面部激素依賴性皮炎患者外周血單一核細(xì)胞SOCS1、CKLF1的表達(dá)及祛風(fēng)清熱涼血方的療效

成 娟,陳 宏,劉德華,馮 爽

(1.天津市人民醫(yī)院皮膚科,天津 300121;2.晉城市人民醫(yī)院皮膚科)

面部激素依賴性皮炎(FCDD)是由于長(zhǎng)期在面部不當(dāng)使用外用糖皮質(zhì)激素而引起的慢性炎性反應(yīng)疾病,具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確,但近期研究發(fā)現(xiàn)T輔助細(xì)胞(Th)亞群分化失衡所引起的皮膚免疫功能異常與FCDD發(fā)病關(guān)系密切,而細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)與趨化素樣因子1(CKLF1)在Th細(xì)胞免疫平衡中扮演了重要的角色。為了進(jìn)一步探索SOCS1與CKLF1的作用和臨床意義,本文研究了SOCS1與CKLF1 mRNA在FCDD患者PBMC中的表達(dá),并觀察祛風(fēng)清熱涼血方治療熱毒熾盛證FCDD患者的療效及對(duì)兩種細(xì)胞因子表達(dá)變化的影響,進(jìn)而為祛風(fēng)清熱涼血方治療FCDD機(jī)制的闡明提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年3～12月天津市人民醫(yī)院確診為FCDD且中醫(yī)辨證為熱毒熾盛證患者50例為FCDD組,其中男8例,女42例,年齡18～62歲,平均(36.14 ±11.02)歲,對(duì)照組為同期正常體檢的40例正常人,其中男13例,女27例,年齡18～64歲,平均(41.15±14.47)歲。兩組性別、年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FCDD組口服祛風(fēng)清熱涼血方顆粒劑(方劑主要藥物:生地黃、生石膏、水牛角、玄參、白鮮皮、知母、荊芥、防風(fēng)、牛蒡子、金銀花、連翹、白茅根、黃芩、黃柏、苦參、升麻、白芍、甘草,廣東一方制藥廠生產(chǎn)),每日1劑,沖服?？诜幬锿瑫r(shí)給予0.9 %生理鹽水冷敷面部,外用玉澤精華乳,2次/d,檢測(cè)患者首診及治療2 w(隨訪到33例患者)、4 w(隨訪到19例患者)時(shí)PBMC SOCS1 mRNA、CKLF1 mRNA 的表達(dá)情況。診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)2009年中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)皮膚科分會(huì)美容專業(yè)組提出的《激素依賴性皮炎診治指南》與第四版《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》及文獻(xiàn)[1]制定,納入標(biāo)準(zhǔn)為熱毒熾盛證FCDD患者。排除標(biāo)準(zhǔn):1個(gè)月內(nèi)系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、抗生素、免疫抑制劑、抗組胺藥治療;合并(真菌、細(xì)菌、病毒)感染者;肝腎功能損害或其他系統(tǒng)疾病者;患有過(guò)敏性疾病、銀屑病等影響試驗(yàn)結(jié)果的疾病;妊娠及哺乳期婦女;對(duì)方中草藥成分過(guò)敏者;未能按時(shí)隨診,不能按時(shí)服藥或不能耐受藥物不良反應(yīng)的患者。評(píng)分依據(jù)近年FCDD相關(guān)文獻(xiàn)[2-3],采用4級(jí)評(píng)分法對(duì)患者的主觀、客觀指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)尼莫地平法計(jì)算公式計(jì)算療效指數(shù),痊愈:皮損幾乎完全消退,自覺(jué)癥狀消失,療效指數(shù)>90%;顯效:皮損明顯消退,自覺(jué)癥狀有明顯的減輕,60%<療效指數(shù)≤90%;有效:部分皮損消退,自覺(jué)癥狀有所減輕,20% <療效指數(shù)≤60%;無(wú)效:極少部分皮損消退,自覺(jué)癥狀變化不明顯甚至加重,療效指數(shù)≤20%。總有效率=(痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意并與患者簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑:RNAisoplus、RT-PCR試劑盒、引物(內(nèi)參GAPDH、SOCS1、CKLF1,且引物終濃度均為10 μmol/L)(大連寶生物工程有限公司);焦炭酸二乙酯(DEPC)(大連寶生物工程有限公司);實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)ELGAPURELAB Ultra(英國(guó) ELGA Lab Water公司);小型高速冷凍離心機(jī)5415D、臺(tái)式高速大容量離心機(jī)5804R、核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)eppendorf公司);實(shí)C-1000型熒光定量 PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3方法:本試驗(yàn)所有樣本均抽取2 ml外周靜脈血,EDTA抗凝,-80℃低溫凍存。參照試劑盒操作說(shuō)明提取單個(gè)樣本總RNA,總RNA濃度和純度的測(cè)定,總RNA完整性的檢測(cè),逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR,PCR 產(chǎn)物電泳?；虻南鄬?duì)定量用ΔCT表示(Ct值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),ΔCT=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,mRNA表達(dá)量與ΔCt值呈反比關(guān)系)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1SOCS1、CKLF1 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定:在PCR的擴(kuò)增曲線中每條反應(yīng)管的擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚,標(biāo)準(zhǔn)的基線平直或略微下降,無(wú)明顯的上揚(yáng)趨勢(shì),平行性好,表明其擴(kuò)增效率相近,試驗(yàn)重復(fù)性好。

2.2FCDD組與對(duì)照組外周血SOCS1、CKLF1的表達(dá):FCDD患者 SOCS1、CKLF1 mRNA的ΔCT 值均小于對(duì)照組,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),ΔCT 值與 mRNA表達(dá)量呈反比關(guān)系,因此FCDD組外周血中SOCS1、CKLF1 mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);患者SOCS1、CKLF1 mRNA的表達(dá)經(jīng)祛風(fēng)清熱涼血方治療2 w時(shí)較治療前、治療4 w時(shí)較治療2 w時(shí)明顯降低,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 FCDD患者與正常對(duì)照組及祛風(fēng)清熱涼血方治療2 w、4 w時(shí)SOCS1、CKLF1相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3祛風(fēng)清熱涼血方治療對(duì)SOCS1、CKLF1 mRNA表達(dá)的影響:2 w時(shí)與治療前、治療4 w時(shí)與治療2 w比較,SOCS1、CKLF1 mRNA均顯著下降,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見(jiàn)表1。

2.4祛風(fēng)清熱涼血方治療FCDD患者4 w時(shí)和2 w時(shí)療效比較:祛風(fēng)清熱涼血方對(duì)FCDD有較好的治療作用,并且遠(yuǎn)期療效更佳。見(jiàn)表2。

表2 祛風(fēng)清熱涼血方治療FCDD患者4 w時(shí)和2 w時(shí)療效比較[n(%)]

3 討論

近年來(lái)Th細(xì)胞比例失衡在激素依賴性皮炎發(fā)生中的作用引起了眾多學(xué)者關(guān)注,而研究人員大多認(rèn)為FCDD屬變態(tài)反應(yīng)類疾病,Th細(xì)胞分化失衡可能是FCDD發(fā)病基礎(chǔ)[4]。SOCS1通過(guò)作用于JAK/STAT信號(hào)途徑在抑制Thl細(xì)胞增殖的同時(shí)促進(jìn)Th2細(xì)胞分化[5],在Th1/Th2分化失衡所引發(fā)的各種變態(tài)反應(yīng)性疾病中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SOCS1表達(dá)的增高是調(diào)節(jié)Th1和Th2相互平衡的重要機(jī)制,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOCS1在Th1細(xì)胞表達(dá)是在Th2細(xì)胞的5倍[6],這提示SOCS1可能參與了Th1/Th2分化的調(diào)節(jié)并且與免疫紊亂導(dǎo)致的疾病有關(guān)。有研究顯示,IL-6 可以通過(guò)活化STAT3上調(diào)CD4+T細(xì)胞SOCS1的表達(dá),高表達(dá)的SOCS1對(duì)IFN-γ的分泌抑制,說(shuō)明SOCS1主要是抑制IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)途徑,從而對(duì) Th1 細(xì)胞分化起到抑制,引起以Th2占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2免疫失衡[7]。研究發(fā)現(xiàn)SOCS1可以通過(guò)抑制IFN-γ而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[8]。綜上SOCS1可能是通過(guò)抑制IFN-γ/STAT1信號(hào)通路調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞增殖,同時(shí)對(duì)Th1細(xì)胞分化起到抑制,引起以Th2占優(yōu)勢(shì)的免疫失衡。本研究發(fā)現(xiàn)SOCS1在FCDD患者外周血中表達(dá)水平增高,表明SOCS1可能參與了FCDD的發(fā)病過(guò)程,而目前并無(wú)對(duì)SOCS1在FCDD患者中的報(bào)道。

CKLF1是趨化因子家族的一員,對(duì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等有廣譜趨化活性,并促進(jìn)炎性反應(yīng)效應(yīng),參與免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)性疾病病理過(guò)程[9]。研究發(fā)現(xiàn)CCR4與其配體CKLF1的結(jié)合趨使Th2細(xì)胞從血液移至皮膚組織使Th1/Th2細(xì)胞亞群失衡[10],而IL-4水平表達(dá)升高時(shí)SOCS1又可以通過(guò)干擾IFN-γ信號(hào)誘導(dǎo)的STAT1磷酸化過(guò)程,抑制Th1細(xì)胞分化[11],從而達(dá)到協(xié)同作用,與本研究得出的SOCS1與CKLF1 mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)一致,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與樣本含量有關(guān)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性鼻炎患者鼻黏膜CKLF1與CCR4表達(dá)量較正常人明顯增高,CKLF1的表達(dá)與Th2細(xì)胞呈顯著正相關(guān),同時(shí)CKLF1表達(dá)與鼻腔分泌物涂片及下鼻甲黏膜刮片嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)也呈顯著正相關(guān)性,說(shuō)明CKLF1可能在變應(yīng)性鼻炎嗜酸性粒細(xì)胞與Th2細(xì)胞的活化及浸潤(rùn)中起到了重要作用,使過(guò)敏性鼻炎患者鼻黏膜局部CD4+T淋巴細(xì)胞主要向Th2分化,出現(xiàn)以Th2細(xì)胞表達(dá)升高而導(dǎo)致的Th2與Th1比例失調(diào)[12]。本研究顯示,推測(cè)CKLF1可能通過(guò)與Th2細(xì)胞表面的CCR4受體結(jié)合,使Th2細(xì)胞過(guò)度趨集活化導(dǎo)致Th1/Th2失調(diào),同時(shí)CKLF1可能通過(guò)嗜酸性粒細(xì)胞表面的CCR4或其他受體,參與其嗜酸性粒細(xì)胞活化從而影響FCDD的發(fā)病,而目前并無(wú)對(duì)CKLF1在FCDD患者中的報(bào)道。

祛風(fēng)清熱涼血方主要作用于熱毒熾盛證的FCDD患者,中醫(yī)認(rèn)為激素類藥物藥性多屬辛溫、燥熱之品,長(zhǎng)期外用可導(dǎo)致藥物毒邪侵犯肌膚,久之郁而化熱,使顏面部血熱瘀毒,故面部出現(xiàn)紅斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張、灼熱、瘙癢、皮膚變薄等。本研究結(jié)果表明推測(cè)祛風(fēng)清熱涼血方可能通過(guò)抑制SOCS1,CKLF1的表達(dá),影響Th17、Th2的分化進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群功能的平衡狀態(tài),在FCDD中起到免疫調(diào)節(jié)作用。Th17細(xì)胞主要分泌的促炎因子IL-17可以促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)對(duì)Th2免疫應(yīng)答具有正調(diào)節(jié)作用,祛風(fēng)清熱涼血方可能通過(guò)下調(diào)SOCS1的高表達(dá)提高Th1細(xì)胞的表達(dá),減少Th17細(xì)胞分泌 IL-17,在一定程度上減弱對(duì)Th2細(xì)胞的正調(diào)控作用,從而糾正Th細(xì)胞亞群失衡,另一方面祛風(fēng)清熱涼血方可能抑制了CCR4與其配體CKLF1結(jié)合的相互作用而產(chǎn)生抗炎效應(yīng),調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的過(guò)度趨集活化恢復(fù)Th1/Th2平衡,減輕了FCDD的炎性反應(yīng),發(fā)揮免疫抑制作用。通過(guò)對(duì)各單味藥的現(xiàn)代藥理研究,本方的作用可能為抗炎、抑制過(guò)敏、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),但中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)整體觀念研究問(wèn)題,祛風(fēng)清熱涼血方療效確切,但其治療作用并非是通過(guò)對(duì)各單味藥物的藥理作用疊加而成,其具體作用機(jī)制還未明了,有待進(jìn)一步研究[13-15]。