respectively;(e)-(h) the corresponding bright field image,respectively;(i)—(l) the superposition result of red channel and bright field channel,respectively;(m)-(p) the fluorescence lifetime image of RH probe (2 μmol/L) labeled HeLa cells after pretreatment with paclitaxel (0.1 μmol/L) for 0.5,1,2,4 h,respectively;(q)-(t) phase diagram of the corresponding image,respectively,scale bar is 10 μm.

此外,我們還研究了秋水仙堿在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞微環(huán)境的變化[37],結(jié)果如圖9 所示.相較于空白處理的HeLa 細(xì)胞(圖8(a)),較低濃度(10 nmol/L)秋水仙堿處理的HeLa 細(xì)胞核仁染色熒光更加明顯(圖9(a)—(c)).RH 探針標(biāo)記于空白處理的HeLa 細(xì)胞核仁的平均熒光壽命為4.10 ns (圖9(j)),標(biāo)記于較低濃度秋水仙堿處理的HeLa 細(xì)胞核仁平均壽命為 4.34 ns (圖9(k)),這與100 nmol/L 的紫杉醇處理1 h 的結(jié)果相近;而較高濃度(100 nmol/L)處理的細(xì)胞則更容易發(fā)生凋亡(圖9(d)—(f)),探針標(biāo)記于HeLa 細(xì)胞核仁的平均壽命為4.47 ns (圖9(l)),這與100 nmol/L的紫杉醇處理2 h 結(jié)果相近.Paschke 等[38]報(bào)道,秋水仙堿在較低濃度(10 nmol/L)時(shí)會(huì)降低細(xì)胞的變形能力,限制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng);而在較高濃度(100 nmol/L)時(shí),作用機(jī)制跟紫杉醇的類似,與微管蛋白結(jié)合抑制細(xì)胞分裂,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

圖9 秋水仙堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡CLSM 成像圖像與FLIM 成像結(jié)果 (a)—(c) 10 nmol/L 和(d)—(f) 100 nmol/L 的秋水仙堿預(yù)先處理1 h 后,RH 探針(2 μmol/L)標(biāo)記的HeLa 細(xì)胞的共聚焦成像結(jié)果.(a),(d) RH 探針紅色通道圖像;(b),(e) 相應(yīng)的明場(chǎng)通道圖像;(c),(f) 相應(yīng)的紅色通道和明場(chǎng)通道疊加的結(jié)果;(g) 空白對(duì)照;(h),(i) 分別為10 nmol/L 和100 nmol/L 的秋水仙堿預(yù)先處理1 h 后,RH 探針 (2 μmol/L) 標(biāo)記HeLa 細(xì)胞的熒光壽命圖像;(j)—(l) 相應(yīng)熒光壽命圖像的相位圖,標(biāo)尺10 μmFig.9.Confocal laser imaging images and fluorescence lifetime imaging results of colchicine-induced apoptosis: (a)-(c) 10 nmol/L and (d)-(f) 100 nmol/L is respectively the confocal image of HeLa cells labeled with RH probe (2 μmol/L) after 1 h pre-treatment with colchicine.(a),(d) Red channel images of RH probe;(b),(e) the corresponding bright field channel images;(c),(f) the superposition result of the corresponding red channel and bright field channel;(g) a blank control;(h),(i) fluorescent lifetime image of HeLa cells labeled with RH probe (2 μmol/L) after pre-treatment with 10 nm and 100 nm colchicine for 1 h,respectively;(j)-(l) the phase diagram of the corresponding fluorescence lifetime image,respectively,scale bar is 10 μm.

4 結(jié)論

活細(xì)胞在受到激光光照、紫杉醇及秋水仙堿等不同刺激下發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),細(xì)胞形態(tài)及微環(huán)境發(fā)生相應(yīng)的變化,通過(guò)熒光壽命可獲得定量的成像與測(cè)量研究.本文選用具有紅色熒光的芘羅丹明探針RH 在不同條件下能夠分別靶向標(biāo)記活細(xì)胞的線粒體和核仁.我們使用Autodocking 軟件進(jìn)行生物計(jì)算模擬探針與DNA/RNA 的結(jié)合模式,得到RH 探針與DNA 只有一種結(jié)合方式,且結(jié)合能較高 (-5.25 eV),從而導(dǎo)致探針只是附著在DNA序列表面,與DNA 的結(jié)合力較弱;而RH 探針與RNA 有兩種結(jié)合構(gòu)型,結(jié)合能分別是-11.2 eV 和-11.62 eV,對(duì)應(yīng)探針的疏水基團(tuán)分別嵌入RNA 序列中的小溝和大溝中,與RNA 的結(jié)合力較強(qiáng).使用FLIM 技術(shù)監(jiān)測(cè)到活HeLa 細(xì)胞在光照刺激過(guò)程中發(fā)生的線粒體斷裂、融合形態(tài)變化,以及探針標(biāo)記線粒體的平均熒光壽命由3.65 ns 降低到3.61 ns,對(duì)應(yīng)線粒體的黏度由66×10-3Pa·s 增至131×10-3Pa·s.同時(shí),我們還補(bǔ)充了RH 探針標(biāo)記COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞線粒體和核仁的FLIM 成像,結(jié)果顯示RH 靶向標(biāo)記線粒體和核仁的情況與HeLa 細(xì)胞的類似,在低濃度(0.5 μmol/L)時(shí)主要靶向線粒體,在高濃度 (2 μmol/L)時(shí)同時(shí)標(biāo)記核仁和線粒體,標(biāo)記到COS-7 細(xì)胞和ID-8 細(xì)胞中的線粒體的平均壽命約為3.29 ns 和3.28 ns,比標(biāo)記到HeLa 細(xì)胞中線粒體的壽命略低,這可能為不同種類細(xì)胞的線粒體內(nèi)環(huán)境差異導(dǎo)致.另外,我們使用RH 探針在CLSM 成像和FLIM 成像可視化了活HeLa 細(xì)胞在激光光照、紫杉醇和秋水仙堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的核仁動(dòng)力學(xué)變化,觀察到活HeLa 細(xì)胞核仁在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的移動(dòng),RH 的平均熒光壽命發(fā)生變化: 光照時(shí)間從0 min 增至30 min,RH 標(biāo)記到HeLa 細(xì)胞核仁的平均壽命也從4.23 ns 增至4.32 ns,反映了長(zhǎng)時(shí)間激光照射引起HeLa 細(xì)胞核仁微環(huán)境的變化;100 nmol/L 的紫杉醇處理時(shí)間從0.5 h 增至4 h,探針標(biāo)記于HeLa 細(xì)胞核仁的平均壽命由4.19 ns,增至4.47 ns,最后降至4.42 ns,反映了紫杉醇處理不同時(shí)間誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡所引起的細(xì)胞核仁微環(huán)境差異;對(duì)比空白處理的HeLa 細(xì)胞,低濃度(10 nmol/L)秋水仙堿處理1 h 后,探針的平均壽命由4.10 ns增至4.34 ns,高濃度(100 nmol/L)秋水仙堿處理1 h 后,探針標(biāo)記于核仁的平均壽命增至4.47 ns,反映了不同濃度秋水仙堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所引起的細(xì)胞核仁微環(huán)境變化的差異.

以上激光光照、紫杉醇和秋水仙堿三種方式誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞損傷或凋亡,證明了在HeLa 細(xì)胞非穩(wěn)態(tài)情況下核仁和線粒體微環(huán)境的變化以及功能變化,為研究不同途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)過(guò)程以及核仁和線粒體功能障礙相關(guān)疾病研究提供了新的研究方法.