雞腎型傳染性支氣管炎病毒分離與鑒定

于逢強(qiáng) 王春華

摘要：山東龍口地區(qū)某雞場相繼發(fā)生以白色水樣痢疾、迅速消瘦、采水量增加為主要臨床特征的疾病，通過采集病料接種雞胚傳代培養(yǎng)后分離到一株毒株，對該毒株進(jìn)行血凝試驗、NDV干擾試驗、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗及雛雞回歸試驗研究。結(jié)果表明，經(jīng)過持續(xù)的雞胚傳代，第3代開始形成蜷縮胚，第5代蜷縮的胚胎達(dá)到50%；第3代到第5代的尿囊液經(jīng)過1%胰蛋白酶進(jìn)行處理后具備了血凝性；該分離株在干擾實驗中很大程度影響了NDV在雞胚中的增殖；在雛雞回歸試驗中，試驗雛雞感染了分離的病毒后，致死率為60%，發(fā)病率可以達(dá)到100%；感染雞出現(xiàn)斑駁腎等病理變化，實驗結(jié)果充分表明分離到的病毒為雞腎型IBV。

關(guān)鍵詞：雞；腎型IBV毒株；分離鑒定

雞腎型傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，NIB）是由嗜腎型傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性、高致死性、接觸傳染的呼吸道傳染病[1]，該病血清型多，主要分為呼吸型、腎型、腸型、肌型，以雞腎型IBV最為常見[2]。所有年齡的雞均易感IBV，6周齡以下雛雞中更為明顯，主要感染途徑是空氣傳播。該病發(fā)病急，潛伏期較短，約為1～2d，病雞主要表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽、頻繁打噴嚏，大量流鼻液，雞腎型IBV疾病的雞由于腎臟腫脹，還會產(chǎn)生尿酸濃度高的沉淀癥狀[3-4]。雞腎型IBV毒力的強(qiáng)弱、免疫抗體效價高低、雞舍內(nèi)的日常飼養(yǎng)及管理方法等因素影響該病雞同時表現(xiàn)了不同嚴(yán)重程度上的多種臨診和癥狀，有表現(xiàn)的程度比較的嚴(yán)重，有出現(xiàn)的則比較輕微[5-6]。IBV頻繁發(fā)生對養(yǎng)雞業(yè)造成了極大的損害，它已成為我國和世界其他地區(qū)養(yǎng)雞業(yè)中最嚴(yán)重的家禽傳染病之一，通過分離鑒定IBV不僅是確診該病的有效方法，也為該毒株在該地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查提供數(shù)據(jù)監(jiān)測[7]。

本文通過研究山東省龍口地區(qū)某養(yǎng)雞場病雞的死亡原因，從病死雞的腎臟、肝臟和其他組織中獲得并鑒定病毒株，經(jīng)病毒分離、血凝試驗、干擾試驗、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗和回歸試驗，最終分離出的病毒為雞腎型IBV，為該地區(qū)雞腎型IBV的發(fā)現(xiàn)和防治提供依據(jù)和參考，對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料

1）主要試劑。滅菌生理鹽水、雙抗（青霉素、鏈霉素）、卡那霉素均購自外圣中醫(yī)藥科技（煙臺）有限公司，胰蛋白酶溶液（1%）、NDV弱毒苗、IBV標(biāo)準(zhǔn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

2） 儀器與設(shè)備。恒溫生化培養(yǎng)箱（LHS-100CB一恒儀器）、臺式離心機(jī)（LXJ-4）、冰箱（BCD-329WDVL海爾）、組織搗碎機(jī)（德國Qiagen公司）、超凈工作臺（USA Forma Scientific）、照蛋器。

3） 試驗動物。9～11日齡的SPF雞胚，3周齡的SPF雛雞均購于山東某實驗動物繁育有限公司。

4）病料采集。無菌采集具有典型癥狀的病雞腎、肺、喉頭氣管、肝等組織，放入雙抗和卡那霉素的PBS溶液的10 mL EP管中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

1） 病料處理。將病料放組織搗碎機(jī)研磨，制成1∶5的混懸液，-20 ℃與37 ℃間反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2） 雞胚接種與傳代。取病料處理液，接種至9～11日齡SPF雞胚的尿囊腔中，每胚接種0.2 mL，共接種10胚，同時另設(shè)接種生理鹽水對照組2胚，同步放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。每隔6～8 h照蛋一次，丟棄24 h內(nèi)的死胚，并按實驗室生物安全規(guī)定處理；收集72 h后的死胚和部分活胚的尿囊液再接種至9日齡SPF雞胚的尿囊腔中，其余活胚繼續(xù)孵育至17日齡后放入4 ℃冰箱中完全冷凍，仔細(xì)觀察并記錄雞胚病理生理變化，盲傳五代。

3） 血凝試驗。將收集的尿囊液分別以3 000 r/min的相同速度離心10 min，去除后用注射器注入乳清液中。第一次，提前加入1%的血清胰蛋白酶。第二次是在經(jīng)過高溫滅菌或同樣滅菌處理的無菌鹽水溶液中。該株在37 ℃水浴中煮沸約2 h后，用微量法測定全血清RBC凝集值。樣本中存在所有細(xì)胞凝集的病毒血清的最高溶液稀釋度用于計算含有病毒樣本的血清中RBC細(xì)胞的總凝集量。

4）干擾試驗。將10日齡的SPF雞胚分成四組，每組5個胚。第一組經(jīng)尿囊腔接種E5代病毒液0.2 mL/個；第二組接種NDV弱毒株疫苗0.2 mL/個；第三組在第1組基礎(chǔ)上，10 h后接種NDV弱毒株疫苗0.2 mL/個；第四組接種0.2 mL/個無菌生理鹽水作為實驗對照組。同步放置37 ℃孵育72 h，無菌收取尿囊液，并測定各組NDV的HA滴度。

5） 瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗。采用常規(guī)7孔方法，外環(huán)標(biāo)記1-6編號，中間孔加標(biāo)準(zhǔn)IBV抗原，編號1加健康雞血清，編號3、5、6加入病雞血清，編號2、4加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清至滿，放37 ℃的恒溫箱中48 h，觀察并記錄每天的情況變化。

6）雛雞回歸試驗。將20只3周齡SPF雛雞分為兩組。第一組為實驗組，第二組為對照組。第一組先通過眼睛、鼻腔和口腔接種第5代SPF雞胚尿囊液，第二組接種等量的滅菌生理鹽水。觀察并記錄雞的臨床反應(yīng)和癥狀，對死亡雞剖檢，觀察病理變化并記錄。

3 結(jié)果與分析

1）雞胚接種情況。將病料處理后接種雞胚盲傳5代，連續(xù)觀察雞胚的發(fā)育情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1代（E1）無明顯病變，第3代（E3）開始形成蜷縮胚，第5代（E5）蜷縮的胚胎達(dá)到50%，且雞胚死亡數(shù)增加，病變明顯。

2） 血凝試驗結(jié)果。分離毒株尿囊液的血凝價為0，但使用1%胰蛋白酶處理之后，分離毒株的血凝價為6 log2，對照組雞胚的尿囊液血凝價為2 log2。試驗結(jié)果表明，分離到的病毒自身并沒有血凝性，然而使用1%的胰蛋白酶處理后，該病毒則具備了血凝性。

3）干擾NDV試驗情況。經(jīng)試驗，結(jié)果如表2顯示，第一組只接種病毒液及第四組只接種無菌生理鹽水作為實驗對照組的血凝價均為20；第二組只接種NDV弱毒株疫苗血凝價為28～29；第三組接種病毒液及NDV弱毒株疫苗，血凝價為23～24。試驗結(jié)果表明，分離到的疑似雞腎型IBV的病毒很大程度上影響到了NDV在雞胚中的增殖，具有明顯的抑制作用，該現(xiàn)象為IBV特有。

4） 瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原之間形成沉淀線，與陽性對照沉淀線連接良好，試驗結(jié)果呈陽性。

5） 雛雞回歸試驗結(jié)果與分析。攻毒試驗3 d后，對照組均未見異常，試驗組雛雞開始出現(xiàn)臨床呼吸道癥狀，包括頻繁咳嗽、打噴嚏和啰音。無精打采，飲水增加，精力不足，經(jīng)常拉白或水樣便，消瘦，羽毛蓬松等。尸體解剖后，病死雞腎臟腫脹大出血，呈“斑點腎”樣，腎小管和輸尿管內(nèi)有大量尿酸鹽沉淀，并有不同程度的擴(kuò)張。以上糖尿病的臨床特征和病理改變均以死雞腎型IBV感染為特征。

4 討論

近年來，雞腎型傳染性氣管炎病毒已成為家禽重要致病源之一。全球?qū)υ摬《镜膭討B(tài)監(jiān)測研究也持續(xù)開展[8]，自1936年該病原被發(fā)現(xiàn)以來，在世界各地已分離上百毒株IBV，共有30多種血清型，并不斷有新的血清型被發(fā)現(xiàn)，其血清型眾多、臨床癥狀復(fù)雜，交叉保護(hù)性低，變異株不斷出現(xiàn)等問題，是IB防制工作的難點[9]。本文根據(jù)臨床癥狀分離獲得地區(qū)性流行的IBV，并對流行毒株進(jìn)行病理性、免疫性研究，為IB臨床治療措施提供更豐富的理論依據(jù)，也可為研制IB疫苗或抗病毒藥物提供新的思路。

本研究在雞群發(fā)病，根據(jù)臨床初步診斷，疑似雞傳染性支氣管炎后，采集病料經(jīng)雞胚接種盲傳、血凝試驗、NDV干擾試驗、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗及雛雞回歸試驗研究確認(rèn)分離獲得一株腎型傳染性支氣管炎病毒。該毒株雞胚傳至E3代出現(xiàn)胚體發(fā)育受阻，出現(xiàn)蜷縮胚的現(xiàn)象，傳至E5代蜷縮的胚胎達(dá)到50%。用E5代病毒液感染SPF雞可表現(xiàn)與自然發(fā)病雞相似的臨床癥狀，同時病理變化呈現(xiàn)腎臟腫脹大出血，呈“斑點腎”樣，腎小管和輸尿管內(nèi)有大量尿酸鹽沉淀，具有典型的腎型IBV特征，但該毒株的更多血清型和免疫原性有待進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

由于IBV的多型性和可變異性，給本病的有效防治帶來了不少困難。目前尚未有該病的特效療法的報道[10]，因此重視早期防控干預(yù)，關(guān)注地區(qū)的流行情況，通過加強(qiáng)對雞群的飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格衛(wèi)生消毒，完善生物安全體系是預(yù)防雛雞腎型傳染性支氣管炎的關(guān)鍵；同時做好雞傳染性支氣管炎疫苗免疫，對雞腎型IBV高發(fā)地區(qū)，可提前1日齡免疫，使雛雞盡早產(chǎn)生抗體，并適宜增加免疫次數(shù)，增強(qiáng)雛雞抗體保護(hù)；對發(fā)病雞群及時隔離治療，必要時進(jìn)行淘汰，避免更大的經(jīng)濟(jì)損失。

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[10] 于柳.一例雛雞腎型傳染性支氣管炎的防治[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2017（4）：94.