肝癌中環(huán)狀RNA 的表達(dá)模式及其編碼潛能的研究

林 熊，武金才，褚鳳冉，曹 智，葉 妃，陳家誠(chéng)，劉路政

（1.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院/海南省人民醫(yī)院 肝膽胰外科，海南 海口 570311；2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 介入血管外科，海南 海口 570311；3.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 血液細(xì)胞治療科，海南 ?？?570311）

肝癌（liver cancer， LC）的發(fā)病率位居全球惡性腫瘤排名第六位，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，嚴(yán)重危害著人類的健康［1］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是LC 最常見(jiàn)的病理類型。HCC 的發(fā)病機(jī)制并不明確。目前有效治療方法是手術(shù)切除或肝移植［2，3］。盡管臨床技術(shù)有所改善，但患者預(yù)后仍然極差，5 年生存率低，腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)率高［3-5］，缺乏有效的HCC 診斷標(biāo)志物和理想治療靶點(diǎn)。

作為特殊的非編碼RNA，環(huán)狀RNA（circular RNA， circRNA ）一度被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接形成的RNA 分子，隨著二代測(cè)序及生物信息學(xué)等的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)circRNA 可以是多種癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［6］。CircRNA 由下游外顯子的剪接供體位點(diǎn)和上游外顯子的剪接受體位點(diǎn)之間的驅(qū)動(dòng)循環(huán)或反向剪接產(chǎn)生，不具有5′末端帽子和3′末端 poly（A）尾巴，擁有特殊的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性高［7，8］。證據(jù)已有表明，circRNA 可通過(guò)與microRNA 或RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding protein， RBP）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而間接調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)［8，9］。同時(shí)，circRNA 還具有核轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子、調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)，并且豐富存在于外泌體中，參與HCC 的侵襲及轉(zhuǎn)移，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［10-12］。

近些年來(lái)，circRNA 被發(fā)現(xiàn)以不依賴帽子的方式如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site， IRES）元件、N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine， m6A）等介導(dǎo)翻譯起始［13，14］，從而編碼產(chǎn)生一類小分子多肽，調(diào)節(jié)細(xì)胞分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與惡性腫瘤的演變和進(jìn)展［15，16］。胃癌中，CircAXIN1 可編碼295 個(gè)氨基酸的AXIN1-295aa，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合APC 介導(dǎo)β-catenin/TCF/Wnt 途徑促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［17］。三陰性乳腺癌中，circ-HER2 可產(chǎn)生 HER2-103aa，通過(guò) EGFR/HER3/AKT 途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生與侵襲，并增加TNBC 對(duì)帕妥珠單抗（Pertuzumab）的敏感性［18］。特殊的滾環(huán)翻譯產(chǎn)物rtEGFR 亦被報(bào)道與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤成瘤和Nimotuzumab 藥敏密切相關(guān)［19］。盡管circRNA 翻譯組學(xué)持續(xù)研究及質(zhì)譜證據(jù)的不斷完善，肝癌中關(guān)于circRNA 翻譯的案例鮮有報(bào)道，值得進(jìn)一步調(diào)查。

本研究基于RNA-seq 對(duì)3 對(duì)肝癌與癌旁組織進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析circRNA 的表達(dá)模式，進(jìn)行序列分析、GO、KEGG 和Reactome 通路富集。通過(guò)在線翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)Transcirc 和Ribocirc 對(duì)這些基因進(jìn)一步篩選，并預(yù)測(cè)其編碼潛能。應(yīng)用qPCR 檢測(cè)其表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本的收集

3 例肝細(xì)胞癌樣本取自海南省人民醫(yī)院肝膽胰外科標(biāo)本庫(kù)，并遵從《赫爾辛基宣言》要求，簽署倫理知情同意書。樣本自離體30 min 內(nèi)液氮速凍，并在-80 ℃冰箱內(nèi)保存。組織樣本均由外科手術(shù)獲得，病理學(xué)診斷均為肝細(xì)胞癌，且所有患者術(shù)前均未行任何治療，包括放化療或射頻消融等。

1.2 RNA 的抽提、質(zhì)檢、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

采用Trizol 法進(jìn)行組織總RNA 的抽提，抽提所得的總RNA 取樣質(zhì)檢。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度，判斷是否有基因組污染。Qubit 3.0 檢測(cè)RNA 樣品濃度，Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測(cè)RNA的完整性（RIN 值≥7）。樣品質(zhì)檢合格后，使用Total RNA-seq （H/M/R） Library Prep Kit for Illumina?構(gòu)建文庫(kù)，先將設(shè)計(jì)好的DNA 探針與RNA 樣品進(jìn)行雜交，從而將rRNA 從總RNA 中去除；隨后將RNA 進(jìn)行片段化，合成cDNA 第一鏈，采用鏈特異的方法，在第二鏈cDNA 合成時(shí)摻入dUTP 對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)在此步完成了末端修復(fù)；接著進(jìn)行加A-尾、連接接頭、連接產(chǎn)物純化和片段大小分選、文庫(kù)擴(kuò)增等步驟，在PCR 擴(kuò)增前用UDG 酶消化帶dUTP 第二鏈模板，擴(kuò)增結(jié)束后用磁珠純化回收即得RNA-seq 文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit3.0 進(jìn)行初步定量，隨后使用Agilent 2100 Bioanalyzer 對(duì)文庫(kù)大小范圍進(jìn)行檢測(cè)，插入的目的片段大小符合預(yù)期后，使用QPCR 方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞3 nmol/L），以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，將不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling，采用Novaseq 6000 PE150 模式進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量10G。

1.3 生物信息學(xué)方法

使用Bowtie2 version 2.1.0 將獲得的reads 與最新的UCSC 轉(zhuǎn)錄集進(jìn)行比對(duì)［20］。首先，對(duì)原始reads進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭序列、含N 較多的序列及低質(zhì)量的reads，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)（Clean reads）。然后，通過(guò)與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，去除核糖體RNA序列，獲得有效的reads，將有效的reads 與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果用于下一步circRNA 的鑒定。

對(duì)于circRNA 的表達(dá)分析，使用STAR 軟件與基因組序列進(jìn)行比對(duì)，使用DCC 軟件鑒定circRNA，并通過(guò)edgeR 程序計(jì)算circRNA 表達(dá)［21-23］。TMM （trimmed mean of M-values）將基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并過(guò)濾掉TMM 表達(dá)較低的circRNA（CPM＞0.1）.隨后根據(jù)分組信息，基因表達(dá)P＜0.05 且fold changes ＞ 1.5 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)差異性表達(dá)的circRNA 來(lái)源的宿主基因，進(jìn)行了GO 功能和KEGG、Reactome 通路的富集分析。R 語(yǔ)言用于圖表繪制.

1.4 CircRNA 的翻譯潛能預(yù)測(cè)

將差異表達(dá)circRNA 在TransCirc 和riboCirc 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索并取交集，使用IRESfinder 軟件預(yù)測(cè)circRNA 序列上的IRES 元件，m6A SRAMP 數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別m6A 位點(diǎn)，NCBI ORFfinder 預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）序列，CPAT 預(yù)測(cè)編碼潛能，包括ORF 大小、ORF 覆蓋率、Fickett TESTCODE 統(tǒng)計(jì)量（即根據(jù)堿基組成及密碼子偏好性的組合效率區(qū)分序列是否編碼）及hexamer 使用偏好性（通過(guò)log 似然估計(jì)評(píng)估編碼與非編碼序列使用hexamer 的偏好性）。

1.5 qPCR

采用Trizol 法進(jìn)行組織總RNA 的抽提；接著進(jìn)行總RNA 反轉(zhuǎn)錄（首先配制gDNA Eraser 反應(yīng)混合液，其次將上述混合液按一定試劑與用量配制RNA反轉(zhuǎn)錄混合液，最后將RNA 反轉(zhuǎn)錄混合液先于42 ℃水浴中放置15 min，再于85 ℃水浴中放置5 s后立即置于冰上，獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA），隨即將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）可立即用于qPCR 檢測(cè)，或存于-80 ℃。樣品信息與體系檢測(cè)（檢測(cè)引物信息；Real-time PCR 檢測(cè)反應(yīng)體系與循環(huán)體系），引物序列見(jiàn)表1；上機(jī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果。

表1 11 個(gè)circRNA 及內(nèi)參基因qPCR 檢測(cè)的引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR detection of 11 circRNAs and internal reference genes

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將qPCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用定量數(shù)值及分析（2-ΔΔCt）分析法，得到計(jì)算結(jié)果，然后用統(tǒng)計(jì)學(xué)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析上述結(jié)果得到P值。

2 結(jié)果

2.1 序列比對(duì)結(jié)果評(píng)估及reads 在基因組區(qū)域分布情況

原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量評(píng)估合格后，去除reads 的引物以及接頭，并剪切掉低質(zhì)量序列片段，序列與基因組比對(duì)結(jié)果（圖1A）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)以編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)域和基因間區(qū)域分布的reads 為主（圖1B）。樣品主成分分析顯示癌與癌旁組織分別聚類在一起（圖1C）。

圖1 序列比對(duì)結(jié)果評(píng)估及reads 在基因組區(qū)域分布情況Fig 1 Evaluation of sequence alignment results and distribution of reads in genomic regions

2.2 CircRNA 的表達(dá)模式及序列分析

根據(jù)原始reads 數(shù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行circRNA 的表達(dá)模式分析，共發(fā)現(xiàn)10 316 個(gè)circRNA。由于表達(dá)豐度足夠高的基因才能反應(yīng)真實(shí)的生物學(xué)現(xiàn)象，為識(shí)別出具有生物學(xué)意義的差異表達(dá)基因，使用TMM 對(duì)不同樣品每個(gè)基因的表達(dá)之進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化即基因的CPM（counts per million），同時(shí)對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為：CPM 值在至少在一半樣本中都大于0.1。共發(fā)現(xiàn)了416 個(gè)豐度相對(duì)可觀的circRNA（圖2A），存在35 個(gè)上調(diào)的circRNA，31 個(gè)下調(diào)的circRNA（fold-change≥1.5，P＜0.05）（圖2B）。聚類分析顯示這些差異基因可以明顯的區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖2C）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)這些circRNA 對(duì)應(yīng)的染色體位置（圖3A）。通過(guò)對(duì)circRNA 的長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)主要以0～1 000 nt 小分子量circRNA 占多數(shù)，高峰主要位于500 nt 左右（圖3B、C）；其次對(duì)circRNA 的種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)以外顯子-外顯子類型的circRNA 占多數(shù)，其次是內(nèi)含子-外顯子類型的circRNA 和內(nèi)含子-內(nèi)含子類型的circRNA（圖3D）；對(duì)構(gòu)成circRNA 的外顯子個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)以3個(gè)外顯子組成的circRNA 占最多數(shù)，其次是2 個(gè)外顯子組成的circRNA、4 個(gè)外顯子組成的circRNA 以及5 個(gè)外顯子組成的circRNA（圖3E）。

圖2 circRNA 的表達(dá)模式Fig 2 The expression pattern of circRNA

圖3 circRNA 的序列分析Fig 3 Sequence analysis of circRNA

2.3 差異基因的GO、KEGG 及Reactome 通路富集分析

對(duì)上訴66 個(gè)差異性表達(dá)的circRNA 進(jìn)行功能、通路富集分析，GO 顯示這些差異基因在生物過(guò)程方面主要涉及在GTP 酶活性的調(diào)節(jié)（P＜0.001）、小GTP 酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)（P＜0.001）及GTP酶活性的正向調(diào)節(jié)（P＜0.001）等；細(xì)胞組成方面主要涉及在核斑點(diǎn)（P=0.016）、血液微粒（P=0.005）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（P=0.035）等；分子功能方面主要涉及在GTP 酶監(jiān)管活動(dòng)（P＜0.001）、GTP 酶激活活動(dòng)（P＜0.001）及鳥嘌呤核苷酸交換因子活性（P=0.012）（圖4A）。KEGG 分析顯示主要涉及在補(bǔ)體系統(tǒng)（P=0.002）、mRNA 監(jiān)測(cè)通路（P=0.003）及血小板激活通路（P=0.005）等（圖4B）。Reactome 分析顯示主要涉及在RHO GTP 酶周期（P=0.008）、CDC42 GTP 酶周期（P=0.001）及RAC1 GTP 酶周期（P=0.002）等（圖4C）。這提示差異性表達(dá)的circRNA 可能通過(guò)上訴功能、分子機(jī)制參與肝癌的發(fā)生。

圖4 差異基因的功能、通路富集分析Fig 4 Functional and pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

2.4 差異基因的翻譯潛能預(yù)測(cè)評(píng)估

為了獲得可翻譯的circRNA，對(duì)上訴66 個(gè)差異基因進(jìn)行翻譯潛能預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)共有17 個(gè)基因可與TransCirc 和riboCirc 數(shù)據(jù)庫(kù)共交集（圖5），同時(shí)對(duì)這些circRNA 進(jìn)行IRES、m6A 位點(diǎn)及ORF 個(gè)數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示hsa_circ_0000231、hsa_circ_0000417、 hsa_circ_0000745、 hsa_circ_0005455、hsa_circ_0000847、 hsa_circ_0005552、 hsa_circ_0060849、 hsa_circ_0008234、 hsa_circ_0075796、hsa_circ_0001742 及hsa_circ_0001686 共11 個(gè)基因編碼潛能評(píng)分最顯著且均大于0.9 分，見(jiàn)表2。

圖5 差異基因與TransCirc 和riboCirc 數(shù)據(jù)庫(kù)取交集基因的韋恩圖Fig 5 Venn diagram of differentially expressed genes intersecting with TransCircle and riboCircle databases

表2 17 個(gè)circRNA 的翻譯潛能評(píng)估Tab 2 The evaluation of translation potential of 17 circRNAs

2.5 11個(gè)circRNA在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步篩選出更具有意義的差異表達(dá)基因，用10 對(duì)肝癌和癌旁組織對(duì)上述11 個(gè)基因進(jìn)行qPCR 試驗(yàn)，結(jié)果顯示，hsa_circ_0000231、hsa_circ_0005552、hsa_circ_0000847 及hsa_circ_0000745 共4個(gè)基因在肝癌中高表達(dá)（P＜0.05；W 分別=39；45；49；41）（圖6A）；而hsa_circ_0008234 和hsa_circ_0060849 呈低表達(dá)（P＜0.05；W 分別是-55；-37 ），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B）。

圖6 編碼潛能評(píng)分最顯著且均大于0.9 分的11 個(gè)基因在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)情況Fig 6 The expression of the 11 genes with the most significant coding potential score and all scores greater than 0.9 in liver cancer and adjacent tissues

3 討論

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，circRNA 多有報(bào)道調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期及分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，在肝癌的增值、侵襲及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移起著重要作用［24］。在circRNA 編碼多肽方向，肝癌中僅有兩例報(bào) 道 ，β-catenin 基 因 來(lái) 源 的 Circβ-catenin（circ0004194，2-7 外顯子反向拼接，約1 129 nt），其主要存在細(xì)胞胞漿中，與β-catenin mRNA 的表達(dá)水平呈正相關(guān)的關(guān)系。Circβ-catenin 可編碼蛋白β-catenin-370aa，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GSK3β 并抑制其磷酸化后β-catenin 的降解，促進(jìn)Wnt/β-catenin 通路的不斷活化，形成“正反饋“效應(yīng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和轉(zhuǎn)移［25］。由ARHGAP35 基因2-3 外顯子來(lái)源的circARHGAP35 在HCC 組織中表達(dá)顯著升高，定位于胞質(zhì)中且與ARHGAP35 mRNA 表達(dá)水平相反，circARHGAP35 可通過(guò)m6A 介導(dǎo)的翻譯起始，翻譯一種1289aa 的蛋白，與TFII-I 相互作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移侵襲［26］。本研究基于RNA-seq技術(shù)結(jié)合circRNA 翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)共發(fā)現(xiàn)17 個(gè)具有豐度可觀、表達(dá)差異且潛在編碼潛能的circRNA，對(duì)這些基因進(jìn)一步分析IRES 元件、m6A 位點(diǎn)及ORF 序列預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示11 個(gè)circRNA（hsa_circ_0000231、hsa_circ_0000417、 hsa_circ_0000745、 hsa_circ_0005455、 hsa_circ_0000847、 hsa_circ_0005552、hsa_circ_0060849、 hsa_circ_0008234、 hsa_circ_0075796、hsa_circ_0001742 及hsa_circ_0001686）編碼潛能最顯著，提示這些circRNA 可能通過(guò)編碼多肽在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

對(duì)上訴11 個(gè)具有編碼潛能的circRNA 進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000231、hsa_circ_0005552、hsa_circ_0000847 及hsa_circ_0000745 在肝癌中呈高表達(dá)，而hsa_circ_0008234 和hsa_circ_0060849 呈低表達(dá)。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000745和hsa_circ_0000847 和hsa_circ_0008234 在肝癌中有直接性報(bào)道，有研究表明，hsa_circ_0000745 的同源基因circ-SPECC1 通過(guò)海綿miR-33a 調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激下TGFβ2 和自噬，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖［27］。此外，hsa_circ_0000745 在其他惡性腫瘤中也有涉及，其通過(guò)降低E-cadherin （E-cad）表達(dá)來(lái)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［28］。有學(xué)者指出，hsa_circ_0000847 直接靶向miR-135a 來(lái)促進(jìn)p-p38、p-ERK 和p-JNK 的表達(dá)，從而進(jìn)一步激活MAPK 通路加快調(diào)控肝癌細(xì)胞的發(fā)展［29］。有趣的是，另有研究報(bào)道，hsa_circ_0000847 的同源基因circSMAD2在HCC 中顯低表達(dá)，通過(guò)靶向miR-629 抑制HCC細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT［30］。這種表達(dá)相反的結(jié)果可能與人類HCC 組織的個(gè)體差異和小樣本量有關(guān)，這需要進(jìn)一步評(píng)估。值得注意的是，有多項(xiàng)研究表明，hsa_circ_0008234 在腫瘤組織高表達(dá)，這與qPCR 檢測(cè)結(jié)果有差異，這可能與腫瘤的異質(zhì)性有密切聯(lián)系，需要進(jìn)一步深入研究。其中，hsa_circ_0008234 的同源基因circ-FOXP1 可通過(guò)作為ceRNA 調(diào)控miR875-3p/miR-421 軸從而導(dǎo)致HCC 的惡性生物學(xué)行為［31］。此外，在結(jié)腸癌中，hsa_circ_0008234 通過(guò)miR-338-3p/ETS1/PI3K/AKT 軸促進(jìn)細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)［32］。 hsa_circ_0000231 和hsa_circ_0005552 在其他系統(tǒng)惡性腫瘤中均有涉及，包括結(jié)腸癌、膀胱癌及宮頸癌等［33-35］。例如，hsa_circ_0000231 可通過(guò)IGF2BP3/miR - 375 雙通路上調(diào)CCND2 促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，一方面作為miR-375 的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA 促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D2（CCND2），另一方面與IGF2BP3 蛋白結(jié)合阻止CCND2 降解［33］。同時(shí)，有的研究表明，hsa_ circ_0000231 的同源基因circARHGAP12 通過(guò)m6a 依賴性IGF2BP2/FOXM1 通路在宮頸癌進(jìn)展中發(fā)揮致癌作用［34］。與此同時(shí)，hsa_circ_0005552 的同源基因EHBP1 在膀胱癌中通過(guò)miR-130a-3p/TGFβR1/VEGF-D 信號(hào)軸促進(jìn)膀胱癌的淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移［35］。然而，hsa_circ_0060849 及其同源基因circRNA 在惡性腫瘤中均未見(jiàn)報(bào)道。此circRNA 是否在惡性腫瘤尤其肝癌中扮演著重要角色，參與腫瘤生物學(xué)過(guò)程，尚不清楚，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

本研究仍存在一些不足，首先測(cè)序樣本量較少，意味著結(jié)果具有一定的假陽(yáng)性。其次，本研究依賴于circRNA 翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)去篩選可編碼基因，一些未被數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的circRNA 而實(shí)際上具有編碼潛能基因被忽視。未用大量組織樣本去驗(yàn)證這些基因的差異性表達(dá)，且這些差異性circRNA 功能上是否具有生物學(xué)意義，后續(xù)將進(jìn)一步探索。

綜上，研究初步表明6 個(gè)circRNA 在肝癌中具有高的翻譯潛能且存在差異性表達(dá)，相關(guān)性研究，值得進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

林熊：實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫；褚鳳冉、曹智、葉妃：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；武金才、陳家誠(chéng)：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、經(jīng)費(fèi)支持；劉路政：研究設(shè)計(jì)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。