近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng)的研制*

鄔丹丹 潘力 周哲 付威威? 朱海龍 董月芳?

1) (中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所,醫(yī)學影像技術研究室,蘇州 215163)

2) (蘇州國科視清醫(yī)療科技有限公司,蘇州 215163)

近年來,小動物活體熒光成像系統(tǒng)被廣泛應用于生物醫(yī)學成像研究.但是,現有的熒光成像系統(tǒng)存在穿透深度有限、圖像信噪比低等缺點.因此,利用近紅外二區(qū)(near-infrared-II,NIR-II,900—1880 nm)熒光成像技術在生物組織中具有的低吸收、低散射和穿透深度深等優(yōu)點,研制出一套NIR-II 小動物活體熒光成像系統(tǒng),提出了一種熒光圖像增強校正方法,并設計生物組織模擬實驗和活體動物實驗測試該系統(tǒng)的性能和成像效果.實驗結果表明,該系統(tǒng)具有穿透深度深、信噪比高、靈敏度高等優(yōu)點.結合商用的吲哚菁綠試劑和聚集誘導發(fā)光染料,該系統(tǒng)可實時監(jiān)測小鼠體內的血管分布情況,并對深層組織器官進行持續(xù)監(jiān)測,實現活體小鼠清醒狀態(tài)下的動態(tài)監(jiān)測研究,有助于推動生物醫(yī)學成像領域的腫瘤研究和藥物開發(fā)研究等進入一個新階段.

1 引言

光學成像技術通過利用光線在生物組織內的傳播特性,實現對生物組織的實時監(jiān)測,具有無電離輻射、安全性高、可視化等優(yōu)勢.活體光學成像主要包括生物發(fā)光成像和熒光成像,其中生物發(fā)光是通過熒光素酶基因標記細胞或活體動物,利用其產生的蛋白酶與底物熒光素發(fā)生生物化學反應,產生光學信號;熒光成像是通過熒光蛋白、熒光染料、量子點及稀土納米粒子等進行標記,利用外界光源激發(fā)產生熒光信號.相比生物發(fā)光成像,熒光成像技術的標記能力和光學信號更強,可以實時監(jiān)測活體動物體內的基因和細胞變化,具有高分辨率、非侵入、操作簡單、成像直觀、無創(chuàng)等顯著優(yōu)點[1,2],廣泛應用于腫瘤研究、基因表達研究、藥物開發(fā)研究等.

傳統(tǒng)的熒光成像位于可見光波段(400—760 nm),此波段內生物組織存在嚴重的自身熒光,并且對光子的吸收和散射作用較強,導致熒光成像的信噪比和穿透深度較低(1—2 mm),難以獲取活體動物體內深層組織的生物信息[3].當熒光成像窗口擴展到近紅外一區(qū)(near-infrared-I,NIR-I,760—900 nm),生物組織對光的吸收和散射作用以及生物組織的自身熒光有所降低,提高了NIR-I 熒光成像的穿透深度,但是仍未滿足臨床應用需求[4].2009 年,Welsher 等[5]通過檢測“交換”單壁碳納米管的固有近紅外光致發(fā)光,首次實現了大于1000 nm的近紅外活體熒光成像.從此,近紅外二區(qū)(nearinfrared-II,NIR-II,900—1880 nm)活體熒光成像成為研究的一大熱點[6-8].與可見光和NIR-I 熒光成像相比,NIR-II 熒光成像由于光子波長更長,進一步抑制了光在生物組織內傳播時的吸收和散射作用,并且生物組織的自身熒光也隨著波長的增大顯著下降[9],因此NIR-II 熒光成像的深度大大提高、分辨率和信噪比也較高,更利于活體動物體內深層組織的生物信息監(jiān)測[10].

近年來,隨著熒光探針和成像儀器的不斷開發(fā)和改進,研究者們圍繞NIR-II 活體熒光成像在生物醫(yī)學成像領域進行了豐富的科學探索和應用研究,如美國國立衛(wèi)生研究院陳小元教授團隊[11]開發(fā)了一種多重NIR-II 活體成像系統(tǒng),利用具有顯著抑制的光子散射和零自發(fā)熒光的NIR-II 探針實現轉移性腫瘤的可視化;浙江大學錢駿教授團隊與舜宇光學公司合作開發(fā)了一種正置NIR-II 熒光顯微成像系統(tǒng),已應用于宮頸癌治療[12]等領域.本文基于NIR-II 熒光成像的原理機制,自主研制了一套NIR-II 熒光成像系統(tǒng).利用商用的吲哚菁綠(indocyanine green,ICG) 試劑和聚集誘導發(fā)光(aggregation-induced emission,AIE) 染料,通過小鼠實驗實際驗證該系統(tǒng)的熒光成像效果.結果表明,該系統(tǒng)具有穿透深度深、信噪比高、靈敏度高的優(yōu)點,可以實時監(jiān)測小鼠體內的血管網絡分布,對小鼠的深層組織器官進行長期監(jiān)測,實現活體小鼠清醒狀態(tài)下的動態(tài)監(jiān)測研究.

2 NIR-II 活體熒光成像

2.1 熒光成像的原理機制

熒光是一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現象,如圖1 所示,熒光物質受到外界光源激發(fā),當光子的能量為分子中某兩個能級間的能量差時,熒光物質的核外電子會吸收能量,從基態(tài)的最低振動能級躍遷到能量較高的高能級(第一或第二激發(fā)單重態(tài)中各個不同振動-轉動能級),此時電子處于不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài),會通過內部轉換和振動弛豫等非輻射躍遷的方式快速降落至激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級,隨后通過輻射躍遷的方式從最低振動能級返回基態(tài),以光子形式釋放能量,發(fā)射出熒光信號.熒光信號在生物組織內經過吸收和散射作用后,被光學探測器捕獲,經過放大處理后傳輸到電腦中,得到熒光圖像,這就是熒光成像的原理.

圖1 熒光成像示意圖Fig.1.Schematic diagram of fluorescence imaging.

顯然,熒光成像的關鍵點在于熒光物質和熒光信號的采集及處理.通常,利用光學探測器將光信號轉換為便于存儲和處理的電信號,實現熒光信號的采集及處理.傳統(tǒng)的光學探測器是硅基探測器,具有制造工藝成熟和可靠性高等優(yōu)點[13],但是靈敏度較差,并且硅的帶隙能量(1.124 eV)導致硅基探測器的響應波長通常不高于1100 nm,局限在可見光和NIR-I 波段.為了擴展光學探測器的響應波長,近年來出現了使用飛秒激光等技術制備的黑硅探測器[14-16]、窄帶隙半導體合金碲鎘汞(mercury cadmium telluride,HgCdTe)探測器[17]以及短波紅外銦鎵砷(indium gallium arsenide,InGaAs)探測器.其中,黑硅探測器在紅外波段的響應度仍然未能滿足應用需求,HgCdTe 探測器的制造成本高,需要工作在低溫條件下[18],并且HgCdTe 材料對人體的毒性很大,因此應用局限性較大;InGaAs探測器的響應波長范圍為900—1700 nm,具有工藝成熟、高量子效率、低功耗、低成本等優(yōu)點,廣泛應用于生物醫(yī)學成像、空間遙感、天文等領域[19,20],可以實現高分辨率、高靈敏度的NIR-II 熒光成像.

2.2 NIR-II 熒光成像的獨特優(yōu)勢

生物組織是一種混濁介質,光子在其中傳播時同時存在著吸收和散射作用,如圖2 所示.光在生物組織內的吸收和散射作用會導致能量損耗,衰減熒光信號,其中,光的吸收決定了熒光信號的強度能否被探測到,而光的散射會降低熒光圖像的清晰度[21];同時,生物組織的自身熒光也會影響到熒光圖像的信噪比和分辨率.因此,為了獲取高質量的熒光成像效果,應盡可能降低激發(fā)光在生物組織內的吸收和散射作用,以及可忽略生物組織的自身熒光.

圖2 生物組織的吸收和散射作用Fig.2.Absorption and scattering of biological tissues.

生物組織中光的吸收主要是由于水、血液中的脫氧血紅蛋白(deoxyhemoglobin,Hb)和氧合血紅蛋白(oxyhemoglobin,HbO2)、黑色素[22]等導致.在NIR-II 波段,除1400—1500 nm 處存在的吸收峰外,其他波段內的吸收均較小,對熒光信號的衰減小.血紅蛋白在可見光區(qū)域存在較高的吸收峰,在NIR-II 波段內的光吸收較小,更利于熒光信號在生物組織內的傳播[1].在400—1700 nm 范圍內,隨著波長的增大,不同生物組織(如腦組織、皮下組織、肌肉)的散射系數呈現出指數性降低的趨勢[1],因此生物組織在在NIR-II 波段內的散射作用普遍較小,幾乎可以忽略不計.此外,生物組織的自身熒光主要集中在可見光區(qū)域和NIR-I 波段,在NIR-II 波段,生物組織的自身熒光較小,可以忽略不計[9].綜上,相比可見光區(qū)域和NIR-I 波段,生物組織在NIR-II 波段的吸收和散射作用較小,并且可以忽略自身熒光,因此NIR-II 熒光成像具有更大的穿透深度、更高的圖像信噪比,更利于生物組織的深度成像檢測.

3 NIR-II 熒光成像系統(tǒng)

3.1 系統(tǒng)的設計搭建

基于熒光成像的原理機制,采用反射型成像方式搭建NIR-II 熒光成像系統(tǒng),其結構示意圖如圖3(a)所示,活體小動物被固定在恒溫臺(維持小動物生命體征)上,通過麻醉面罩對其進行持續(xù)麻醉,小動物體內已注射熒光試劑或染料,受到外界激發(fā)光源照射后發(fā)射出熒光信號.熒光信號經過生物組織的吸收和散射作用后到達組織表面,再經過發(fā)射濾光片和鏡頭后被探測器接收,最后傳入電腦,處理得到熒光圖像.

圖3 NIR-II 熒光成像系統(tǒng) (a) 系統(tǒng)結構示意圖;(b) 系統(tǒng)三維效果圖Fig.3.NIR-II fluorescence imaging system: (a) Schematic diagram of system;(b) 3D design of system.

本系統(tǒng)采用InGaAs 探測器采集熒光信號,該探測器為Raptor Photonics 公司生產的深度制冷近紅外探測器,光譜響應范圍為900—1700 nm,制冷溫度可達-80 ℃,圖像像素數量為640×512 pixel,像元尺寸為15 μm,成像速度最快可達97 frames/s.激發(fā)光源采用808 nm 高功率半導體激光器(功率0—15 W 可調,功率穩(wěn)定性rms ＜3 %),為了使激光器出射的光斑尺寸可以覆蓋小鼠,通過勻化鏡頭對其進行擴束和均勻處理,處理后的均勻光斑直徑超過10 cm,可滿足小鼠成像尺寸要求.成像鏡頭采用優(yōu)質低畸變短波紅外鏡頭,其焦距為40 mm,光圈范圍為F2.8—F16,在900—1400 nm 波段內透射率超過94%.發(fā)射濾光片采用進口優(yōu)質長波通濾光片,截止深度OD 值大于5,用于消除激發(fā)光源對發(fā)射熒光信號的干擾.最終設計搭建的NIR-II熒光成像系統(tǒng)的三維效果圖如圖3(b)所示.

熒光探針作為熒光成像的關鍵要素,以熒光物質作為指示劑,通常由識別基團、熒光基團及連接臂組成.目前,NIR-II 熒光探針可以分為無機和有機兩大類,與無機熒光探針相比,有機熒光探針具有生物相容性高、毒性小、光學特性可調等優(yōu)點.有機熒光探針主要包括小分子熒光探針、聚集誘導發(fā)光納米顆粒和共軛聚合物,其中小分子熒光探針具有高靈敏度、低毒性、較高的臨床轉化潛力等顯著優(yōu)點[23].比如,NIR-I 小分子熒光探針I(yè)CG 已經通過美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的認證,被廣泛應用于臨床研究.近年來,研究者們發(fā)現ICG 具有較強的NIR-II 拖尾熒光發(fā)射,為NIR-II 熒光成像的臨床應用提供了新的研究方向[24].此外,為解決有機熒光團常發(fā)生的聚集熒光猝滅(aggregation-caused quenching,ACQ)問題,2001 年,唐本忠院士團隊[25]提出了AIE 的概念,此后AIE 分子的設計和開發(fā)成為研究的一大熱點.相比傳統(tǒng)的熒光染料,AIE 熒光染料具有高亮度、光穩(wěn)定性強、生物安全性高等優(yōu)點.近年來,可用于NIR-II 熒光成像的AIE 染料也逐漸被開發(fā)出來[26].因此,本系統(tǒng)采用具有代表性的商用的ICG 試劑(USP 標準品,CAS NO.3599-32-4)和AIE 染料(AIE1010 熒光納米顆粒)進行成像研究(對其他染料同樣適用,如稀土材料、金屬納米團簇探針等,已于系統(tǒng)前期研制過程中進行相關成像研究).

3.2 熒光信號采集與處理

熒光成像系統(tǒng)采集的原始熒光圖像的對比度往往不高,并且由于光源照射不均勻、熱效應、探測器暗電流噪聲和讀出噪聲等可能存在霧狀噪聲及背景噪聲,這些噪聲會影響熒光圖像的成像質量并干擾熒光信號的觀測效果.為了增強灰度圖像顯示效果,去除圖像噪聲并盡可能保留有效熒光信號,提出了一種熒光圖像增強和校正方法,具體流程如圖4(a)所示.實際應用中,通常采用自動色階算法對熒光圖像進行對比度拉伸,增強灰度圖像中的微弱熒光信號,但是圖像中存在較高灰度值的有效熒光信號時,采用同一比例拉伸圖像可能會導致過度增強現象,損失部分有效熒光信號.因此,基于自動色階算法提出自適應對比度拉伸算法,其簡要步驟如下.

2.1 患者一般情況及手術方式 兩組患者一般情況及合并手術方式如表1所示。骶骨固定術組年齡、絕經概率及術前SUI概率顯著低于改良全盆底重建組，差異有統(tǒng)計學意義，骶骨固定術組手術前3個月內有性生活概率顯著高于改良全盆底重建組，骶骨固定術組中71例患者合并有陰道前及(或)后壁脫垂，改良全盆底重建組中72例合并有陰道前及(或)后壁脫垂，均給予相應的修補手術治療。骶骨固定組中，41例SUI患者中36例接受了TVT-O手術；改良全盆底重建組中，53例SUI患者中37例接受了TVT-O手術。見表1。

圖4 熒光圖像處理 (a) 流程圖;(b) 原始低熒光圖像;(c) 原始高熒光圖像;(d) 圖(b)的增強圖像;(e) 圖(c)的增強圖像Fig.4.Fluorescence image processing: (a) Flow chart;(b) original low fluorescence image;(c) original high fluorescence image;(d) enhanced image of Fig.(b);(e) enhanced image of Fig.(c).

1)對原始熒光圖像進行直方圖統(tǒng)計,計算得到各灰度級的像素個數及累積分布函數;通過預設的截斷比例對直方圖進行左右截斷,剔除相應的圖像像素;統(tǒng)計截斷后圖像數據中的最小和最大灰度值,分別作為黑場閾值Gmin和白場閾值Gmax.

2)當熒光圖像中不存在較高灰度值的有效熒光信號時(圖像最大灰度值Max 不超過灰度級×0.6 時認為不存在),將不超過Gmin的像素灰度值置為0,其他像素灰度值拉伸至[0,M]范圍,M為圖像灰度級.

3)當熒光圖像中存在較高灰度值的有效熒光信號時(圖像最大灰度值Max 大于灰度級×0.6 時認為存在),通過迭代閾值法計算得到原始熒光圖像的最優(yōu)閾值Gt,將其與白場閾值Gmax的均值設為C1,并定義C2=Gt×1.5,C2在(Gmin,Gmax)范圍內時將C2作為中間閾值Gmid;反之,Gt在(Gmin,Gmax)范圍內時將C1作為Gmid,Gt未在(Gmin,Gmax)范圍內時將Gmin與Gmax的均值作為Gmid.定義Vmid=M×(Gmid-Gmin)/(Gmax-Gmin),適當放大Vmid后作為Gmid的映射灰度值Gpoint,根據經驗將放大系數定為1.2.將不超過Gmin的像素灰度值置為0,(Gmin,Gmid]范圍內的像素灰度值拉伸至(0,Gpoint]范圍,(Gmid,Gmax)范圍內的像素灰度值拉伸至(Gpoint,M)范圍,不小于Gmax的像素灰度值設置為M.

針對不同灰度分布的熒光圖像進行自適應對比度拉伸,可以較好地增強灰度圖像中的微弱熒光信號,提升灰度圖像中熒光信號的整體亮度,并避免由于過度拉伸導致部分熒光信號過度增強的情況,優(yōu)化熒光信號觀測效果.此外,為了去除熒光圖像中的背景噪聲,通常在當前曝光時間下采集暗背景圖像,將原始熒光圖像與之相減實現暗背景快速扣除.實際應用中,為了提高圖像處理效率,取最優(yōu)閾值Gt的一半作為背景值dark,以扣除圖像背景,并保留低熒光信號.

當熒光圖像中不存在較高灰度值的有效熒光信號時,將背景值dark 融入拉伸算法模型,此時圖像處理的數學模型如(1)式所示,其中max(Gmin,dark)是Gmin和dark 中的較大值:

當熒光圖像中存在較高灰度值的有效熒光信號時,將背景值dark 融入拉伸算法模型,此時圖像處理的數學模型如(2)式所示:

銳化度s的取值需合理,以免圖像輪廓產生過沖或者圖像銳化效果不明顯.其中,二維函數g(x,y)的拉普拉斯算子表示為

采用上述熒光增強和校正方法分別對如圖4(b),(c)所示的原始熒光圖像進行處理,獲得如圖4(d),(e)所示的熒光增強圖像.可以明顯看出,處理后的圖像更有利于熒光信號觀測,背景更為干凈,并去除了霧狀噪聲.對處理前后的熒光圖像進行量化評價指標分析,結果見表1.不難得出,本文提出的熒光增強和校正方法可以大幅提高熒光圖像的清晰度,突出熒光信號,提供更優(yōu)的顯示效果.

表1 圖像量化評價指標對比Table 1.Comparison of image quantitative evaluation indicators.

3.3 系統(tǒng)的性能測試

3.3.1 系統(tǒng)的穿透深度

為了測試本系統(tǒng)的穿透深度,設計了生物組織模擬實驗.因為Intralipid 與生物組織具有相似的吸收和散射特性,所以采用Intralipid 溶液制備凝膠,用于模擬生物組織,具體制備方法如下: 利用Intralipid 溶液(體積比0.6%)和瓊脂糖粉末(質量比0.4%)配制出混合溶液,持續(xù)加熱使之充分混合,然后倒入定制的圓柱形玻璃器皿中,等待其冷卻凝固成凝膠.如圖5(a)所示,一根毛細玻璃管(內徑1 mm)傾斜固定于玻璃器皿中,傾斜角度固定時,通過統(tǒng)計熒光圖像中水平方向上可觀測的像素數量,結合定制孔位高度差和玻璃器皿的內徑及像素數量,可計算得到穿透深度.實物圖如圖5(b)所示,玻璃管兩端連接軟管,通過蠕動泵控制軟管內液體流動,管內液體采用濃度1 mg/mL 的商用ICG 試劑.使用本系統(tǒng)拍攝Intralipid 凝膠,拍攝過程中可采用黑色啞光膠布遮擋玻璃器皿反光面,以避免影響熒光成像結果.采集得到的熒光圖像經過偽彩處理后如圖5(c)所示,此時,相機曝光時間300 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長為1000 nm,激光器功率為8 W.通過統(tǒng)計可觀測的像素數量,計算得到穿透深度約10.88 mm.實驗結果表明,本系統(tǒng)的穿透深度可以達到10 mm以上,可滿足小動物活體熒光成像的應用需求.

圖5 系統(tǒng)的穿透深度測試 (a) 示意圖;(b) 實物圖;(c)偽彩圖像Fig.5.Penetration depth testing of the system: (a) Schematic diagram;(b) physical diagram;(c) pseudo color image.

3.3.2 系統(tǒng)的信噪比

通過計算信噪比(signal to noise ratio,SNR)來評價系統(tǒng)的性能,SNR 定義為目標信號均值與背景標準差的比值,計算公式為

3.3.3 系統(tǒng)的靈敏度

為了測試本系統(tǒng)的成像靈敏度,針對ICG 試劑設置梯度實驗,對12 組不同濃度的ICG 試劑及空位進行成像測試.其中,第1 組ICG 試劑的質量濃度為1 mg/mL,并將該濃度持續(xù)進行對半稀釋以作為第2 組至最后一組的試劑濃度.將多組試劑等劑量(200 μL)放置于標準96 孔板內,各組試劑間隔兩個孔位,以避免試劑間成像影響.熒光成像時,相機曝光時間800 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長為900 nm 和1000 nm,激光器功率密度約40 mW/cm2.由圖6 可知,在當前成像狀態(tài)下,本系統(tǒng)可探測到質量濃度為0.00048828125 mg/mL的ICG 試劑.該實驗驗證了本系統(tǒng)具有高靈敏度的優(yōu)點.

圖6 ICG 梯度實驗 (a) 12 組的熒光信號強度分析;(b) 最后4 組的熒光信號強度分析Fig.6.ICG gradient experiment: (a) Analysis of fluorescence signal intensity in 12 groups;(b) analysis of fluorescence signal intensity for the last 4 groups.

4 動物實驗

4.1 實驗對象和方法

本實驗使用的小鼠為SPF 級別的BALB/C裸鼠和KM 小鼠,購買自斯貝福(蘇州)生物技術有限公司,6—8 周齡.使用KM 小鼠成像時,為避免小鼠毛發(fā)對熒光成像結果造成干擾,需利用剃毛膏在小鼠腹部清理出觀測區(qū)域,如圖7 所示.剃毛后將小鼠靜置一段時間,等待其生理狀態(tài)穩(wěn)定后,對其尾部靜脈注射200 μL 質量濃度為1 mg/mL的ICG 試劑/AIE 染料.注射完成后,盡快將小鼠固定在系統(tǒng)載物臺上,并調整系統(tǒng)參數對其進行成像.成像過程中,對小鼠進行持續(xù)麻醉,并可通過黑色膠帶固定小鼠四肢,以優(yōu)化成像效果.熒光成像時,激光器功率應盡可能低(由于光纖傳輸等造成的功率損耗,本系統(tǒng)實測功率密度不超過65 mW/cm2,遠低于激光產品的安全GB 7247.1—2012 所規(guī)定的最大允許照射量330 mW/cm2),以避免對被測活體的本能行為產生影響.實驗過程中對小鼠的操作符合《實驗動物管理條例》的相關要求及動物倫理學.

圖7 脫毛小鼠Fig.7.Depilatory mouse.

4.2 實驗結果及分析

4.2.1 血管分布監(jiān)測

對脫毛小鼠尾部靜脈注射200 μL 質量濃度為1 mg/mL 的ICG 試劑,注射結束后,采用本系統(tǒng)對小鼠進行熒光成像,可觀測到小鼠體內的血管分布情況,如圖8(a)所示,此時,相機曝光時間12 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長為900 nm和1000 nm,激光器功率為8 W.圖8(a)為相機采集的原始熒光圖像,采用基于本系統(tǒng)提出的熒光增強校正算法對其進行處理,得到如圖8(b)所示的增強熒光圖像.對圖8(a),(b)進行感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)選取,如圖8(c)所示,并分別對圖8(a),(b)進行ROI 信背比分析,得到圖8(d),(e).可以看出,增強處理后熒光圖像的信背比有了明顯提升,增強圖像更為突出了血管,特別是細小血管,有利于血管分布情況的成像監(jiān)測.

圖8 熒光成像 (a) 原始熒光圖像;(b) 增強熒光圖像;(c) ROI 選取示意圖;(d) 圖(a)的ROI 信背比分析;(e) 圖(b)的ROI 信背比分析Fig.8.Fluorescence imaging: (a) Original fluorescence image;(b) enhanced fluorescence image;(c) schematic diagram of ROI selection;(d) ROI analysis of signal-to-back ratio in Fig.(a);(e) ROI analysis of signal-to-back ratio in Fig.(b).

4.2.2 組織器官持續(xù)監(jiān)測

對上述脫毛小鼠進行血管分布監(jiān)測后12 min左右,血管內熒光信號已基本消失(出現漂白現象),ICG 分布到小鼠各組織器官,并被肝臟攝取、代謝和排泄進入小腸,此時采用本系統(tǒng)可以明顯觀測到小鼠的胃腸道蠕動,如圖9 所示.此時,相機曝光時間12 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長為900 nm 和1000 nm,激光器功率為5 W.實驗結果表明,本系統(tǒng)可以對小鼠腸道中的分布進行無創(chuàng)、實時、可視化追蹤,實現對組織器官的持續(xù)監(jiān)測,為小鼠胃腸道蠕動的健康狀態(tài)、胃腸動力障礙的診斷和評估、藥物對腸梗阻的影響等研究提供有力的參考.

圖9 組織器官熒光成像持續(xù)監(jiān)測結果Fig.9.Continuous monitoring results of tissue and organ fluorescence imaging.

4.2.3 清醒狀態(tài)動態(tài)監(jiān)測

對裸鼠尾部靜脈注射200 μL 質量濃度為1 mg/mL 的AIE 染料,注射結束一段時間后,將裸鼠放入高透明亞克力盒中,并在亞克力盒內放入一只未注射熒光染料/試劑的空白鼠,作為對照組,在無需麻醉的條件下,采用本系統(tǒng)實時動態(tài)監(jiān)測兩只裸鼠整體的熒光成像情況.如圖10(a)所示,為本系統(tǒng)采集的原始熒光圖像,此時,考慮到裸鼠的自然運動狀態(tài)(移動、晃頭等),相機曝光時間設置為9.8 ms,鏡頭光圈F2.8、景深約20 mm (基本可覆蓋活動裸鼠待觀測區(qū)域厚度),發(fā)射濾光片波長為1000 nm,激光器功率為8 W.如圖10(b)所示,為偽彩處理后的熒光圖像.可以明顯看出,空白鼠無明顯熒光反應,AIE 染料裸鼠仍存在較強的熒光反應.實驗結果表明,本系統(tǒng)可以較快的成像幀率動態(tài)監(jiān)測活體動物的熒光成像情況,實現活體動物在清醒狀態(tài)下自由移動時的實時成像監(jiān)測研究,為活體動物的生物醫(yī)學成像研究提供非侵入、無需麻醉甚至安樂死的科學儀器.

圖10 活體動物動態(tài)監(jiān)測結果 (a) 原始熒光圖像;(b) 偽彩增強圖像Fig.10.Dynamic monitoring results of living animals: (a) Original fluorescence image;(b) pseudo color enhanced image.

5 結論

利用NIR-II 在生物組織中具有較大的穿透深度、較高的成像信噪比和靈敏度等特點,自主研制開發(fā)了NIR-II 小動物活體熒光成像系統(tǒng),采集得到高分辨率的熒光圖像并處理分析,提出了一種熒光增強和校正方法提高熒光圖像的信背比和清晰度.該系統(tǒng)具有較高的成像靈敏度、較快的成像速度及較高的系統(tǒng)集成度(與市面上同類商業(yè)產品性能相似),可同時進行2—3 只小鼠的成像實驗,有助于提高科研成像效率.與商用的ICG 試劑和AIE 染料等結合使用,該系統(tǒng)可以對小鼠進行血管分布情況監(jiān)測、深層組織器官監(jiān)測以及清醒狀態(tài)下的動態(tài)監(jiān)測研究等,可用于實時觀察基因在活體動物體內的表達、腫瘤的發(fā)展過程、藥物的治療效果等,有望在腫瘤疾病的早期診斷與治療、藥物研制開發(fā)等領域內廣泛應用.此外,將結合顯微成像或內窺成像進行系統(tǒng)跨尺度研究,并結合光聲/超聲成像模塊進行多模態(tài)成像研究等.