豬流行性腹瀉疫苗研究進(jìn)展

吳鈺宸 曹劍 孫彥軍 劉強(qiáng)德 張常鎖 賀筍

摘要：豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和高死亡率為特征，多發(fā)生于豬的初生、斷奶、育肥等重要階段。目前，世界各國都已將該病作為豬病的重點(diǎn)防控對象，我國也將其列為重大動(dòng)物疫病之一，采取了嚴(yán)格的免疫程序以控制該病，疫苗是防控本病最重要的手段。本文就近年來豬流行性腹瀉疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為該病的防控提供參考。

關(guān)鍵詞：豬；豬流行性腹瀉；疫苗；研究進(jìn)展

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種病毒性疾病[1]。PEDV主要感染豬腸道，引起豬的腹瀉、嘔吐、食欲不振等癥狀。PEDV可通過糞便、呼吸道分泌物等途徑傳播，病毒顆粒在環(huán)境中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，容易在豬場等集約化養(yǎng)殖場所傳播。PEDV對幼豬的影響尤其嚴(yán)重，感染后的幼豬易出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀，病死率較高[2]。

PEDV最初于1971年在英國被發(fā)現(xiàn)，后在歐、美、亞洲等地區(qū)均有分布。近年來，PEDV在中國大陸等地區(qū)暴發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對PEDV的疫苗已經(jīng)開發(fā)出來，但是PEDV的變異性較大，疫苗的研發(fā)和應(yīng)用仍面臨一定的挑戰(zhàn)。本文通過對豬流行性腹瀉病毒的病毒學(xué)特征、流行病學(xué)特點(diǎn)以及疫苗研究最新的研究進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)綜述，以期能為該病的防控及疫苗研發(fā)等工作提供一個(gè)理論參考。

1 PEDV

PEDV是一種單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科，α-冠狀病毒屬。其病毒粒子形態(tài)呈圓形或多邊形，直徑范圍為90～190 nm，平均直徑130 nm。PEDV的病毒粒子由四個(gè)主要結(jié)構(gòu)組成，分別是外膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）和纖突蛋白（S蛋白）。PEDV對于外界的抵抗力相對較弱，對氯仿乙醚等敏感，酸堿、甲醛、脂溶劑等消毒劑都可輕松將其殺滅。

2 流行病學(xué)

豬流行性腹瀉主要通過口鼻分泌物、糞便等途徑傳播。最早于1971年在英國被發(fā)現(xiàn)，目前已在全球多個(gè)地區(qū)流行。其主要感染幼豬，成年豬一般不易感染，但對于未感染過的成年豬，也存在一定的感染風(fēng)險(xiǎn)。具有高度的傳染性，病毒顆粒可以通過空氣、食物、水、器具等多種途徑傳播，其中最主要的傳播途徑是直接接觸感染和糞-口傳播。PED發(fā)病率和死亡率很高，仔豬病毒感染后，出現(xiàn)急性腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。對豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)樗粌H會(huì)導(dǎo)致豬只死亡，還會(huì)導(dǎo)致生長發(fā)育受阻、飼料利用率下降等問題，從而影響豬只的生產(chǎn)效益。

3 豬流行性腹瀉病毒疫苗研究相關(guān)進(jìn)展

3.1 傳統(tǒng)疫苗

1）滅活疫苗。通過將病原體滅活后制成的，因此不會(huì)引起疾病，但可以刺激豬體內(nèi)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，從而在接觸到真正的病原體時(shí)提供保護(hù)作用。該疫苗通常在豬的幼年時(shí)期接種，可以有效地預(yù)防豬流行性腹瀉的發(fā)生。2016年，利用PEDV韓國流行毒株KNU-141112生產(chǎn)制造的滅活疫苗，通過妊娠母豬產(chǎn)前6周、3周進(jìn)行肌肉注射免疫后，利用強(qiáng)毒毒株進(jìn)行激發(fā)后，仔豬的存活率達(dá)到92%，仔豬腹瀉減少[3]。鄭培等[4]研究表明，采取在母豬產(chǎn)前30和15d進(jìn)行免疫后，母豬的血清及初乳中可以產(chǎn)生高水平且穩(wěn)定的IgG、IgA特異性抗體以及中和抗體，對于仔豬的保護(hù)效果顯著。

2）減毒活疫苗。該疫苗是通過將豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行減毒處理，制成的一種活疫苗。通過將豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行體外培養(yǎng)和多次傳代，減弱其病原性，使其仍然能夠在宿主體內(nèi)產(chǎn)生免疫效應(yīng)，但不會(huì)引起嚴(yán)重的疾病反應(yīng)。減毒活疫苗接種后，病毒能夠在豬體內(nèi)復(fù)制，引起一定的免疫反應(yīng)，從而使豬體內(nèi)產(chǎn)生針對病毒的特異性免疫反應(yīng)，形成免疫保護(hù)，預(yù)防豬流行性腹瀉的發(fā)生和傳播。其具有高效保護(hù)、安全性高、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)、方便易用等優(yōu)勢。Deng等[5]通過誘導(dǎo)干擾素早期I型和Ⅲ型的轉(zhuǎn)錄激活過程，將PEDV EndoU中226點(diǎn)位上的組氨酸（H）突變?yōu)楸彼幔ˋ），其病毒的毒力明顯削弱。

3.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗與傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗比較，其最大的優(yōu)點(diǎn)就是安全性較高，抗原成分清晰、沒有引起機(jī)體不良反應(yīng)的其他抗原，其還有生產(chǎn)成本低廉、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。但是缺點(diǎn)也同樣明顯，疫苗抗體水平較低、免疫原性較弱，保護(hù)期較短[6]。亞單位疫苗免疫原性水平較低的問題可通過與佐劑或者免疫增強(qiáng)劑聯(lián)合使用提高免疫原性水平[7]。

Hou等[8]利用乳酸桿菌表達(dá)PEDV-N蛋白，結(jié)果表明，能夠刺激仔豬腸道黏膜產(chǎn)生高水平的黏膜IgA和循環(huán)IgG對PEDV抗原N的免疫反應(yīng)。Zhao等[9]利用不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了部分PEDV S蛋白，通過口服、肌肉注射等不同免疫方式給小鼠或豬進(jìn)行免疫，均能表達(dá)出高水平的抗體。郭濤[10]構(gòu)建重組表達(dá)菌株，通過包涵體形式表達(dá)出大小約為35 kDa的重組PEDV COE蛋白，通過口服的方式免疫仔豬后，在糞便和唾液中只能檢測到低水平的特異性sIgA抗體，但是通過肌肉注射的方式進(jìn)行免疫，能夠刺激仔豬血清中的IgG明顯升高。

3.3 核酸疫苗

目前各種疫苗都有其優(yōu)缺點(diǎn)，滅活疫苗的研發(fā)周期相對較短，但疫苗的免疫原性較差。減毒活疫苗的免疫原性良好，但研發(fā)周期較長。然而，PEDV的基因組一直在發(fā)生著變異，此時(shí)就需要一種安全性高、成本低、研發(fā)周期短以及設(shè)計(jì)簡單的疫苗。核酸疫苗應(yīng)運(yùn)而生，其中包括DNA疫苗和mRNA疫苗。根據(jù)Naik[11]書中所寫，疫苗研制平臺(tái)一旦建立，其相互通用，只需要將有效的中和抗原基因序列合成并插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，就有可能在短時(shí)間內(nèi)開發(fā)出針對新暴發(fā)、大規(guī)模流行性傳染病的疫苗。Yin等[12]構(gòu)建了共表達(dá)PoRV VP7蛋白和PEDV S蛋白的DNA疫苗，小鼠經(jīng)過免疫后，出現(xiàn)高水平的免疫應(yīng)答。目前，核酸疫苗在新冠疫情的過程中大規(guī)模應(yīng)用，其抗體產(chǎn)生快、保護(hù)率高、對變異毒株也能有效保護(hù)等優(yōu)勢已經(jīng)顯現(xiàn)，相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，mRNA技術(shù)的進(jìn)步，核酸疫苗在獸用疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用指日可待。

3.4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將特定病原體的抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞中，使植物細(xì)胞能夠表達(dá)出相應(yīng)的抗原蛋白，從而制造出具有免疫作用的疫苗。相比傳統(tǒng)疫苗制造方法，轉(zhuǎn)基因植物疫苗具有生產(chǎn)成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)、保存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)勢。其不僅可以單獨(dú)使用引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，也可以與常規(guī)疫苗聯(lián)用，達(dá)到加強(qiáng)免疫的效果[13]。Tien等[14]利用PEDV核心中和表位（COE）制作一種的PEDV候選疫苗，將COE連接到聚合免疫球蛋白G支架（PIG）上，并在煙草植物中得到表達(dá)。小鼠免疫試驗(yàn)證明可誘導(dǎo)全身和黏膜抗原特異性免疫反應(yīng)。Egelkrout等[15]表達(dá)了含有PEDV S1纖突蛋白的玉米，并與載體蛋白大腸桿菌熱不穩(wěn)定亞基（LTB）和樹突狀細(xì)胞（DC）結(jié)合肽融合，抗原水平高于20 mg/kg。豬口服給藥可誘導(dǎo)血清中和抗體，可用于飼料中。

4 總結(jié)與展望

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們對PEDV的認(rèn)識不斷深入，也使PEDV疫苗的研發(fā)取得了很大的進(jìn)展。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，將會(huì)有更多新型疫苗在動(dòng)物上進(jìn)行試驗(yàn)研究。但是由于PEDV在世界范圍內(nèi)流行時(shí)間較長，已有的疫苗在不同地區(qū)或國家的適應(yīng)性、保護(hù)效果和安全性等方面存在差異，所以對于PEDV的研究仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。另外，病毒感染后機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)變化很大，因此單一蛋白或者單一基因工程亞單位疫苗無法解決所有問題。在今后的研究中，將會(huì)結(jié)合基因工程、蛋白質(zhì)工程和納米生物技術(shù)等手段對病毒蛋白或基因進(jìn)行改造和優(yōu)化，進(jìn)一步提高疫苗免疫效果和安全性。另外，滅活疫苗雖然有較好的安全性、有效性和免疫原性，但是它仍然存在一些缺陷和不足之處。因此，研究開發(fā)新型疫苗將成為今后PEDV研究的熱點(diǎn)。目前，PEDV滅活疫苗仍存在以下問題：①由于目前的滅活苗沒有針對病毒變異株的新型佐劑，所以保護(hù)效果較差；②滅活苗制備過程中，會(huì)有較多的毒素和雜質(zhì)進(jìn)入疫苗中，導(dǎo)致疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定；③滅活苗不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這是因?yàn)闇缁蠲绲目乖刻?，無法刺激動(dòng)物產(chǎn)生足夠的抗體；④滅活苗只能提供細(xì)胞免疫應(yīng)答，而細(xì)胞免疫應(yīng)答往往不足以抵抗病毒感染。

此外，PEDV疫苗研制應(yīng)考慮以下問題：①豬只接種疫苗后產(chǎn)生抗體需要一定時(shí)間，所以應(yīng)根據(jù)豬只不同生長階段制定合理的免疫程序；②接種疫苗后產(chǎn)生抗體是機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的基礎(chǔ)，因此需要加強(qiáng)對抗體水平的監(jiān)測和對抗體消長規(guī)律的研究；③PEDV病毒株變異較快，所以疫苗需要定期更換；④現(xiàn)有疫苗都是滅活疫苗，所以需要開發(fā)和研究新型的佐劑及佐劑載體以提高疫苗免疫效果；⑤滅活苗需要在低溫環(huán)境下保存和運(yùn)輸，而疫苗穩(wěn)定性對于動(dòng)物來說非常重要，因此需要對疫苗保存條件進(jìn)行研究。

總之，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)理論在PEDV研究中的不斷深入應(yīng)用，PEDV研究也必將會(huì)取得更多更好的進(jìn)展。相信在不久的將來，在大家共同努力下PEDV一定會(huì)被有效控制。但由于PEDV的復(fù)雜性和多樣性以及人們對其認(rèn)識上的局限性，還需要更多高質(zhì)量、安全有效、低成本和易推廣應(yīng)用的PEDV疫苗。

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