轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析解析巴西蕉幼苗響應(yīng)低溫的分子機制

林蔚，吳水金，李躍森

轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析解析巴西蕉幼苗響應(yīng)低溫的分子機制

林蔚，吳水金，李躍森

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建漳州 363005

【目的】低溫是導(dǎo)致香蕉減產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一?；谵D(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析參與香蕉抗寒的相關(guān)基因、蛋白及信號、代謝通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討香蕉抗寒的分子機制。【方法】以巴西蕉為試材，在7 ℃低溫下處理1 d（Cold1）和3 d（Cold3），以28 ℃培養(yǎng)的巴西蕉為對照（CK），基于筆者課題組前期獲得的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測巴西蕉在低溫脅迫下基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化，同時與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共同解析巴西蕉響應(yīng)低溫脅迫的分子機制?！窘Y(jié)果】轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，Cold1 vs CK、Cold3 vs CK和Cold1 vs Cold3三個對比組分別鑒定出11 370、15 460和9 619個差異表達(dá)基因，對這些基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因在光合作用信號、谷胱甘肽代謝、-亞麻酸代謝途徑和苯丙素生物合成等多個低溫脅迫關(guān)鍵信號代謝通路中富集。對部分差異表達(dá)基因進(jìn)行實時熒光定量（qRT-PCR）分析，其中DREB、MAPK和MYB等低溫調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)量在低溫處理后顯著上升，所選20個基因的表達(dá)變化趨勢與RNA-seq基本相符，證實了RNA-seq的準(zhǔn)確性。轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，共鑒定到6 211個與轉(zhuǎn)錄本相對應(yīng)的蛋白，轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，共有105個轉(zhuǎn)錄本及其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量共同上調(diào)，有218個轉(zhuǎn)錄本及其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量共同下調(diào)。GO富集分析顯示，差異表達(dá)基因和蛋白在光響應(yīng)、葉綠體、氧化還原酶活性等功能大量富集。此外，對差異表達(dá)基因和蛋白KEGG通路的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，低溫處理抑制了苯丙素生物合成和光合作用信號途徑相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了-亞麻酸代謝和谷胱甘肽途徑的表達(dá)?！窘Y(jié)論】運用轉(zhuǎn)錄組結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)繪制了基因和蛋白質(zhì)水平上的香蕉抗寒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)香蕉響應(yīng)低溫的信號通路主要涉及光合作用信號、谷胱甘肽代謝、-亞麻酸代謝途徑和苯丙素生物合成等途徑。

香蕉；低溫脅迫；轉(zhuǎn)錄組；蛋白質(zhì)組；關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】巴西蕉（Cavendish cv. Baxi）屬于芭蕉科芭蕉屬，是中國南方四大水果之一[1]。香蕉喜高溫高濕，因此，我國的香蕉主要產(chǎn)區(qū)多位于南亞熱帶地區(qū)，如福建、廣西、云南等?。▍^(qū)）[2]。低溫是影響果樹分布、產(chǎn)量、品質(zhì)的主要環(huán)境因素之一，而大多數(shù)香蕉主栽品種對于低溫脅迫十分敏感，耐冷性普遍較差，當(dāng)氣溫低于10 ℃時生長就會受阻，當(dāng)溫度下降到5 ℃時植株就會呈現(xiàn)葉片發(fā)黃的冷害反應(yīng)，溫度低于2 ℃則會致死[3-4]。因此，深入探究香蕉苗期抗寒分子基礎(chǔ)及響應(yīng)機制，可以為后續(xù)香蕉的抗寒育種提供理論基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】低溫脅迫對植物各個器官的生長發(fā)育都會造成嚴(yán)重影響，能夠抑制根的生長，降低根分生組織細(xì)胞延伸率[5]；此外，隨著溫度的降低，根系對水分的吸收能力也會受到影響，進(jìn)而影響植物的水分狀況及光合作用強度[6-7]。葉片對低溫的響應(yīng)也不僅僅是表觀的褐化和卷曲，還表現(xiàn)在葉綠體超微結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響葉綠素的合成及光合作用功能[8]。植物對低溫的感知主要依賴于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的G-蛋白信號調(diào)節(jié)器，通過激活Ca2+通道，改變植物中的Ca2+濃度來接收低溫信號[9]。植物對低溫信號的傳導(dǎo)及響應(yīng)主要是通過冷脅迫反應(yīng)原件結(jié)合因子（C-repeat/dehydration- responsive element binding factor，CBF）途徑實現(xiàn)，在低溫脅迫中，CBF被激活，進(jìn)而調(diào)控下游抗寒及冷馴化相關(guān)基因（cold-regulated or cold-responsive gene，COR）[10]。香蕉對低溫敏感，其抗寒分子機制研究較多，耿小慧[11]對巴西蕉鈣離子通道CNGC基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，共發(fā)現(xiàn)17個CNGC家族成員，且大部分CNGC家族成員的表達(dá)在低溫脅迫下呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。劉嘉鵬[12]利用轉(zhuǎn)錄組分析了褪黑素和低溫聯(lián)合處理后的巴西蕉幼苗，發(fā)現(xiàn)褪黑素主要通過影響植物激素信號傳導(dǎo)、MAPK信號途徑和苯丙烷生物合成等途徑相關(guān)基因的表達(dá)來提高香蕉的抗寒性。Gao等[13]利用酵母雙雜驗證大蕉MaICE1與MaMAPK3互作，且沉默MaMAPK3后，會顯著降低大蕉MaICE1的表達(dá)，從而使其抗寒性下降。Lin等[14]利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)低溫處理1 d后，巴西蕉葉片中的泛素化程度上升，結(jié)合泛素修飾組分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)泛素化修飾在巴西蕉響應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】組學(xué)技術(shù)在分析植物基因或蛋白整體表達(dá)上具有巨大的優(yōu)勢，但單一的組學(xué)對深入剖析生物學(xué)現(xiàn)象的機制、機理具有一定的局限性。因此，有必要利用多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析探究機理，得到更完整的表達(dá)信息。筆者課題組在前期研究中，已利用非標(biāo)定量法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對巴西蕉幼苗在低溫脅迫下的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以主栽品種巴西蕉幼苗為試材，在7 ℃低溫分別處理1 d、3 d后取葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。深入研究巴西蕉低溫脅迫下的基因表達(dá)模式，并且與前期獲得的巴西蕉低溫脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，以全面地了解巴西蕉響應(yīng)低溫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以巴西蕉為材料，于2022年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所進(jìn)行。選擇培養(yǎng)至生長狀態(tài)基本一致的“五葉一心”香蕉幼苗，并在培養(yǎng)箱中以12 h白天/12 h黑夜（28 ℃）、光強240 μmol?m-2?s-1，濕度70%的條件下緩苗一周，以28 ℃培養(yǎng)的香蕉幼苗為對照組，以7 ℃處理1 d、3 d為處理組（分別記為Cold1、Cold3），每個時間點重復(fù)采集5株香蕉幼苗的第一和第二片幼葉，切碎后混合，3次生物學(xué)重復(fù)。所有樣品在液氮中快速冷凍，并在-80 ℃下儲存。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

利用MJZol total RNA提取試劑盒（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）對7 ℃處理1 d、3 d及對照組的香蕉葉片共9個樣品（每組3個重復(fù)）中的總RNA進(jìn)行抽提，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測組織總RNA完整性（RNA integrity，RIN），RIN≥8。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina平臺建庫測序并對原始數(shù)據(jù)去冗余過濾。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 利用HiSat2軟件將質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)（clean data）以香蕉基因組（NCBI，ASM31385v2）為參考基因組進(jìn)行比對，使用RSEM軟件對基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行分析，使用R語言軟件的DESeq2包分析基因差異表達(dá)顯著性（篩選標(biāo)準(zhǔn)：FDR＜0.05，|Log2FC|≥1）。在GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，基于FPKM值計算基因表達(dá)量，篩選巴西蕉響應(yīng)低溫脅迫的差異表達(dá)基因（DEG）。使用R語言軟件的ggplot2包繪制基因統(tǒng)計柱狀圖、火山圖、氣泡圖、GO及KEGG富集圖。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和前期獲得的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)（登錄號：PXD041481，蛋白提取、分解、檢測等方法詳見文獻(xiàn)[14]），進(jìn)行兩組學(xué)間的鑒定、定量比較分析。將差異表達(dá)的基因和蛋白（FDR＜0.05、|Log2FC|≥1）作為分析目標(biāo)，統(tǒng)計分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，使用R語言軟件的ggplot2包繪制基因、蛋白的相關(guān)性分析、韋恩圖、GO和KEGG富集，了解低溫脅迫下各差異表達(dá)基因和蛋白的富集情況。

1.4 qRT-PCR驗證

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序的準(zhǔn)確性，本研究選擇了20個差異表達(dá)的低溫相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證?；诨蚪M數(shù)據(jù)庫獲得的基因全長信息，使用Primer 5.0設(shè)計熒光定量特異引物（表1），內(nèi)參基因為，qRT-PCR試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）反應(yīng)體系包括10 μL 2×SYBR Green Pro Tap HS premix，1 μL上、下游引物，1 μL稀釋后的cDNA模板（100 ng?μL-1），無菌水補充至20 μL，反應(yīng)步驟：95 ℃變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。以2-△△CT[15]計算差異表達(dá)基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及序列比對分析

對巴西蕉低溫處理及對照共9個樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（表2），對獲得的原始數(shù)據(jù)（raw reads）過濾去冗余后，得到總數(shù)為63.1 Gb的clean reads，各樣品clean data均達(dá)到6.35 Gb以上，錯誤率僅為0.02%左右，Q20堿基百分比均在97.06%以上，Q30堿基百分比在91.83%以上，GC含量均在50%左右。以上指標(biāo)數(shù)據(jù)說明巴西蕉葉片測序質(zhì)量良好，可進(jìn)行下一步分析。轉(zhuǎn)錄組所用參考基因為小果野蕉基因組（NCBI，ASM31385v2），將過濾后的clean data與基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析（表3），結(jié)果顯示序列對比率均高于88%，此外還統(tǒng)計了多方比對（在參考序列上有多個比對位置的clean reads）和唯一比對（在參考序列上有唯一比對位置的clean reads數(shù)目）。

2.2 基因差異表達(dá)分析

進(jìn)一步對CK、Cold1和Cold3組間的DEGs數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，Cold1 vs CK的DEGs共有11 370個，其中6 231個DEGs上調(diào)（54.8%），5 139個DEGs下調(diào)（45.2%）；Cold3 vs CK的DEGs共有15 460個，其中7 889個DEGs上調(diào)（51%），7 571個DEGs下調(diào)（49%）；Cold1 vs Cold3的DEGs共有9 619個，其中4 640個DEGs上調(diào)（48.2%），4 979個DEGs下調(diào)（51.8%）（圖1）。

表1 qRT-PCR引物序列信息

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

表3 基因組對比結(jié)果

圖1 差異表達(dá)基因統(tǒng)計圖

2.3 差異表達(dá)基因GO、COG富集分析

對Cold1 vs CK、Cold3 vs CK和Cold1 vs Cold3三個對比組的DEGs進(jìn)行GO聚類分析，分別有11 370、15 460和9 619個DEGs在GO不同功能節(jié)點上富集，分布在分子功能、細(xì)胞組分和生物過程3個大類中（圖2）。其中生物調(diào)節(jié)、代謝過程和細(xì)胞過程在生物過程組分中是排名前3的亞類；細(xì)胞器、細(xì)胞膜部分和細(xì)胞部分在細(xì)胞組分中是排名前3的亞類；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、催化活性和結(jié)合活性在分子功能組分是排名前3的亞類。以上結(jié)果說明巴西蕉幼苗在低溫脅迫下發(fā)生了復(fù)雜的新陳代謝和酶促反應(yīng)。將3個對比組的DEGs與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析，預(yù)測基因功能并分類統(tǒng)計（表4），結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄類所占比例最大，其次是翻譯后修飾和信號傳導(dǎo)機制。

表4 差異表達(dá)基因的COG注釋分類情況

2.4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

為了進(jìn)一步探索巴西蕉在低溫脅迫下的代謝途徑變化，將低溫處理組與對照組的DEGs及KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析（表5），同時利用氣泡圖展示DEGs在KEGG途徑中的富集情況（圖3）。結(jié)果顯示，在Cold1 vs CK、Cold3 vs CK和Cold1 vs Cold3這3個對比組中，DEGs主要富集在光合作用、植物病原體相互作用、植物激素信號傳導(dǎo)、MAPK信號通路、苯丙素生物合成、谷胱甘肽代謝和-亞麻酸代謝等途徑，其中許多代謝通路與低溫脅迫有關(guān)。

圖2 差異表達(dá)基因GO功能分類

2.5 轉(zhuǎn)錄組qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對20個低溫脅迫相關(guān)DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗證，結(jié)果表明這20個基因在香蕉低溫脅迫中的變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果基本相符（圖4），說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)較為可靠。

2.6 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析

前期研究中，課題組利用蛋白質(zhì)組測序?qū)Π臀鹘度~片在低溫脅迫中的蛋白質(zhì)豐度變化進(jìn)行了分析，共鑒定到6 223個蛋白，為了統(tǒng)計鑒定到的蛋白與mRNA之間的交叉情況，將蛋白ID與轉(zhuǎn)錄本ID進(jìn)行比對，共鑒定到6 211個與轉(zhuǎn)錄本ID相對應(yīng)的蛋白。轉(zhuǎn)錄組與蛋白組之間除了一對一的相互關(guān)系外，還存在其他更為復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，統(tǒng)計分析基因及其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量并繪制散點圖（圖5-A），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間呈正相關(guān)關(guān)系（=0.17）。以Log2FC＞1且＜0.05為顯著差異表達(dá)上調(diào)，|Log2FC|≥1且＜0.05為顯著差異表達(dá)下調(diào)作為篩選條件，比較轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本和蛋白個數(shù)分布情況（圖5-B）。結(jié)果顯示，巴西蕉在低溫脅迫時，葉片轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)量多于下調(diào)的基因數(shù)量，而在蛋白質(zhì)組中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量與表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量相差不大。為了直觀比較DEPs與DEGs的交叉情況，利用韋恩圖對交叉情況進(jìn)行分析（圖5-C），結(jié)果顯示有105個轉(zhuǎn)錄本及其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量共同上調(diào)，有218個轉(zhuǎn)錄本及其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量共同下調(diào)。

為了比較分析各差異表達(dá)基因和蛋白的功能，通過GO功能富集分析對與DEGs表達(dá)趨勢相同的DEPs進(jìn)行分析，如圖6所示，當(dāng)DEGs和DEPs共同上調(diào)時，其功能主要富集在一元羥酸代謝過程、線粒體、葉綠體、質(zhì)體、氧化還原酶活性和離子結(jié)合等；當(dāng)DEGs和DEPs共同下調(diào)時（圖7），其功能主要富集在對光的響應(yīng)、葉綠體、葉綠素、質(zhì)體、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合以及氧化還原酶活性等；為了關(guān)聯(lián)分析DEGs-DEPs在各信號和代謝通路上的聯(lián)系，通過值來比較這些KEGG通路在不同基因和蛋白分類下的富集程度，采用熱圖的形式可視化展示結(jié)果（圖8）。結(jié)合圖3篩選的低溫脅迫相關(guān)代謝通路進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)苯丙素生物合成（map00940）、光合作用信號途徑（map00195，map00196）這兩個通路的相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量在低溫處理后均下調(diào)；而-亞麻酸代謝（map00592）的相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量在低溫處理后均上調(diào)；另外2種代謝通路的DEGs和其對應(yīng)蛋白的表達(dá)變化不一致，如谷胱甘肽途徑（map00480）的相關(guān)基因表達(dá)量在低溫處理后產(chǎn)生上調(diào)或下調(diào)的變化，而其相關(guān)蛋白的表達(dá)量普遍升高。

A: Cold1 vs CK; B: Cold3 vs CK; C: Cold1 vs Cold3

表5 部分差異表達(dá)Unigene的代謝通路

圖4 qRT-PCR驗證結(jié)果

A：轉(zhuǎn)錄本與其對應(yīng)蛋白表達(dá)量相關(guān)性分析；B：差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本與蛋白質(zhì)分布統(tǒng)計圖；C：差異表達(dá)蛋白與轉(zhuǎn)錄本比較分析韋恩圖

圖6 與DEGs共同上調(diào)的DEPs的GO富集分析

圖7 與DEGs共同下調(diào)的DEPs的GO富集分析

圖8 基于KEGG通路的DEGs-DEPs關(guān)聯(lián)分析

3 討論

3.1 低溫脅迫影響香蕉葉片基因與蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)合成、降解等代謝過程在植物響應(yīng)低溫脅迫中起著重要作用[16]，本研究中，鑒定到了大量的DEGs和DEPs，表明低溫處理使巴西蕉葉片中大量基因和蛋白的表達(dá)水平產(chǎn)生了顯著變化。分析結(jié)果顯示，DEGs和DEPs表達(dá)一致的共有323對，另外有148對呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，此外還有大量的基因表達(dá)無顯著差異而蛋白表達(dá)差異顯著或蛋白表達(dá)無顯著差異而基因表達(dá)差異顯著的情況，其原因可能是細(xì)胞中的蛋白質(zhì)豐度受多種因素的影響和控制，如蛋白質(zhì)的翻譯水平、半衰期、合成速率和數(shù)量，都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)豐度與mRNA的顯著差異；此外，翻譯效率、技術(shù)平臺成熟度和測序方法之間的差異可能導(dǎo)致相關(guān)性較低[17-18]。

3.2 低溫脅迫影響光合作用信號

光合作用信號途徑與冷脅迫之間存在著復(fù)雜的互作關(guān)系[19-20]。在低溫條件下，生物體內(nèi)的光合作用電子傳遞和碳固定的效率會降低，從而抑制其吸收光的能力[20]。此外，光合作用電子傳遞能力的下降也是導(dǎo)致光抑制和氧自由基增加的主要原因[21]。本研究中，低溫處理后，當(dāng)DEGs和DEPs共同下調(diào)時，其功能在光響應(yīng)、葉綠素和葉綠體方面大量富集，且光合作用信號途徑相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量都下降，光合生物中的碳固定相關(guān)基因表達(dá)量下降，說明低溫處理抑制了香蕉葉片的光合作用，進(jìn)而對香蕉的正常生長產(chǎn)生影響。

3.3 低溫脅迫對谷胱甘肽代謝的影響

在植物中，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因超家族（GSTs）根據(jù)序列相似性、免疫學(xué)活性和結(jié)構(gòu)構(gòu)象被分為11個亞類，其中Tau、Phi、DHAR和Lambda 4個亞類為植物中特有[22]，能夠有效緩解植物在非生物脅迫中如低溫脅迫、鹽脅迫造成的氧化損傷[23-25]。而不同植物物種響應(yīng)低溫脅迫的GST亞類也不同，如擬南芥中的Tau[26]、茄屬植物中的Phi[27]、水稻中的Zeta[28]等。在本研究中，通過關(guān)聯(lián)分析鑒定到了許多差異表達(dá)的GST基因和蛋白，主要為Tau亞類（LOC103997659，LOC103997954）、Phi亞類（LOC103971959，LOC103981216，LOC103982403）、Zeta亞類（LOC103989353，LOC103995971）和Theta亞類（LOC103973270，LOC103973269）。本研究發(fā)現(xiàn)，冷處理3 d的谷胱甘肽代謝途徑較1 d的更活躍，而其他4種信號代謝通路上兩個處理的差異基因表達(dá)情況基本相同，說明谷胱甘肽代謝途徑在香蕉響應(yīng)低溫脅迫有一定的滯后性，隨著低溫時間的增加而逐漸活躍。關(guān)聯(lián)分析的KEGG富集結(jié)果顯示（圖8），低溫處理后激活了谷胱甘肽代謝途徑（map00480）相關(guān)蛋白的表達(dá)，說明谷胱甘肽代謝途徑在香蕉響應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮重要作用。

3.4 低溫脅迫對α-亞麻酸代謝的影響

-亞麻酸是多元不飽和脂肪酸，與植物抗氧化能力密切相關(guān)，是脂質(zhì)代謝的重要組成部分，對植物抵御低溫脅迫起著重要的作用[29-30]。植物在應(yīng)對非生物脅迫時，通過釋放-亞麻酸代謝來維持細(xì)胞膜的流動性，同時在膜脂和膜蛋白的相互作用下抵御不良環(huán)境造成的影響[31]。本研究中，當(dāng)DEGs和DEPs共同下調(diào)時，在亞麻酸脂氧合酶方面富集，說明低溫處理對亞麻酸屬不飽和脂肪酸的催化能力降低，增加了其在香蕉葉片中的含量；同時，低溫處理后有許多差異表達(dá)基因和蛋白在-亞麻酸代謝途徑中富集（map00592），且無論是基因還是其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量均上調(diào)，說明低溫誘導(dǎo)了-亞麻酸的合成及其代謝途徑。-亞麻酸還與茉莉酸（JA）生物合成密切相關(guān)，通過脂質(zhì)代謝途徑誘導(dǎo)JA的合成[32]，研究表明，JA能夠減輕番茄低溫誘導(dǎo)的氧化脅迫[33]。本研究通過關(guān)聯(lián)分析鑒定到3個參與JA生物合成途徑的差異表達(dá)基因和蛋白，包括2個3-酮?；?CoA硫解酶（LOC103973111，LOC103985063）和4-雙酸輔酶A連接酶（LOC103994510），且這3個差異基因和蛋白的表達(dá)量在低溫處理后均上調(diào)，說明香蕉在遭受低溫脅迫后，通過對-亞麻酸及JA合成途徑的調(diào)節(jié)改變?nèi)~片中的脂質(zhì)組成成分及相關(guān)植物激素的含量，以抵御低溫環(huán)境。

3.5 低溫脅迫對苯丙素生物合成的影響

苯丙素類物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，當(dāng)植物受到非生物脅迫時，在體內(nèi)快速積累黃酮與類黃酮化合物，清除植物體內(nèi)自由基，緩解脅迫對植物造成的損害[34]。PAL是酚類化合物合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶，促進(jìn)L-苯丙氨酸催化轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，而后與4CL共同作用合成4-香豆酰輔酶A，在植物冷脅迫中發(fā)揮重要作用[35-37]，而CHI主要通過催化查爾酮轉(zhuǎn)化為黃烷酮來提高植株的抗逆性[38]。本研究對苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酸:輔酶A連接酶和查爾酮異構(gòu)酶這幾個苯丙素代謝途徑關(guān)鍵酶[39]進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。其中，在低溫處理后，PAL（LOC103985827）和4CL（LOC103994510）基因及其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量均上升，還鑒定到兩個顯著上調(diào)的CHI蛋白，但其對應(yīng)的基因表達(dá)一個下調(diào)（LOC103981836），另一個無顯著差異（LOC103972228），推測低溫誘導(dǎo)并增加了這些苯丙素代謝途徑關(guān)鍵酶的活性，在香蕉抵御低溫脅迫中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

低溫處理改變了巴西蕉葉片中基因的表達(dá)水平，GST基因家族、MAPK基因家族和DREB等低溫調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)量在低溫處理后顯著上調(diào)。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，低溫處理后巴西蕉葉片中的DEPs和DEGs呈正相關(guān)關(guān)系，其基因功能主要富集于線粒體、光的響應(yīng)和氧化還原酶活性等。此外，對篩選出的低溫脅迫關(guān)鍵信號通路進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，苯丙素生物合成和光合作用信號途徑這兩個通路的相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量在低溫處理后均下調(diào)，而-亞麻酸代謝的相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量在低溫處理后均上調(diào)，推測這些通路中的基因和蛋白表達(dá)量的變化是造成巴西蕉對低溫敏感的重要原因。

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Transcriptome and Proteome Association Analysis to Revealthe Molecular Mechanism of Baxi Banana Seedlings in Response to Low Temperature

LIN Wei, WU ShuiJin, LI YueSen

Subtropical Agriculture Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, Fujian

【Objective】 Low temperature is a significant natural disaster that affects banana production. In this study, based on transcriptome and proteome association analysis, the regulatory network of genes, proteins, signals and metabolic pathways involved in banana cold resistance was investigated. The aim was to explore the molecular mechanism of banana cold resistance.【Methods】‘Baxi’ banana (Lour) was treated at 7 ℃ for 1 and 3 d, and a control group was treated at 28 ℃. Based on the proteome data obtained in the previous study, the transcriptome sequencing technology was used to detect changes in the gene regulatory network of banana under cold stress. Simultaneously, the correlation analysis was conducted with proteomics to analyze the molecular mechanism of banana response to cold stress. 【Result】 Transcriptome analysis revealed that 11 370, 15 460 and 9 619 differentially expressed genes were identified in the three comparison groups of Cold1 vs CK, Cold3 vs CK and Cold1 vs Cold3, respectively. KEGG enrichment analysis of these genes revealed that the differentially expressed genes were enriched in several key signaling metabolic pathways, such as photosynthesis signal, glutathione metabolism,-linolenic acid metabolic pathway and phenylpropanoid biosynthesis under low temperature stress. Moreover, there were significant differences in the enrichment degree of glutathione metabolic pathway between Cold1 d vs CK and Cold3 d vs CK. Real-time quantitative PCR analysis (qRT-PCR) was performed on several differentially expressed genes. Among them, the expression levels of key low-temperature regulatory genes, such as DREB, MAPK and MYB, were significantly increased after the low-temperature treatment. The expression trend of the selected 20 genes was essentially consistent with that of RNA-seq, confirming the accuracy of RNA-seq. The results of the transcriptome and proteome association analysis showed a positive correlation between the transcriptome and proteomics. A total of 6 211 proteins corresponding to transcripts were identified. Among these, 105 transcripts and their proteins were up-regulated, while 218 transcripts and their proteins were down-regulated. GO enrichment analysis showed that the differentially expressed genes and proteins were enriched in functions, such as photoresponse, chloroplast and oxidoreductase activity. Furthermore, the correlation analysis of differentially expressed genes and protein KEGG pathway revealed that the low temperature treatment suppressed the expression of genes and proteins related to phenylpropanoid biosynthesis and photosynthesis signaling pathway, while promoting the expression of proteins associated with-linolenic acid metabolism and the glutathione pathway. 【Conclusion】 The transcriptome and proteomics were used to map the regulatory network of banana cold resistance at the gene and protein levels. It was found that the signal pathway of banana response to low temperature mainly involved photosynthesis signal, glutathione metabolism,-linolenic acid metabolism and phenylpropanol biosynthesis.

Lour; low temperature stress; transcriptome; proteome; comparative analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.08.012

2023-09-18；

2023-12-15

福建省公益類科研院所專項（2022R1030006，2021R1030006）、福建省自然科學(xué)基金（2023J01374）

通信作者林蔚，E-mail：Linw102@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）