DNA倍體定量分析結合P16蛋白在宮頸癌篩查中的意義

韓 笑,朱 平,卓 倩,李 軍,許 研

(淮安市腫瘤醫(yī)院 淮安市淮安醫(yī)院 1.病理科,江蘇 淮安 223200;2.內分泌科)

宮頸癌在世界范圍內癌癥發(fā)病率中排名第三,在發(fā)展中國家中是女性最常見的癌癥[1],是我國女性惡性腫瘤第二大死亡原因,嚴重威脅著女性生命健康。在我國中晚期宮頸癌的5年生存率平均為59.8%,如果癌癥擴散到身體的遠處,5年生存率僅為17%,但如果能早期發(fā)現(xiàn),干預治療及時,5年生存率可以達到90%以上[2]。并且隨著社會發(fā)展,宮頸癌的發(fā)病年齡逐步年輕化,所以“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”在宮頸癌中尤為重要。本文通過對宮頸細胞DNA倍體定量分析進行初篩,結合宮頸活檢病理組織學檢查及P16免疫組織化學染色檢查,旨在為宮頸癌早期發(fā)現(xiàn)提供有意義的初篩方法。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年3月～2021年3月淮安市腫瘤醫(yī)院的門診及住院患者,進行宮頸細胞DNA倍體分析檢查4 334例為研究對象,年齡19～74歲,平均46.5歲。所有患者均在知情同意情況下進行,并通過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1宮頸細胞DNA倍體定量分析:宮頸取材患者采取截石位,用無菌棉球拭去宮頸口分泌物,使用宮頸取樣刷沿宮頸管順時針旋轉5圈以上,然后將刷頭放入細胞保存液瓶中。將放有刷頭的細胞保存液送至本院病理科,由本院病理科技術人員將標本瓶放到振蕩器上,振蕩5～10 s。然后離心制片經Feulgen染色后,由全自動高分辨率細胞DNA圖像定量分析Motic系統(tǒng)進行掃描分析篩選,細胞核DI(DNA index)值≥2.5為倍體異常。

1.2.2活檢組織病理學檢查:陰道鏡下對倍體細胞數≥3個的女性進行宮頸活組織檢查,送至本院病理科,用4%的中性甲醛固定4～6 h后,由病理科診斷人員對送檢標本取材,后放入全自動脫水機進行脫水、浸蠟,病理科技術人員對浸蠟后組織進行包埋、切片、脫蠟、染色等步驟后制成組織HE切片,由具有高級職稱的病理科診斷醫(yī)師閱片、判讀、發(fā)出病理診斷報告。

1.2.3免疫組織化學染色:病理技術人員將包埋好的組織蠟塊連續(xù)切片2張,厚度為3 μm,免疫組織化學染色采用SP法檢測P16蛋白的表達。免疫組織化學染色按試劑盒說明進行,用PBS緩沖液作為一抗,作為陰性對照;用已知的陽性片作為陽性對照。P16抗體、SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。由具有高級職稱的病理科診斷醫(yī)師閱片、判讀,發(fā)出報告。

1.3結果判定

1.3.1DNA倍體異常細胞:0個:未見DNA倍體異常細胞,定期復查;1～2個:可見少量DNA倍體異常細胞,4～6個月復查;≥3個:可見DNA倍體異常細胞,臨床陰道鏡檢查及活體組織檢查。有病理科醫(yī)師將假陽性細胞進行去偽存真,保留真異常細胞。

1.3.2宮頸活檢組織病理學檢查:分為宮頸慢性炎(見挖空細胞、伴儲備細胞增生和或腺體鱗化)、宮頸上皮內瘤變(CIN1、CIN2、CIN3)或伴累及腺體、宮頸癌(鱗狀細胞癌和腺癌)。

1.3.3P16蛋白表達:于細胞核和(或)細胞質。光學顯微鏡下細胞核或者細胞質里呈現(xiàn)棕黃色顆粒,根據著色程度分別計0分、1分、2分、3分。陽性細胞<10%計0分,10%～25%計1分,25%～50%計2分,>50%計3分。綜合判定取著色強度和陽性細胞百分數分值之積:0分為陰性,計為(-);1分以上為陽性,其中1分、2分計為(+),3分、4分計為(),6～9分計為()。“+～”均記作陽性(+)。所有切片由本院病理科具有高級職稱病理診斷醫(yī)師進行閱片、判讀。

1.4統(tǒng)計學方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗。

2 結果

檢測分析4 334例中發(fā)現(xiàn)異常細胞1～2個有140例,異常細胞≥3個有202例。202例進行宮頸活檢病理組織學(圖1)發(fā)現(xiàn)150例為CIN1以上,同時對活檢202例進行P16蛋白染色(圖2)發(fā)現(xiàn)隨著病變級別增高,P16表達百分比也隨之上升,通過χ2檢驗發(fā)現(xiàn)P16蛋白在宮頸上皮內瘤變中表達有明顯統(tǒng)計學意義(χ2=8.889,P=0.003)。見表1。

表1 DNA倍體異常細胞≥3個宮頸活檢組織學與P16染色結果(n)

圖1 宮頸活檢病理組織學(HE,×400)

圖2 P16在宮頸活檢組織中的表達(DAB,×400)

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,我國每年新增宮頸癌約13.15萬例,占世界宮頸癌新發(fā)總數的1/3[3],而且死亡率居高不下。宮頸癌的治療方法包括手術切除、放化療等,對于中晚期患者不建議手術治療;早期患者,結合患者情況采取手術切除,輔以放化療;對于癌前期病變即CIN,可以結合患者情況行宮頸錐切或子宮全切。早發(fā)現(xiàn)、早治療,可以大大提高患者的生存質量及生存率,所以宮頸癌的預防及早期發(fā)現(xiàn)尤為重要。宮頸癌的成功預防、診斷和臨床管理在很大程度上依賴于早期篩查[4]。細胞學檢查是較常用、創(chuàng)傷小、方便快捷的檢查方法。相比其他細胞學篩查,宮頸細胞DNA倍體定量分析有其特有的優(yōu)勢,如智能分析、結果客觀、靈敏度和特異性高等。

在生理情況下,DNA的復制是處于相對靜止的狀態(tài),含量相對穩(wěn)定。當細胞受到致癌因素的作用,處于增殖甚至異常增殖時,DNA的含量甚至結構都會發(fā)生改變。DNA含量的變化可以作為腫瘤細胞異常增殖的一項重要的生物學指標,鑒于癌變或者有癌變傾向的細胞內核酸含量會發(fā)生異常增生,且核酸含量的變化早于細胞形態(tài)的變化,所以DNA倍體定量分析技術被發(fā)明及廣泛應用于宮頸癌早期篩查[5]。

宮頸細胞DNA倍體定量分析主要是通過對細胞核內DNA含量的測定,來判斷細胞的生理狀態(tài)、病理改變[6]。對細胞進行特殊染色,細胞核DNA著色后,細胞核染色強度與其含量會成正比,利用全自動DNA圖像分析系統(tǒng)可以分析每個細胞核內DNA的積分光密度值(IOD),檢測其含量的變化,且按細胞DNA含量由高到低自動排序,將核酸含量DI值≥2.5的用紅色字體標記,方便識別,并用DNA直方圖、散點圖來顯示標本的惡性程度。細胞的惡變首先會出現(xiàn)染色質的改變,出現(xiàn)異倍體細胞核,如不及時干擾最終發(fā)生癌變[7],宮頸細胞也不例外,當發(fā)生病變時,首先會產生非整倍體細胞,即異倍體細胞,從而被系統(tǒng)識別。DNA倍體定量分析技術是基于以上理論基礎,所以該項技術在發(fā)現(xiàn)宮頸CIN方面要較常規(guī)細胞學檢查更為靈敏。本研究中發(fā)現(xiàn)的202例異常倍體細胞≥3個,活檢病理組織學證實有150例為CIN1以上,陽性率達74%,相對于其他宮頸細胞學檢查陽性率要高。宮頸細胞DNA倍體定量分析技術由于快速、準確、客觀、創(chuàng)傷小等優(yōu)點,可以作為宮頸癌篩查的有效方法。

P16又叫MTS基因,是美國科學家Kamb等發(fā)現(xiàn)的抗癌基因,位于人類染色體9p21上,是細胞增殖的負調控因子,其所表達的P16蛋白是一種腫瘤抑制蛋白,可以直接參與細胞周期的調控,被喻為細胞周期中的剎車裝置,一旦P16這個剎車裝置失靈,會引起細胞惡性增殖,導致癌癥的發(fā)生。P16蛋白表達的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[8]。在正常細胞中的表達較低,而當細胞增殖失控時,P16蛋白表達被激活,抑制細胞增殖[9]。P16蛋白激活后會結合細胞周期蛋白依賴性激酶4/6 (CDK4/6),抑制細胞周期蛋白D1和CDK4/6的結合,進而阻止視網膜母細胞瘤蛋白的磷酸化,并最終將細胞增殖阻止在細胞周期的G1期,從而減緩細胞生長[10]。Peter等[11-12]發(fā)現(xiàn)P16蛋白的異常表達與胰腺癌、食管癌、肺癌等關系密切。本研究結果顯示P16蛋白的表達隨著CIN級別的增高其表達亦增高。

當宮頸發(fā)生病變時,CIN的演變是不可預測的[13]。對生物標志物的分析可能有助于確定病變的進展或消退,而P16蛋白的免疫染色表達是被證實有用的,尤其對于宮頸高級別病變的診斷,意義更大[14]。陳春麗等[15]已經證實P16蛋白在宮頸癌篩查中有意義。LAST指南也推薦了組織學判讀后四種需要應用P16染色檢查的情況,其中對CIN1、CIN2、CIN3,尤其是病理專家考慮到CIN2診斷時,推薦使用P16免疫組化染色輔助判讀;而當細胞學判讀結果和病理組織學不一致,細胞學診斷為高度鱗狀上皮內病變(HSIL)、意義不明的非典型鱗狀細胞(ASCUS)等,活檢標本組織學被診斷為CIN1及以下病變,也推薦使用P16免疫組化染色檢測作為一種輔助的形態(tài)學評估指標。

宮頸癌篩查的目的是發(fā)現(xiàn)CIN1以上病變,能夠及時干預治療。理想的宮頸癌篩查手段應該是在提高細胞學檢測敏感性的同時,能夠不損失其特異性,或者可以通過客觀的生物標志物,標記出高級別病變的細胞,以輔助細胞學檢測結果的判讀和診斷。本文正是通過細胞DNA倍體定量分析篩查出陽性病例,活檢后組織病理學檢查與P16蛋白免疫染色結合起來,旨在提高檢出率,為宮頸癌篩查提供更有意義的方法,為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)提供更多的思路。