免疫熒光技術(shù)在近視相關(guān)生物標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

趙宇輝 畢宏生 孫華躍 李文慧 田慶梅 盧秀珍

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科與視光醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院 山東省眼病防治研究院山東省中西醫(yī)結(jié)合眼病防治重點實驗室，山東濟(jì)南 250002；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014

免疫熒光（immunofluorescence，IF）技術(shù)亦稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種技術(shù)；它基于抗原、抗體相互反應(yīng)的原理，將已知的抗原或抗體用熒光基團(tuán)（熒光素）標(biāo)記，再將這種已標(biāo)記的抗原或抗體與細(xì)胞或組織內(nèi)目標(biāo)抗原或抗體結(jié)合，形成熒光復(fù)合體被特定波長的光激發(fā)，從而被熒光顯微鏡捕捉[1-3]。IF 已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌病毒和寄生蟲的鑒別診斷、部分疾病免疫學(xué)機(jī)制的研究、器官移植的鑒定、抗原組織定位等方面。近視是屈光不正中最常見的一種疾病，是導(dǎo)致低視力的主要原因，嚴(yán)重?fù)p害人們的視覺質(zhì)量。近年來，IF 在近視研究領(lǐng)域中發(fā)揮了巨大的作用。本文就近年來IF 在近視相關(guān)的生物標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以供研究參考。

1 IF 概述

1.1 IF 的組成和基本原理

IF 主要由直接IF、間接IF、多重IF 和補(bǔ)體參與的IF 等組成。直接IF 是指特異性抗體標(biāo)記熒光素后直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物而被鑒定的方法[1]。但該方法抗體均需熒光素標(biāo)記，其敏感性較低，應(yīng)用相對有限。間接IF 是指特異性抗體與目標(biāo)抗原（一抗）結(jié)合后，再加入熒光素標(biāo)記的二抗，結(jié)合形成免疫復(fù)合物而被鑒定的方法。間接IF 因其有較好的敏感性和特異性，在臨床和實驗研究中應(yīng)用廣泛[4]。多重IF 則需進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?，此法可同時檢測多種生物標(biāo)志物[5]。補(bǔ)體參與的IF 是指利用補(bǔ)體反應(yīng)，形成了抗原-抗體-補(bǔ)體熒光復(fù)合物，熒光顯微鏡下所見到的發(fā)出熒光的部分即是抗原所在的部位。

1.2 IF 的發(fā)展歷程

IF 的雛形，最早可追溯到1897 年，俄國科學(xué)家Metchnikoff 用毒素作為示蹤劑，研究破傷風(fēng)毒素在雞組織中的定位[6]。人們開始嘗試追蹤可溶性抗原和抗體在動物體內(nèi)的分布。1941 年Coons 等[7]首次在肺組織中使用熒光素標(biāo)記了抗肺炎球菌抗體，這代表著IF的誕生。20 世紀(jì)60—90 年代，IF 被風(fēng)濕科、眼科、骨科等學(xué)科引入并廣泛應(yīng)用。近年來，隨著其他領(lǐng)域科技的快速發(fā)展，IF 與探針化學(xué)、電子計算機(jī)和激光共聚焦顯微鏡等結(jié)合，使IF 更加靈敏；時間分辨熒光免疫分析法和熒光偏振免疫分析法等IF 分析方法的出現(xiàn)，使得IF 的定量檢測更加準(zhǔn)確[8]。IF 已成為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病診斷的重要手段。

2 IF 在近視相關(guān)生物標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用

2.1 直接IF 在近視相關(guān)生物標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用

一項研究對形覺剝奪性近視（form-deprivation myopia，F(xiàn)DM）大鼠予以0.010%和0.025%的阿托品滴眼治療，并應(yīng)用直接IF 檢測其視網(wǎng)膜和鞏膜中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白的表達(dá)[9]。實驗選用HIF-1α 熒光抗體為染色抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)2 個劑量組HIF-1α 蛋白表達(dá)量均有降低趨勢，低濃度阿托品可能通過減少視網(wǎng)膜和鞏膜上HIF-1α 等基因及蛋白表達(dá)量來降低鞏膜延展性，延緩近視進(jìn)展。此外，有研究采用直接IF 對視網(wǎng)膜靜脈阻塞小鼠視網(wǎng)膜缺氧區(qū)域進(jìn)行可視化，腹腔注射缺氧探針哌莫硝唑，凝集素?zé)晒饪贵w等抗體對視網(wǎng)膜靜脈缺氧細(xì)胞進(jìn)行染色[10]。前述研究表明，直接IF 是探究眼部缺氧的有效手段，為近視缺氧的研究提供了新思路。

在該裝置的內(nèi)部，包含一個蓄電池、抽氣泵、氣體傳感器、氣體凹槽通道、信息處理系統(tǒng)等，因為SF6氣體的密度大約是空氣的五倍，因此空氣經(jīng)過長凹槽時SF6會通過長凹槽下沉到隔離板下方，隔離板下方的氣體傳感器會檢測GIS設(shè)備內(nèi)的氣體的濃度通過控制面板將其顯示在顯示屏上。其內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖一(b)所示。

2.2 間接IF 在近視相關(guān)生物標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用

間接IF 因其特異性較好受到許多研究者們的青睞。一項研究對正常小鼠眼組織進(jìn)行了間接IF 檢測，腫瘤壞死因子受體超家族成員TNFRSF21 的抗體作為一抗，和綴合熒光染料的二抗一起孵育[11]。結(jié)果顯示TNFRSF21 在小鼠眼中強(qiáng)烈表達(dá)，對高度近視具有致病性。Tian 等[12]將抗視紫紅質(zhì)抗體作為一抗來檢測Glra2 基因敲除小鼠視網(wǎng)膜和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)的原代視網(wǎng)膜細(xì)胞中視紫紅質(zhì)的水平，Glra2 被鑒定為高度近視新的致病基因。另有研究應(yīng)用間接IF 驗證PPEF2 基因在FDM 小鼠視網(wǎng)膜、293T 細(xì)胞和ARPE-19 細(xì)胞的表達(dá)情況和其與高度近視表型的關(guān)系[13]。該研究使用PPEF2 抗體、山羊抗小鼠IgG 孵育，結(jié)果明確了PPEF2 在小鼠視網(wǎng)膜的位置，并證明了PPEF2 是高度近視的致病基因。因此，IF 在鑒定近視及其他眼病致病基因方面表現(xiàn)出巨大作用，為近視基因類標(biāo)志物的檢測提供了科學(xué)方法。

I 型膠原蛋白（type Ⅰcollagen，Col-I）是鞏膜外基質(zhì)的主要成分，是影響鞏膜重塑的重要因子。Liu 等[19]利用間接IF 檢測Col-Ⅰ、α-平滑肌肌動蛋白和紐蛋白在FDM 豚鼠脈絡(luò)膜上的表達(dá)情況，利用倒置熒光顯微鏡觀察IF 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)tRF-22 可通過調(diào)節(jié)脈絡(luò)膜血管功能在近視進(jìn)展中發(fā)揮保護(hù)作用。有研究使用miRNA-29a 模擬物和其抑制劑轉(zhuǎn)染人胎兒鞏膜成纖維細(xì)胞，應(yīng)用間接IF 檢測熱休克蛋白47、Col-ⅠA1、Smad3 蛋白等標(biāo)志物的表達(dá)[20]。結(jié)果表明，miRNA-29a模擬物抑制了熱休克蛋白47、Col-Ⅰ等蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了鞏膜成纖維細(xì)胞的凋亡，這表明miRNA-29a會促進(jìn)鞏膜重塑、加快近視發(fā)展，為治療近視的潛在治療靶點研究提供了新見解。一項研究使用抗Col-Ⅰ抗體和熒光標(biāo)記的二抗對經(jīng)Hsa-miR-142-3p 模擬劑和抑制劑轉(zhuǎn)染的人鞏膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行間接IF 染色[21]。結(jié)果表明，Hsa-miR-142-3p 可以降低Col-Ⅰ的表達(dá)水平，可能是控制高度近視的靶點。此外，Hsiao等[22]應(yīng)用Col-Ⅰ抗體作為一抗，檢測經(jīng)紫外線A 模擬日光照射后的人鞏膜成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)紫外線A 可以減少TGF-β 誘導(dǎo)的Col-Ⅰ的產(chǎn)生從而影響近視發(fā)展。一項研究予以人鞏膜成纖維細(xì)胞660 nm 光照干預(yù)，并應(yīng)用間接IF 檢測HIF-1α 和Col-ⅠA1 蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)660 nm 光照會下調(diào)HIF-1α 表達(dá)并促進(jìn)膠原蛋白合成，且不會造成光損傷[23]。有研究應(yīng)用間接IF 檢測缺氧培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細(xì)胞中IL-6 的表達(dá)，該研究發(fā)現(xiàn)鞏膜成纖維細(xì)胞在缺氧條件下過量分泌IL-6，并間接抑制鞏膜重塑中鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)變薄的過程[24]。

因此，IF 可以被應(yīng)用于檢測眼組織Col-Ⅰ和其相關(guān)蛋白的表達(dá)，為探究影響鞏膜重塑和近視進(jìn)展的因素提供了潛在途徑。

有研究應(yīng)用IF 檢測透鏡誘導(dǎo)性近視（lensinduced myopia，LIM）和FDM 豚鼠模型視網(wǎng)膜黑視蛋白（melanopsin，MLP）的表達(dá)[14]。該研究采用抗MLP 一抗和熒光顯色二抗共同孵育，運用激光共聚焦顯微鏡觀察圖像，結(jié)果表明MLP 與近視的發(fā)展存在潛在關(guān)聯(lián)。另有研究向LIM 豚鼠玻璃體腔注射MLP 抗體，使用間接IF 來檢測視網(wǎng)膜MLP 的表達(dá)[15]。結(jié)果表明，MLP 主要表達(dá)在豚鼠光敏感視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表面和樹突上，對LIM 豚鼠近視發(fā)展有抑制作用。這表明IF 有助于近視發(fā)展過程中有關(guān)蛋白標(biāo)志物的作用研究，為近視治療提供新靶點。

雙調(diào)蛋白（amphiregulin，APG）是近視重要的標(biāo)志物。間接IF 被一項研究用來檢測FDM 豚鼠鞏膜中APG 的相對表達(dá)量，觀察圖像發(fā)現(xiàn)APG 在FDM 發(fā)展過程中表達(dá)上調(diào)[16]。有研究對原代鞏膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行間接IF 染色，抗APG、波形蛋白和角蛋白抗體作為一抗參與孵育[17]。該研究發(fā)現(xiàn)，APG 通過ERK1/2-MMP2途徑參與鞏膜重塑，是近視的監(jiān)測性標(biāo)志物。有研究者向LIM 豚鼠玻璃體腔注射APG 抗體，兔抗APG 抗體等抗體作為一抗，山羊抗兔IgG 等作為染色二抗檢測豚鼠視網(wǎng)膜APG 的表達(dá)[18]。該研究發(fā)現(xiàn)，APG 可以抑制眼軸的增長，延緩近視過程中鞏膜變薄，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究APG 在鞏膜重塑和近視發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了基礎(chǔ)。

在樣品的測試方面，由于氧化石墨烯元件的濕敏性能的特性，因此為了達(dá)到較好的測試效果則在最為合理室溫25攝氏度的環(huán)境下進(jìn)行測試，其測試共測試9種化學(xué)溶液，將氧化石墨烯元件置于上方且環(huán)境密閉，由此得出測試結(jié)果，其測試結(jié)果如圖表2。

高等職業(yè)院校辦學(xué)主要面向地方產(chǎn)業(yè)一線，以學(xué)生獲得職業(yè)技能作為主要培養(yǎng)目標(biāo)。國務(wù)院印發(fā)的《關(guān)于深化體制機(jī)制改革 加快實施創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展戰(zhàn)略的若干意見》，明確了技術(shù)創(chuàng)新市場導(dǎo)向機(jī)制、成果轉(zhuǎn)化激勵政策等，推進(jìn)了高職院校科研工作的發(fā)展。高職院校依托校企合作辦學(xué)，深化產(chǎn)教融合，推進(jìn)科研成果轉(zhuǎn)化為社會生產(chǎn)力，對地方產(chǎn)業(yè)起到積極的推動作用[1]。然而，我國高職院校科研成果的轉(zhuǎn)化率很低，很多科研成果未得到推廣。本文對于高職院?？蒲谐晒茝V的現(xiàn)狀、限制因素進(jìn)行分析，并研究對應(yīng)策略，提升高職院?？蒲谐晒D(zhuǎn)化率。

間接IF 在近視藥物療效研究中有巨大的潛在作用。邱宇等[28]向FDM 豚鼠玻璃體內(nèi)注射抗新生血管藥康柏西普，兔抗鼠酪氨酸羥化酶多克隆抗體作為一抗進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)康柏西普會使FDM 豚鼠視網(wǎng)膜中的酪氨酸羥化酶水平降低，并導(dǎo)致豚鼠眼軸延長、屈光度升高。此外，有研究利用間接IF 定位和檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 的表達(dá)，并研究中藥駐景丸加減方的療效[29]。FDM 豚鼠被灌胃駐景丸加減方，采用抗Iba1 抗體作為一抗進(jìn)行IF 試驗，通過熒光掃描顯微鏡攝像系統(tǒng)采集圖像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥干預(yù)組豚鼠視網(wǎng)膜Iba1 表達(dá)較近視模型組顯著降低，駐景丸加減方可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制視網(wǎng)膜血管病變，從而起到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。這些研究表明，IF為中西藥物治療近視的機(jī)制和效果研究提供了潛在方法，有利于近視藥物的研發(fā)。

連接蛋白36 參與形成間隙連接，是細(xì)胞間信息交換的重要媒介。有研究采用間接IF 評估FDM 和LIM 豚鼠視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層和外叢狀層中連接蛋白36和其磷酸化的量[25]。該研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MD 豚鼠連接蛋白36 的數(shù)量和其磷酸化水平降低，而LIM 則不受影響，這表明FDM 豚鼠視網(wǎng)膜中連接蛋白36 可能通過介導(dǎo)細(xì)胞間偶聯(lián)參與了近視發(fā)展。間接IF 使得人們探究細(xì)胞間的偶聯(lián)與近視的相關(guān)性成為可能。一項研究運用間接IF 檢測LIM 小鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)元型一氧化氮合酶和S-亞硝基化蛋白的表達(dá)[26]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LIM 豚鼠視網(wǎng)膜中這兩種蛋白的表達(dá)較正常組降低，一氧化氮介導(dǎo)的非經(jīng)典蛋白S-亞硝基化修飾可能在近視調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。另有研究應(yīng)用間接IF 檢測了LIM 豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮中mTORC1 蛋白復(fù)合體的激活情況[27]。激活的mTORC1 與抗磷酸化P70S6激酶抗體結(jié)合，被二抗發(fā)出的熒光顯示位置。結(jié)果表明，mTORC1 可促進(jìn)眼軸伸長、脈絡(luò)膜變薄和視乳頭周圍脈絡(luò)膜萎縮，從而促進(jìn)近視發(fā)展，mTORC1 是近視治療手段研究的潛在新目標(biāo)。

間接IF 也被用來檢測鈣離子在眼組織的表達(dá)。Li 等[30]描述了一種監(jiān)測FDM 小鼠視網(wǎng)膜水平細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平變化的新型鈣熒光系統(tǒng)，抗鈣結(jié)合蛋白抗體為一抗，驢抗小鼠Alexa Fluor 555 為二抗孵育，運用GCaMP6+鈣結(jié)合蛋白+/鈣結(jié)合蛋白+共免疫染色模式來跟蹤GCaMP6+的數(shù)量和水平細(xì)胞的比例，這為檢測人眼組織中Ca2+及其他離子表達(dá)水平提供了新的方法和可能性。

2.3 多重IF 在近視相關(guān)生物標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用

多重IF 是一種利用辣根過氧化酶對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的新興技術(shù)。有研究者用M-視蛋白和S-視蛋白多克隆抗體標(biāo)記小鼠視網(wǎng)膜整體，使用5 色多重?zé)晒饷庖呷旧噭┖腥旧M(jìn)行熒光染色，發(fā)現(xiàn)M-視蛋白過表達(dá)會破壞正常的屈光發(fā)育并導(dǎo)致近視，而M-視蛋白的缺乏可以保護(hù)小鼠免受近視，并促使小鼠出現(xiàn)遠(yuǎn)視趨勢[31]。多重IF 使得復(fù)雜細(xì)胞群體和組織微環(huán)境的分析更為準(zhǔn)確和全面，為近視發(fā)病機(jī)制和治療方案的研究開辟了新途徑。

傳統(tǒng)媒體要講新聞?wù)鎸?、傳播倫理，自媒體同樣要講表達(dá)真實、傳播倫理，揣著明白裝糊涂，故意制造謠言或者故意誤導(dǎo)公眾，甚至搞成“網(wǎng)絡(luò)黑惡勢力”橫行霸道、行敲詐勒索之實，同樣要承擔(dān)法律責(zé)任。

3 小結(jié)和展望

IF 可以鑒別近視相關(guān)的細(xì)胞和高度近視的致病基因，檢測近視相關(guān)目標(biāo)蛋白和離子在眼組織和細(xì)胞中的分布和表達(dá)情況，探測近視發(fā)展中眼組織的缺氧程度和鞏膜重塑的程度，探究近視藥物在體內(nèi)的機(jī)制和效果等。因此IF 在近視研究領(lǐng)域中扮演著重要角色，是極具效益的方法和手段。IF 也具有一定局限性。隨著時間的推移熒光信號會減少或消失，過多非特異性抗體的結(jié)合可能無法準(zhǔn)確定位免疫復(fù)合物，對顯微鏡設(shè)備要求較高。總的來說，IF 可以幫助人們進(jìn)一步探究近視及其他眼病的機(jī)制和治療方案，是近視研究領(lǐng)域不可或缺的手段。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，IF得到不斷的完善，今后該技術(shù)將被更廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)更多領(lǐng)域之中。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。