輪狀病毒的檢測方法及綜合防控

文｜李群杰（山東省壽光市羊口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站）

輪狀病毒（PORV）是導致仔豬腹瀉的重要病原體之一。它能夠引起多種小動物和新生嬰兒腹瀉，主要通過糞便和口腔傳播。臨床上常表現(xiàn)為腹瀉、食欲不振甚至消瘦和嗜睡等癥狀。隨著規(guī)?；i場的興起，世界上許多國家和地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒導致的相關腹瀉疾病，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了嚴重影響，并造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，采用快速準確的檢測方法對該疫病進行防控和治療至關重要。筆者對豬源輪狀病毒檢測方法的研究進展進行了綜述，總結了已有的豬源輪狀病毒檢測方法的原理、優(yōu)缺點等，以期為臨床上輪狀病毒的防治提供重要指導。

一、病原學

豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，其基因編碼了一種結構蛋白和5種非結構蛋白。全球范圍內(nèi)，豬輪狀病毒廣泛流行，且沒有明顯的季節(jié)性規(guī)律，豬場的患病率高達74%。根據(jù)輪狀病毒結構蛋白VP6的氨基酸序列，輪狀病毒可以分為9組（RVARVD和RVF-RVJ）。其中，RVA、RVB、RVC和RVH四組對人和豬都具有致病性。豬A組輪狀病毒（RVA）和C組輪狀病毒（RVC）是新生仔豬中最常見的病原體，其中RVC的致死率可達100%。RVA是主要的輪狀病毒群，有多種基因型可引起豬腹瀉。與RVA類似，RVC也能感染多種動物，尤其在新生仔豬中患病率較高。最近的研究表明，豬RVC毒株的某些基因（如VP6或nsP4）與人RVC毒株具有相似性，存在可能發(fā)生人畜共患病的情況。由于輪狀病毒的血清型較多，目前還沒有特效的治療方法。豬輪狀病毒和豬冠狀病毒的傳播對公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)產(chǎn)生了巨大威脅。因此，對于輪狀病毒的暴發(fā)和流行，及時準確地檢測和鑒別該病毒對于采取更有效的防治措施具有重要意義。目前常用的豬輪狀病毒檢測方法包括傳統(tǒng)經(jīng)典檢測方法、免疫學方法和分子生物學方法。傳統(tǒng)經(jīng)典檢測方法主要基于電鏡技術和病毒分離培養(yǎng)技術。然而，電鏡技術設備昂貴且操作煩瑣，不適合大規(guī)模的臨床檢測。此外，病原檢測涉及復雜的病料處理流程，如細菌培養(yǎng)、動物組織和血清處理等，受到其他病原體的影響，病原檢測的敏感性較低。病毒分離培養(yǎng)是病原檢測過程中必不可少的步驟，但由于病毒分離存在一定的不確定性，因此不適合大規(guī)模臨床檢測。目前，酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是輪狀病毒檢測常用的方法。其中，ELISA是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦使用的標準檢測診斷輪狀病毒的方法。ELISA利用抗體與病毒特定蛋白結合的原理，通過顏色反應來檢測病毒的存在。PCR則通過擴增目標病毒的核酸序列來進行檢測，具有高度的敏感性和特異性。

二、豬輪狀病毒ELISA檢測方法

ELISA技術具有操作簡單、敏感性高、特異性強、重復性好和價格低廉等優(yōu)點。目前，在國內(nèi)已經(jīng)建立了以豬輪狀病毒VP6和VP7蛋白為抗原的間接ELISA方法來檢測豬輪狀病毒血清抗體。研究人員使用純化的豬輪狀病毒VP6蛋白作為檢測抗原，建立了快速、特異、敏感的間接ELISA方法，為臨床上預防和治療豬輪狀病毒提供了一種有效的技術手段。此外，研究人員還開展了雙抗體夾心ELISA檢測方法來檢測豬輪狀病毒血清抗體。他們使用純化的兔抗PRV抗血清作為包被抗體，利用2B3雜交瘤細胞培養(yǎng)上清作為檢測抗體。該方法在檢測豬輪狀病毒時與PEDV、TGEV和PRV沒有交叉反應，并具有良好的穩(wěn)定性。與RT-PCR方法相比，該方法的準確性達到了95.7%。盡管ELISA方法具有操作簡練、價格低廉等優(yōu)點，但仍存在一些局限性。例如，它不能夠進行定量檢測，在臨界值附近時無法判斷結果。

三、豬輪狀病毒分子生物學技術方法

逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）是一種目前在RV病毒檢測中具有高特異性的方法。它的操作簡單，可以擴增產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆和測序等研究。然而，與病毒培養(yǎng)相比，該方法不能夠準確地定量目標病毒。此外，在操作過程中，判斷反應結果需要進行電泳，這會延長操作時間。而且，操作過程中可能會發(fā)生污染，并且人工判斷結果時存在誤判的可能性。因此，為了提高檢測效率和準確性，許多學者對RT-PCR的實驗原理進行了進一步的優(yōu)化。

1.一步法RT-PCR。RT-PCR試驗可以使用一步法和兩步法進行。一步法RT-PCR技術是在同一個緩沖液和酶系中進行cDNA合成和PCR擴增，無需建立cDNA文庫，即可獲得少量的mRNA。這種方法省去了中間步驟，簡化了實驗流程。兩步法RTPCR是通過逆轉錄酶對cDNA進行合成，并將合成的cDNA作為PCR的模板，將RNA的逆轉錄和PCR擴增分為兩個步驟。科研人員使用NSP4作為目標基因設計引物，開發(fā)了一種基于一步法的RT-PCR技術。與傳統(tǒng)的RT-PCR技術相比，這種方法具有簡便、高效、快速、靈敏度高、特異性高和穩(wěn)定性高等優(yōu)點。與兩步法相比，一步法具有以下優(yōu)點：首先，操作簡便只需1～2小時；其次，反應快速，只需15分鐘即可完成；此外，使用非核酸模板（如生物素）而不是核酸模板（如PCR產(chǎn)物），可以降低污染的風險；再者，一步法對RNA的二級結構影響較小，因為RNA的二級結構變化主要出現(xiàn)在3'端或5'端，一步法可以減少RNA二級結構的變化；最后，由于在逆轉錄過程中進行了純化，一步法可以降低由引物和模板不匹配引起的PCR錯誤率。綜上所述，一步法RT-PCR具有簡單操作、快速、低污染、對RNA二級結構影響小和PCR錯誤率低等優(yōu)點，是一種有效的RT-PCR技術。

2.實時熒光定量PCR。熒光定量PCR是一種廣泛應用的病毒檢測方法，與傳統(tǒng)PCR相比，它具有更高的靈敏度、更強的特異性，并且具有高度的自動化程度，對環(huán)境沒有污染，能夠實時監(jiān)測反應進程，并且可以進行多樣的檢測反應，所得結果準確可靠。熒光定量PCR技術主要包括探針法和SYBR Green I染料法?？茖W家選擇了VP6基因用于引物設計，通過使用FAM、Texas Red、CY5和VIC這四種不同的信號波長，建立了基于TaqMan探針的多重實時熒光定量PCR方法，可用于檢測和區(qū)分豬流行性腹瀉病毒的G1和G2亞型，以及豬輪狀病毒的A和C群。該方法具有高度的特異性，因為四種信號波長不同，不會相互干擾，可以在同一反應管中同時檢測多個熒光信號。這種方法減少了檢測時間和成本，為多種豬腹瀉病毒的快速、靈敏和特異性檢測提供了有效的工具。該多重實時熒光定量PCR可以作為豬病毒性腹瀉病的早期篩查工具、流行病學研究以及腹瀉病毒傳播的監(jiān)測。另外，高等科學家利用VP6基因保守區(qū)域設計引物，建立了一種使用SYBR Green I染料的實時熒光定量PCR方法，用于檢測豬A組輪狀病毒。與探針法相比，染料法的特異性更高、敏感性更強，但如果探針區(qū)域發(fā)生變異，可能會導致假陰性結果。針對容易發(fā)生變異的區(qū)域，采用多個探針可以避免這個缺陷，但是探針的設計、標記和純化成本較高。而科學家開發(fā)的基于SYBR Green I染料的實時熒光定量PCR方法成本較低，只需設計特異性引物即可進行病毒拷貝數(shù)的檢測，而且比普通PCR方法具有更高的敏感性，重復性也良好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%，表明該方法具有較高的穩(wěn)定性，非常適合臨床上大規(guī)模檢測。

3.環(huán)介導等溫擴增檢測方法。

科研人員利用環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）開發(fā)了一種快速檢測輪狀病毒的方法。該方法利用具有鏈置換功能的BST DNA聚合酶，在60～65℃的恒定溫度下擴增目標序列。這種技術的原理是在固定溫度條件下，引物與模板形成氫鍵，從而只需進行恒溫反應即可獲得目標條帶，無需進行模板熱變性、溫度循環(huán)、跑電泳和UV觀察等步驟。該反應體系中只有模板和引物參與反應，使整個過程簡化且省去了復雜的PCR步驟。與傳統(tǒng)的RT-PCR相比，這種方法節(jié)省了時間，提高了效率，因為無需進行模板熱變性、溫度循環(huán)、跑電泳和UV觀察等步驟。此外，所需儀器簡單，易于在臨床應用中使用。這種方法的優(yōu)勢在于減少了實驗操作的復雜性，為快速、高效的病毒檢測提供了一種新的選擇。

四、綜合防治

豬輪狀病毒具有季節(jié)性發(fā)生和流行的特點，多在冬春季發(fā)病較多。它以地方性或散在流行的方式傳播，影響各個發(fā)育階段的豬只。病癥主要表現(xiàn)為嚴重腹瀉、嘔吐、脫水、食欲不振和低精神狀態(tài)。特別是對于哺乳仔豬和斷奶仔豬，其危害更為嚴重，影響它們的正常生長發(fā)育，同時也給養(yǎng)殖場造成巨大經(jīng)濟損失。

豬輪狀病毒主要通過患病豬和潛伏感染豬傳播，主要途徑是糞-口傳播，即病豬排泄的糞便可污染飼料和飲用水，從而成為主要的傳播途徑。為了應對這個問題，建議在日常養(yǎng)殖過程中采取以下措施：對患病豬進行隔離，一旦發(fā)現(xiàn)疑似病例，立即將其隔離，以切斷傳染源并保護易感動物免受病原體感染。對病豬的飼養(yǎng)工具和飼養(yǎng)場地進行全面的消毒，以切斷傳播途徑。改善環(huán)境衛(wèi)生狀況，定期清潔和消毒養(yǎng)殖環(huán)境，每天進行消毒連續(xù)一周。確保飼料不受污染且營養(yǎng)豐富，這樣可以提高豬只的免疫力和抵抗力，預防不良誘因。對于仔豬，應按照規(guī)定的疫苗免疫程序進行接種，并及時進行補種，確保養(yǎng)殖動物達到預定的抗體水平。

綜上所述，豬輪狀病毒是一種傳播廣泛且危害嚴重的病毒性傳染病。目前存在多種檢測以及針對該病的治療和預防方法。因此，養(yǎng)殖管理人員應高度重視病毒的衛(wèi)生環(huán)境消毒，制定全面的防控措施，及時切斷病毒傳播途徑，減少病原體存活的機會，確保養(yǎng)殖動物的健康生長。