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    基于UPLC-Q-TOF MS 鑒定復方香薷水化學成分

    2024-04-23 17:14:20林結玲遆慧慧
    分析測試學報 2024年4期
    關鍵詞:香薷分子離子醛酸

    林結玲,周 熙,趙 昕,遆慧慧*

    (1.廣東藥科大學 藥學院,廣東 廣州 510006;2.廣東省科學院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心),廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室,廣東省中藥質量安全工程技術研究中心,廣東 廣州 510070)

    復方香薷水是一種中藥復方制劑,源于宋朝《太平惠民和劑局方》經典驗方香薷飲,由9 種單味藥材組成,分別為生姜、木香、歪葉藍、皺葉香薷、廣藿香、紫蘇葉、厚樸、豆蔻、甘草,其中皺葉香薷為君藥,廣藿香、紫蘇葉為臣藥,甘草、生姜為使藥[1]。復方香薷水臨床療效確切,可有效治療暑濕感冒、胃腸型感冒、急性胃腸炎、風寒感冒等疾?。?]。復方香薷水現(xiàn)有研究多集中于臨床療效評價,其化學成分研究匱乏,同時活性成分及其作用機制不明確,質量標準控制單一,如謝婷[3]開發(fā)的一種測定復方香薷水中木香烴內酯、麝香草酚、去氫木香內酯、香荊芥酚和迷迭香酸含量的方法。然而中藥復方具有多成分多靶點的特征,單一成分含量表征難以全面反映復方香薷水的整體質量,因此,復方香薷水的物質基礎研究對闡明其藥理藥效和質量控制具有重要意義。

    超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF MS)是常用于中藥復方定性、定量分析的儀器,具有分離效果好、靈敏度高、準確度高與特異性強等優(yōu)點,可用于中藥復方的物質基礎、成分含量、血清藥物化學、藥代動力學以及代謝組學等多方面研究[4-5]。本研究基于UPLC-Q-TOF MS 技術對復方香薷水進行定性分析,并對鑒定成分進行藥材歸屬,為其質量控制指標篩選、安全性評價以及藥效物質基礎研究提供了理論依據(jù)。

    1 實驗部分

    1.1 儀器、材料與試劑

    UPLC-Q-TOF MS儀,配備電噴霧離子源,紫外檢測器,以及數(shù)據(jù)處理工作站Mass Hunter 10.0(美國Agilent 公司);KQ2200 型機械超聲波清洗器(東莞市超聲波設備有限公司);電子天平(美國Sartorious公司)。

    對照品:鳥苷、水蘇堿、咖啡酸購自中國食品藥品檢定研究院;迷迭香酸、原兒茶素、木犀草素-7-葡萄糖醛酸、維采寧-2、7-羥基香豆素、新甘草苷、芹菜素-7-葡萄糖醛酸、新異甘草苷購自成都瑞芬思生物科技有限公司;木犀草素-7-二葡萄糖苷酸購自上海源葉生物科技有限公司;木犀草苷、芹菜素、甘草酸、紫丁香苷、丹參素、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、檸檬酸、L-焦谷氨酸、甘草苷、異綠原酸C 購自上海詩丹德生物技術有限公司;蘋果酸購自壇墨質檢科技有限公司。所有對照品的純度均大于98%。

    甲醇、乙醇、乙腈(色譜純,德國Merck 公司);甲酸(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);二次蒸餾水(中國香港屈臣氏公司)。

    復方香薷水及其單味藥材生姜、木香、歪葉藍、皺葉香薷、廣藿香、紫蘇葉、厚樸、豆蔻、甘草購自廣州一品紅制藥有限公司。

    1.2 樣品制備

    復方香薷水單味藥材粉碎過篩,各取0.5 g 至20 mL 50%甲醇水溶液,超聲30 min,離心(時間:10 min,轉速:10 000 r/min,溫度:20 ℃),取上清液過濾裝瓶。復方香薷水用50%甲醇稀釋10倍。

    取上述對照品各稱取10 mg左右加入到10 mL容量瓶中,再加入50%甲醇溶解并定容至刻度線,作為對照品儲備液。其中同分異構體綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸和甘草苷、異甘草苷、新甘草苷、新異甘草苷分別稀釋成1 mg/L的單標,其他的標樣制成1 mg/L的混標。

    1.3 色譜-質譜條件

    色譜條件:色譜柱為Agilent Phe Hex(150 mm×2.1 mm,1.9 μm);0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動相;梯度洗脫:0~5 min,5%~10% B;5~20 min,10%~30% B;20~35 min,30%~40% B;35~55 min,40%~60% B;55~60 min,60%~75% B;60~65 min,75% B,體積流量為0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量1 μL。

    質譜條件:UPLC-Q-TOF MS/MS系統(tǒng),配置ESI 離子源。毛細管電壓為1000V,霧化氣壓0.24 MPa,干燥氣流速8 L/min,干燥氣溫度300 ℃。在正、負離子模式下采集數(shù)據(jù),碰撞能量為10、20、40 eV,一級質譜掃描范圍:m/z100~1000,二級質譜掃描范圍:m/z40~1000。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    對于有對照品的化學成分,通過比對對照品的保留時間、精確質量數(shù)和二級質譜圖等信息進行確認。對于無對照品的化合物,采用Mass Hunter 10.0 軟件提取其一級精確質量數(shù)、二級碎片,結合Pubchem 與安捷倫中藥化合物質譜數(shù)據(jù)庫以及查閱文獻進行定性分析。對存在于總離子流圖(TIC 圖),但在數(shù)據(jù)庫上找不到匹配的化合物,可通過分子式以及二級離子碎裂規(guī)律推測其可能結構,結合Pubchem數(shù)據(jù)庫進一步鑒定確認。

    2 結果與討論

    2.1 實驗條件優(yōu)化

    本研究利用現(xiàn)代分析技術,結合數(shù)據(jù)庫和文獻,對復方香薷水的化學成分進行定性分析。實驗前期對前處理和色譜條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化,前處理優(yōu)化包含優(yōu)化溶劑種類,超聲時間以及離心時間;色譜條件則通過優(yōu)化色譜柱、流動相、流動相pH、流速、柱溫及洗脫梯度,篩選出最佳實驗方案。其中溶劑考察了50%甲醇-水、75%甲醇-水及甲醇對分離分析的影響,結果發(fā)現(xiàn),采用50%甲醇稀釋的色譜圖峰信息多、峰響應值高,故選擇50%甲醇作為溶劑。其他優(yōu)化實驗條件見“1.2”和“1.3”。

    2.2 成分分析與鑒定

    采用UPLC-Q-TOF MS 技術,在優(yōu)化后的儀器條件下對復方香薷水稀釋液進行分析,Mass Hunter 10.0軟件處理采集數(shù)據(jù),得到其正、負離子模式下的TIC圖(見圖1)。最終鑒定出112個化合物,包含25個對照品的確認。其中黃酮類22個,苯丙素類20個、有機酸18個、萜類14個、生物堿11個、氨基酸5個以及其他類型化合物22個(見表1)。

    表1 UPLC-Q-TOF MS 技術鑒定復方香薷水中的化學成分Table 1 Identification of chemical constituents from Fu Fang Xiang Zuo Shui by UPLC-Q-TOF MS 12

    圖1 復方香薷水的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Fu Fang Xiang Zuo Shui

    2.2.1 黃酮類化合物黃酮類是皺葉香薷、廣藿香和紫蘇葉的重要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗抑郁、抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)和α-葡萄糖苷酶活性等藥理作用[6-8]。黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為基本母核的一類化合物,包含黃酮苷元與黃酮苷。本研究從復方香薷水中共鑒定出22個黃酮類化合物,根據(jù)結合的糖數(shù)量可以分為苷元、單糖苷、雙糖苷。這些化合物主要以芹菜素木犀草素和甘草素為苷元,與葡萄糖、葡萄糖醛酸或芹糖結合成糖苷。

    2.2.1.1 黃酮苷元 黃酮苷元質譜特征碎片產生主要是由于C 環(huán)發(fā)生斷裂(逆-狄爾斯-阿德爾反應),繼續(xù)丟失中性片段CO(28 u)、CO2(44 u)、H2O(18 u)形成。例如峰85 的準分子離子峰為m/z287.0555[M+H]+,分子式為C15H10O6,失去一個水分子得到碎片離子m/z269.0483[M+H-H2O]+,失去一個CO 后得到m/z241.0559[M+H-H2O-CO]+。C 環(huán)發(fā)生斷裂,生成特征碎片m/z135.0437[M+HC7H4O4]+和m/z153.0179[M+H-C8H5O2]+,再失去CO、H2O 小分子生成離子碎片m/z125.0240[M+HC8H5O2-CO]+和m/z117.0344[M+H-C7H4O4-H2O]+。根據(jù)對照品保留時間、分子離子峰、二級特征碎片對比確認,確定該峰為木犀草素,其裂解規(guī)律如圖2所示。

    圖2 木犀草素的質譜裂解規(guī)律Fig.2 Fragmentation process of luteoli

    2.2.1.2 黃酮單糖苷 復方香薷水的黃酮單糖苷是O-苷類化合物,在正離子模式下糖基易斷裂生成豐度較高的苷元。如峰65、67、84 的準分子離子峰都為m/z463.088 5,分子式為C21H18O12,失去葡萄糖醛酸基(176 u),產生特征碎片m/z287.053 9[M+H-C6H8O6]+,通過文獻[9-10]和數(shù)據(jù)庫對比初步鑒定為木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷或其同分異構體,經過對照品比對最終確定峰65、67、84為野黃芩苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷和木犀草素-3'-葡萄糖醛酸苷。

    峰60、63、79、83在負離子模式下準分子離子峰為m/z417.118 8,推測其分子式為C21H22O9。4個化合物的裂解情況相同,先丟失一個葡萄糖苷基C6H10O5(162 u),生成高豐度碎片離子m/z255.066 1[M-H-C6H10HO5]-,再發(fā)生RDA 裂解,生成黃酮類特征碎片m/z119.050 2 和m/z135.009 0[M-HC6H10HO5-C8H9O]-,結合文獻和數(shù)據(jù)庫推測其為甘草苷或其同分異構體[11],通過與對照品對比最終確定峰60、63、79、83分別為新甘草苷、甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷,裂解規(guī)律見圖3。

    圖3 甘草苷的質譜裂解規(guī)律Fig.3 Fragmentation process of liquiritin

    2.2.1.3 黃酮雙糖苷 本研究共鑒定出甘草苷元-7-O-D-芹糖-4'-O-D-葡萄糖苷、夏佛托苷、芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷、芹菜素-7-二葡萄糖醛酸和木犀草素7-二葡萄糖苷酸5 個黃酮雙糖類物質。黃酮雙糖苷的取代主要發(fā)生在6、7 和8 位,包含五碳糖和六碳糖,裂解方式主要為連續(xù)丟失糖基,形成豐度較高的苷元,如峰61在正離子模式下準分子離子峰為m/z623.124 8,連續(xù)丟失兩個葡萄糖醛酸基,生成m/z447.097 6[M+H-C6H8O6]+、m/z271.060 0[M+H-C6H8O6-C6H8O6]+,根據(jù)碎裂規(guī)律推測和對照品對比確認該峰為芹菜素-7-二葡萄糖醛酸,裂解規(guī)律如圖4所示。

    圖4 芹菜素-7-二葡萄糖醛酸的質譜裂解規(guī)律Fig.4 Fragmentation process of apigenin-7-diglucuronide

    2.2.2 苯丙素類化合物苯丙素是由苯環(huán)和三個直鏈碳連接在一起為結構單元(C6-C3)的化合物,包含苯丙酸、香豆素和木質素類[12],該類化合物易丟失CO、CO2、H2O 小分子。本研究共鑒定出20 個苯丙素類化合物,其中迷迭香酸、厚樸酚、7-羥基香豆素、咖啡酸、綠原酸、丹參素、隱綠原酸、新綠原酸等化合物經對照品對比得到確認。如峰26在負離子模式下的準分子離子峰為m/z353.087 5,分子式均為C16H18O9。在碰撞能作用下酰氧鍵易斷裂,丟失C9H6O3、C7H10O5片段,生成m/z191.054 4[M-HC9H6O3]-和m/z179.033 9[M-H-C7H10O5]-二級碎片,繼續(xù)丟失一分子CO2生成135.045 7[M-H-C7H10O5-CO2]-,經過與對照品的保留時間和二級碎片規(guī)律對比,鑒定出該化合物為新綠原酸,質譜裂解規(guī)律如圖5所示。峰33、37與26分子式相同,且二級碎片的碎裂規(guī)律相同,推測為同分異構體,經過對照品對比確認峰33為綠原酸,峰37為隱綠原酸。

    圖5 迷迭香酸的質譜裂解規(guī)律Fig.5 Fragmentation process of rosmarinic acid

    峰72經過與對照品的保留時間和二級碎片對比,確認該峰為迷迭香酸。迷迭香酸是紫蘇葉的重要活性成分,具有抗過敏、抗氧化、抗抑郁、鎮(zhèn)驚等作用。該化合物在負離子模式下準分子離子峰為m/z359.078 0,預測分子式為C18H16O8。在碰撞能作用下,生成m/z197.045 3[M-H-C9H6O3]-、m/z179.034 6[M-H-C9H8O4]-,前者丟失-COO 和H2O形成m/z135.045 1[M-H-C9H6O3-COO-H2O]-,后者丟失一分子H2O后生成m/z161.024 1[M-H-C9H8O4-H2O]-(如圖6)。

    圖6 新綠原酸質譜裂解規(guī)律Fig.6 Fragmentation process of neochlorogenic acid

    2.2.3 萜類化合物本研究共鑒定出14 個萜類化合物,其中半萜類3 個,三萜皂苷類11 個,半萜類化合物來自木香,三萜皂苷類化合物來自甘草,萜類化合物易丟失糖基和中性小分子。如峰103,其在正離子模式下的準分子離子峰為m/z823.412 2,分子式C42H62O16,裂解途徑如圖7。先丟失葡萄糖醛酸基和中性小分子H2O,生成碎片m/z647.378 8[M-C6H8O6+H]+、m/z471.343 8[M-2C6H8O6+H]+、m/z453.335 6[M-2C6H8O6-H2O+H]+,質譜信息經文獻[13]及對照品對比,確定該峰為甘草酸(如圖7)。

    圖7 甘草酸的質譜裂解規(guī)律Fig.7 Fragmentation process of glycyrrhizic acid

    2.2.4 有機酸類化合物本研究從復方香薷水中共鑒定出有機酸類成分18個,包含蘋果酸、檸檬酸、原兒茶酸、丁香酸、茉莉酸等。該類化合物主要丟失H2O、HCOOH 等中性分子或COO 基團[14]。如峰23 在負離子模式下準分子離子峰為m/z153.018 9,推測其分子式為C7H6O4,二級碎片為m/z109.029 4[M-H-COO]-、m/z108.022 2[M-H-COOH]-、m/z91.018 8[M-H-COO-H2O]-,與文獻[15]和對照品的碎裂規(guī)律一致,確定該峰為原兒茶酸(如圖8)。

    圖8 原兒茶酸的質譜裂解規(guī)律Fig.8 Fragmentation process of protocatechuic acid

    2.2.5 生物堿類化合物本研究共鑒定出了11 種生物堿,包含甜菜堿、水蘇堿、木蘭花堿、牛心果堿、巴婆堿、葫蘆巴堿等,該類化合物主要在正離子模式下響應。在碰撞能作用下,含氮雜環(huán)易開裂,丟失CH3、CO 等中性小分子[16]。以峰34 為例,準分子離子為m/z342.170 6,推測其分子式為C20H24NO4+。在能量碰撞下,含氮雜環(huán)發(fā)生兩種開裂,一種生成m/z45.057 1 和m/z297.111 4[MC2H7N]+碎片,后者丟失-CH3或者-OCH4,生成m/z265.086 2[M-C2H7N-CH4O]+和m/z282.087 2[MC2H7N-CH3]+;另一種環(huán)開裂生成m/z72.080 9 和m/z271.095 7[M-C4H10N]+,前者再丟失CH2,生成特征碎片m/z58.064 9,經過與對照品對比后,確認該成分為木蘭花堿,其質譜裂解規(guī)律見圖9。

    圖9 木蘭花堿的質譜裂解規(guī)律Fig.9 Fragmentation process of magnolflorine

    復方香薷水由生姜、木香、歪葉藍、皺葉香薷、廣藿香、紫蘇葉、厚樸、豆蔻和甘草9 種單味藥材組成,其成分種類包含黃酮類、苯丙素類、有機酸、萜類、生物堿、氨基酸類。中藥復方成分復雜,作用靶點多樣,因此往往有多種藥理作用[17-21],如復方香薷水中黃酮類成分的木犀草素可通過阻斷核因子kB(NF-kB)磷酸化活性或其信號通路進而抑制內皮細胞VCAM-1的表達,起到抗炎作用[22];苯丙素類的厚樸酚可以促進胃動素和胃泌素分泌,抑制胃腸道平滑肌收縮,對胃排空和胃腸推進運動產生雙向調節(jié)作用[23];萜類的木香烴內酯可以通過調節(jié)Ki67、Bcl-2、Caspase-3、Bax 和PTEN 蛋白的表達,從而誘導結腸癌細胞凋亡,起到抗結腸癌作用[24];黃酮類成分芹菜素、木犀草素、芹苷和木樨草苷等成分對甲型、乙型流感病毒神經氨酸酶有較好的活性抑制[25]。復方香薷水還可用于由新型冠狀病毒肺炎引起的胃腸功能紊亂[26],但是其作用機制尚未明確,因此今后還需要更深入探索其藥效成分以及作用機制。

    3 結 論

    本研究基于UPLC-Q-TOF MS 技術分析鑒定復方香薷水的化學組成成分,最終鑒定出112 個化合物,包含黃酮類22 個,苯丙素類20 個、有機酸18 個、萜類14 個、生物堿11 個、氨基酸5 個以及其他類型化合物22個,并總結了化學成分的質譜碎裂規(guī)律,為其質量控制、安全性評價以及藥效物質基礎提供了科學依據(jù)。

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