染發(fā)劑二羥吲哚毒理學驗證實驗與分析

李忠軍　徐建人　李鎮(zhèn)軍　胡燁敏　樊麗妃　李奇　焦紅

二羥吲哚合成應(yīng)用在國外已有30 多年歷史。國內(nèi)外多年研究發(fā)現(xiàn)，二羥吲哚有天然黑色染發(fā)作用，還具有抗菌、清除自由基和抗紫外輻射等功效。SCCP 早在18 年前就公布了二羥吲哚的染發(fā)劑安全性評價結(jié)果和使用推薦濃度。本文通過對國產(chǎn)二羥吲哚進行相關(guān)毒理學項目的重復(fù)驗證，將實驗結(jié)果同國際實驗室相應(yīng)項目的結(jié)果進行比較，為中國化妝品新原料的批準提供科學依據(jù)。根據(jù)中國《化妝品新原料申報與審評指南》規(guī)定，本實驗采用《化妝品技術(shù)規(guī)范2015 版》中動物急性經(jīng)口和經(jīng)皮毒性、皮膚和眼刺激性/ 腐蝕性、皮膚變態(tài)反應(yīng)性、皮膚光毒性、皮膚光變態(tài)反應(yīng)性、基因突變、染色體畸變和90 天經(jīng)皮染毒實驗方法，進行相關(guān)毒理學實驗，對結(jié)果進行比較評價。實驗結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)口急性毒性，雄性LD50 ＞ 3.690g/kg BW，雌性LD50 ＞3.160g/kg BW，毒性分級為低毒。急性經(jīng)皮毒性試驗LD50>2.180g/kg BW，毒性分級為微毒性。急性眼刺激性/ 腐蝕性試驗反應(yīng)分級為微刺激性。皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗致敏強度為輕致敏性。皮膚刺激性/ 腐蝕性試驗反應(yīng)分級為輕刺激性。基因突變和染色體畸變試驗均為陰性。皮膚光毒性和皮膚光變態(tài)反應(yīng)均為陰性。亞慢性經(jīng)皮毒性最大無作用劑量為20 mg/kg bw/day。所驗項目同國際組織SCCP 公布的結(jié)果比較基本一致，大部分項目的結(jié)果優(yōu)于國外。實驗結(jié)果顯示，本土相關(guān)產(chǎn)品二羥吲哚在染發(fā)劑中以0.5% 濃度添加使用是安全的。

關(guān)鍵詞：二羥吲哚；染發(fā)劑；動物毒理學試驗；結(jié)果比較

Part 1

前言

據(jù)國內(nèi)外多年研究發(fā)現(xiàn)，二羥吲哚有天然黑色染發(fā)作用，同時具有抗菌、清除自由基和抗紫外輻射、以及作為抗氧化劑制備各類應(yīng)急性疾病的預(yù)防或治療藥物等功效。二羥吲哚作為新一代染發(fā)護發(fā)用品中的有效活性成分已成為發(fā)展趨勢，也是國內(nèi)外關(guān)注的研究熱點[1]。二羥吲哚目前在日本稱作為“空氣氧化性染發(fā)劑”[2]。歐盟委員會健康和消費者保護總局公共衛(wèi)生及風險評估委員會（以下簡稱：“SCCP”）0952/05 《關(guān)于對二羥基吲哚的意見》報道了多個國際實驗室依據(jù)GLP程序和OECD 方法指南，對物質(zhì)代碼為P36和P39 的二羥吲哚樣品開展毒理學實驗，據(jù)此做出安全性評估意見和推薦使用濃度[3]。近10 年來， 隨著精細化學新產(chǎn)品的發(fā)展，中國在二羥吲哚合成方法和用途方面的報道也不斷出現(xiàn)，但是尚未被批準使用。根據(jù)中國《化妝品新原料申報與審評指南》要求[4]，申請注冊化妝品新原料，應(yīng)符合情景II 要求的項目進行毒理學評價。本文對相關(guān)二羥吲哚原料分別進行了急性經(jīng)口、經(jīng)皮毒性、急性眼刺激、皮膚刺激性/ 腐蝕性、皮膚變態(tài)反應(yīng)、皮膚光毒性、皮膚光變態(tài)反應(yīng)和基因突變、染色體畸變和90 天經(jīng)皮染毒等10 項毒理學實驗，并將實驗結(jié)果與SCCP/0952/05 的同項實驗結(jié)果進行比較，為本土二羥吲哚原料開發(fā)的毒理學評價提供科學依據(jù)。

Part 2

材料和方法

1. 實驗樣品來源

廣州市驕子日化有限公司提供產(chǎn)品染發(fā)劑原料二羥吲哚（批號研2023001-1） 共500mg。來源于3，4- 二烷氧基苯乙胺同溶劑乙酸在催化劑三溴化硼作用下，加氧化劑五氧化二磷和溶劑四氫呋喃進行氧化反應(yīng)，加還原劑連二亞硫酸鈉進行還原反應(yīng)生成二羥吲哚液體。再經(jīng)乙酸乙酯萃取、鹽水洗滌、減壓濃縮、冷凍結(jié)晶、真空干燥得到單一化合物二羥吲哚，純度高達97% 以上。500mg 二羥吲哚由鋁箔真空袋封存為5 袋，每袋100mg，外包裝完整無殘缺無泄漏。開袋后樣品為黑灰色固體粉末狀，見空氣顏色加深，二羥吲哚純度≥ 97.5%。實驗二次取樣后充氮封存，加套自封袋再次充氮4℃保存。

2. 實驗環(huán)境

急性經(jīng)口毒性試驗、急性經(jīng)皮毒性試驗、急性眼刺激性/ 腐蝕性試驗、皮膚刺激性/ 腐蝕性試驗、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗在廣州市黃埔區(qū)瑞發(fā)路16 號2 棟一樓動物毒理實驗室完成，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2021-0270。室溫18℃～ 26℃，濕度40% ～ 70%。上述動物實驗設(shè)計經(jīng)過廣州市宜健醫(yī)學技術(shù)發(fā)展有限公司實驗動物福利和倫理委員會批準。

皮膚光毒性試驗、皮膚光變態(tài)反應(yīng)試驗、基因突變和染色體畸變實驗在廣州市黃埔區(qū)科學城尖塔山路1 號普通環(huán)境動物毒理實驗室和體外實驗室完成，實驗動物使用許可證號：SYXK（ 粵）2022-0194。室溫18℃～ 26℃，濕度40% ～ 70%。上述動物實驗設(shè)計經(jīng)過廣州市微生物研究所集團股份有限公司實驗動物倫理委員會批準。

3. 實驗動物和飼料來源

急性經(jīng)口毒性試驗使用SPF 級KM小鼠（ 雌雄各半）；實驗動物生產(chǎn)許可證號∶SCXK（粵）2022-0002；動物合格證號：44007200113413。飼料購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，批號：20220907。質(zhì)量合格證：No.4420030028392。急性經(jīng)皮毒性試驗使用SPF 級SD 大鼠（雌雄各半），實驗動物、飼料來源和批號同1.3.1。動物合格證號：NO.44007200113412。

急性眼刺激性/ 腐蝕性試驗使用普通級新西蘭兔，實驗動物生產(chǎn)許