甲基化PAX1在宮頸癌篩查和預(yù)后評估中的臨床應(yīng)用

劉 靜

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤婦科,安徽 蚌埠 233000)

宮頸癌被認為是影響女性生育能力的重要疾病,其發(fā)病率極高。宮頸癌是一種危害性極大的惡性腫瘤,在發(fā)展中國家和地區(qū)的發(fā)病率和死亡率均高于其他癌癥,排名第四位。近10年來歐美主要國家采取的宮頸癌初篩、陰道鏡檢查和組織病理學(xué)檢查三步法顯著降低了宮頸癌的死亡率[1]。而且人乳頭瘤病毒(HPV)預(yù)防疫苗的使用也取得了顯著的效果,進一步減少了宮頸癌的發(fā)病率。雖然宮頸癌的診斷和治療取得了一定的進展,但它仍然是我國女性生命安全的潛在威脅之一。2022年宮頸癌新增11.93萬例,死亡3.19萬例,根據(jù)國家癌癥中心公布的數(shù)據(jù),宮頸癌呈年輕化趨勢,目前我國宮頸癌初篩方案是細胞學(xué)和高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測單獨或聯(lián)合檢測。近年來,液基薄層細胞學(xué)檢查(TCT)的應(yīng)用越來越廣泛,它不僅提高了細胞學(xué)檢查的精度,而且還能夠更有效地檢測到未明顯的非典型鱗狀上皮細胞[2],盡管目前全球范圍內(nèi)的宮頸癌篩查方法學(xué)依舊采用巴氏涂片(TBS),但液基薄層細胞學(xué)檢查的應(yīng)用也越來越廣泛,它可能會提高檢測的靈敏度,從而更好地預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。由于細胞學(xué)診斷的準確率受到50%～70%的影響,由于每位細胞病理師的個體差異,導(dǎo)致他們的準確率往往會受到影響,從而使得子宮頸癌和更嚴重的疾病的發(fā)現(xiàn)率更高,因此,許多醫(yī)院會采取措施來減少這種漏檢的情況,如通過陰道鏡和活檢來確定疾病的類型。美國陰道鏡與宮頸病理學(xué)會建議,當發(fā)現(xiàn)有低度磷狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)等病理改變時,應(yīng)盡快采取陰道鏡檢查,以確定病理的程度以及是否存在不典型的病理。當細胞學(xué)檢驗顯示ASCUS,則應(yīng)該考慮對HR-HPV感染的檢測,并在半年之內(nèi)接受細胞學(xué)檢驗。若HPV呈陽性,則應(yīng)該接受陰道鏡檢查,若未能得出準確的診斷,則應(yīng)該及時前往醫(yī)院接受宮頸癌細胞學(xué)檢查。研究發(fā)現(xiàn),超過九成的女性都曾被HPV病毒所侵襲,但其中絕大多數(shù)只是暫時性的,未必會發(fā)展成癌癥。其中,HR-HPV類型有八種,即16、18、31、33、35、45、52、58,其中HPV16和HPV18的陽性率高達76%,研究表明,HPV的長期感染會導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。然而,陰道鏡并不能確定是否感染HPV。在這種方法中,高危型非HPV16/18型別感染者可能會出現(xiàn)ASCUS或更高的類型。隨著中國政府采取措施,將HPV感染的風(fēng)險降到最低,但這種做法仍然導(dǎo)致許多女性因HPV感染引發(fā)的焦慮,從而導(dǎo)致她們不斷地尋找治療方案,從而增加了對于醫(yī)療資源的消耗和經(jīng)濟壓力。根據(jù)流行病學(xué)研究,許多女性一生中都曾經(jīng)感染過HPV,但只有10%的人會持續(xù)感染,進而轉(zhuǎn)化成宮頸癌。這說明宮頸癌的形成與許多原因有關(guān),如基因變異和遺傳性易感突變,應(yīng)該盡力采取措施來防止宮頸癌的進一步惡變[3]。近期的全球范圍內(nèi)的臨床試驗表明,子宮頸癌基因的甲基化水平高度增加會導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生,特別是PAX1配對盒基因1的甲基化水平增加會導(dǎo)致子宮頸鱗癌的發(fā)生。許多實踐結(jié)果表明,PAX1基因甲基化水平的檢測可以作為多種預(yù)防措施的一部分,因此,本研究旨在探索PAX1基因甲基化水平對于宮頸病變的早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)防乃至早期治療的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2021年1月～2021年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受治療的150例HPV感染患者為研究對象,根據(jù)疾病類型和FIGO的臨床評估標準將他們劃分成四組:對照組48例,低級別上皮內(nèi)瘤樣變組38例,高級別上皮內(nèi)瘤樣變(HGCIN)組35例和癌變(ICC)組29例。對照組的平均年齡為(35.6±2.1)歲,LGCIN組的平均年齡為(38.5±2.1)歲,HGCIN組的平均年齡為(37.7±1.4)歲,ICC組的平均年齡為(37.2±2.5)歲。四組患者的一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標準:①年齡21歲以上女性;②有性生活史;③深入了解研究流程,已簽署ICF,并且完成了所有相關(guān)手續(xù);④經(jīng)過多種檢測方法,包括HR-HPV、TCT和PAX1基因甲基化,取得了良好的結(jié)果。排除標準:①對于那些曾患有宮頸癌前期病變或其他女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的患者,建議進行治療以改善病情;②臨床標本項目缺失;③已接種過HPV疫苗者;④孕產(chǎn)婦及哺乳期女性;⑤已行子宮全切術(shù)。

1.2方法

1.2.1宮頸標本采集:患者取截石位,以常規(guī)消毒、鋪巾,取出宮頸病變部位細胞制備宮頸刮片,然后使用標準的消毒劑和清潔劑來清潔病變區(qū)域。之后,醫(yī)生會在陰道鏡下行宮頸病變處活檢,并對其進行病理學(xué)檢測。最后,通過HPV檢測將樣本放置在低溫環(huán)境中。經(jīng)過精心的宮頸刮片和PAX1病理學(xué)檢查,可以準確檢測ACKPAX1基因的甲基化水平。

1.2.2宮頸DNA提取、化學(xué)修飾與擴增:分別提取出宮頸DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后安排進行PAX1基因轉(zhuǎn)錄(參照德國Qiagen公司生產(chǎn)試劑盒說明書),PAX1基因外側(cè)上游引物、外側(cè)下游引物:5′-AAGTTGATTTAGGGTTTGGGG-3′、5′-ACCCAGCTCATCCACACTCCC-3′。PAX1基因上游引物、下游引物:5′-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3′、5′-AAATACCCRAGACTAAACGC-3′。使用生物素來檢測引物5′末端。

1.2.3焦磷酸DNA測序:根據(jù)焦磷酸測序儀的甲基化標準,可以制作出單鏈DNA模板,并對其進行測序。目的基因用引物(5′-GGAGGTAGGTTTTGGAG-3′)測PAX1基因9個胞嘧啶、磷酸、鳥嘌呤,經(jīng)過PAX1基因測序可以準確地反映出每一個樣本基因在特定檢測位點上的甲基化程度。通過使用焦磷酸測序技術(shù)可以精確測定 9 個特定的靶基因的甲基化水平。該試劑盒包含內(nèi)部 DNA。在樣本分析中,通過觀察每個位點的甲基化水平來衡量它在內(nèi)部數(shù)據(jù)集上的分布情況,這種方法可以用來估算每個位點的甲基化程度。

1.3觀察指標:通過4組組織檢查,研究HPV感染的概率以及PAX1基因甲基化的程度;同時通過宮頸刮片檢查,評估PAX1基因甲基化的程度;最后通過跟蹤觀察,探究四組患者的預(yù)后。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS20.0軟件進行t、χ2檢驗與方差分析。

2 結(jié)果

2.1四組宮頸組織中HPV陽性率與PAX1基因甲基化發(fā)生率比較:通過觀察四組組織樣本,可以看出HPV陽性率和PAX1基因甲基化的情況有所不同。經(jīng)過四組組織的研究,HPV陽性率和PAX1基因甲基化水平各組間差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 四組病變組織中HPV陽性率與 PAX1 基因甲基化發(fā)生率比較[n(%)]

2.2四組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1基因甲基化水平比較:通過四組宮頸刮片檢查,發(fā)現(xiàn)PAX1基因在組織細胞內(nèi)的甲基化水平存在顯著差異(P<0.05)。經(jīng)過四組宮頸刮片檢查及組織分析,發(fā)現(xiàn)PAX1基因甲基化水平存在顯著的變化,其變化程度具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而癌變組的PAX1基因的甲基化水平則要遠遠超過正常組、低級別組及高級別組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 四組宮頸刮片檢查PAX1基因在組織樣本甲基化程度

3 討論

在臨床實踐中,宮頸癌的發(fā)現(xiàn)通常需要數(shù)年或數(shù)10年的時間。在這段時間中宮頸癌的初期表現(xiàn)通常并不突出,直到它的嚴重程度增強才會被診斷出來。根據(jù)過去的研究,宮頸癌變進程涉及許多遺傳和調(diào)節(jié)基因機制,當中DNA甲基化變化尤為突出[4]。這種變化會引起基因調(diào)控遺傳的突變,從而影響基因功能,并有助于宮頸癌的形成和惡化。在宮頸癌患者體內(nèi),65%～95%的樣本都會出現(xiàn)DNA甲基化變化。因而,基因甲基化技術(shù)可以被用來對宮頸脫落細胞和宮頸組織進行活體檢查,從而幫助醫(yī)生更準確地識別和預(yù)防宮頸癌[5]。

隨著最新的診斷技術(shù)、細胞學(xué)研究的進步以及HPV的大規(guī)模應(yīng)用,宮頸癌的早期癥狀已經(jīng)得到了有效的檢測與治療,從而大大減少了宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)率。根據(jù)統(tǒng)計分析,感染HPV的人并不總是會患上癌癥,這暗示著可能存在其他潛在的危險因素,可能會加速宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。隨著基因和蛋白質(zhì)水平的變化,一種新的、具有特異性的檢測技術(shù)出現(xiàn)了。最新的研究顯示,癌癥患者的基因表達異?？赡軙λ麄兊慕】翟斐蓢乐氐奈：?包括影響細胞的增殖和分裂;此外,異常的甲基化也有可能導(dǎo)致抑制癌癥的基因的表達,進而促進腫瘤的形成。根據(jù)最新的研究結(jié)果,PAX1基因的甲基化水平顯著升高[6]。這種變化與宮頸癌的發(fā)病機制密切相關(guān),而且宮頸癌患者的脫落細胞也能夠發(fā)現(xiàn)這種甲基化的存在。最新的研究發(fā)現(xiàn),PAX1基因的陽性甲基化水平可以作為宮頸癌的重要指示因素,它可以幫助醫(yī)生更準確地識別宮頸癌的類型以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況,從而為宮頸癌的早期診斷提供依據(jù)。當前許多研究都集中于定性檢測PAX1基因的甲基化狀態(tài),但這種方法很難準確地量化和評估這一狀態(tài)。

根據(jù)過去的研究,PAX1基因的甲基化能夠提高宮頸癌的早期識別能力,研究表明,通過PAX1基因的甲基化能夠更精細的檢測脫落細胞以及活體組織,甚至能夠替代50%的陰道鏡檢查[7]。研究表明PAX1基因甲基化的水平能夠作為宮頸癌的一種有效的預(yù)防措施,它能夠有效地將CIN2病變與正常組織的差異降低到0.66,而將CIN3病變的差異降低到0.77,將CIN3病變的差距縮小到0.92,并且能夠有效地降低ROC曲線的下降幅度,從而提高宮頸癌的預(yù)防效果,這種方法的診斷效果非常好。

研究發(fā)現(xiàn),結(jié)合細胞學(xué)和病毒學(xué)的雙重技術(shù),構(gòu)建一個完善的宮頸癌篩查體系,能夠有效降低宮頸癌的發(fā)生概率。相比于傳統(tǒng)的陰道鏡檢測,這種雙重技術(shù)更具有靈活性和準確性,能夠有效減少患者的就醫(yī)次數(shù),從而極大地改善宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療效果。

在中國的宮頸癌患者中,ASC-US和非16/18型HR-HPV均呈陽性,這種情況非常普遍,并且需要進行多次的跟蹤治療,這將消耗大量的資源。宮頸癌仍然是一個嚴重的健康問題,由于人口眾多、區(qū)域性醫(yī)療資源匱乏、衛(wèi)生知識普及程度較低、規(guī)范的治療方案實施困難以及專業(yè)讀片醫(yī)師的短缺,使得宮頸癌的發(fā)病率和死亡率都在不斷上升,而且這種情況很難得到有效的緩解。雖然“兩癌”的篩選工作受到了政府的高度重視,但目前還無法達到持久而有效的結(jié)果。根據(jù)北京大學(xué)人民醫(yī)院的一項最新研究,超過一半的宮頸癌患者沒有接受宮頸癌篩查,這說明宮頸癌的預(yù)防和控制仍處于初級階段。

綜上,通過對宮頸癌高危人群的定量研究,發(fā)現(xiàn)PAX1基因甲基化的存活率和定量水平都很高。這種定量技術(shù)具有高靈活性和高準確性,能夠作為臨床診斷的重要參考。