太子參脫毒苗培養(yǎng)、化學(xué)成分及指紋圖譜研究進(jìn)展

郭慧慧,蔣元斌,林叢發(fā),徐紹翔,林澤宇,薛立云

(1.寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,福建 寧德 355017;2.福安市康厝鄉(xiāng)鄉(xiāng)村振興服務(wù)中心,福建 寧德 355007)

太子參系雙子葉石竹科孩兒參屬植物[Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Paxex Pax et Hoffm]的干燥塊根,呈細(xì)長紡錘形或細(xì)長條形,表面灰黃色至黃棕色,味甘、性平、微苦,歸脾、肺經(jīng)[1]。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究,太子參含有糖類、環(huán)肽類、微量元素、苷類、氨基酸類等多種化學(xué)成分,這些化學(xué)成分具有增強(qiáng)記憶、免疫調(diào)節(jié)、抗白色念珠菌、抑制食管癌、降血糖、促血管新生等多方面的藥理活性。2002年太子參被國家批準(zhǔn)列入可食用保健食品物品名單[2]。太子參功效逐漸被大眾肯定,多地大力推廣人工栽培,建設(shè)太子參GAP基地。但隨著太子參栽培地區(qū)擴(kuò)大及流通品系增多,亦出現(xiàn)了一些問題,如太子參病毒病呈逐年加重趨勢,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)太子參品種退化[3];品種混亂、內(nèi)在質(zhì)量參差不齊等。針對這些問題,學(xué)者們對太子參脫毒苗培養(yǎng)、化學(xué)成分及指紋圖譜等方面開展了深入研究。本文就其脫毒苗研究、化學(xué)成分研究及指紋圖譜研究報(bào)道予以綜述,以期為太子參的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 太子參脫毒苗研究

1.1 莖尖生長點(diǎn)剝?nèi)∶摱厩o尖脫毒原理是利用病毒在植株體內(nèi)分布的不均勻性,即成熟器官中含量較高,幼嫩器官和莖尖分生組織中含量較少或不含病毒[4]。通常剝?nèi)〉那o尖大小小于0.5 mm。關(guān)于太子參莖尖脫毒技術(shù)學(xué)者們關(guān)注點(diǎn)集中在莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化上,統(tǒng)計(jì)如表1。

表1 太子參莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.2 種胚剝?nèi)∶摱痉N胚剝?nèi)∶摱镜脑硎翘訁⒎N子繁殖不傳播病毒。葉祖云等[8]的研究表明剝?nèi)シN皮和外胚乳的太子參裸胚在培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA中能很快被誘導(dǎo)萌發(fā)生長,萌發(fā)率78.3%。張博等[9]的研究表明太子參種胚在MS+0.1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+4.0 mg·L-12,4-D培養(yǎng)基下愈傷組織誘導(dǎo)率為96.11%,形成的愈傷組織在MS+2.0 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中分化率達(dá)100%,分化出的幼苗壯實(shí)且多。

1.3 超低溫脫毒超低溫脫毒的原理是頂端分生組織細(xì)胞不含病毒且具有細(xì)胞核大、液泡小的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),經(jīng)超低溫處理后,頂端分生組織細(xì)胞能存活,而其他細(xì)胞都會被凍死,病毒亦隨之脫除[10]。與傳統(tǒng)的莖尖脫毒相比,超低溫脫毒具有對所取莖尖大小沒有嚴(yán)格要求及降低了操作難度的優(yōu)點(diǎn)。戴軍等[11]采用超低溫處理1 h,太子參脫毒率可達(dá)90%以上。具體如下:取經(jīng)過表明消毒的1～1.5 mm幼芽接種到MS+140 g·L-1蔗糖固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d,轉(zhuǎn)入MS+140 g·L-1液體固體培養(yǎng)基0 ℃處理40 min,取出莖尖置于冷凍管,迅速丟入液氮保存1 h,隨后取出置于40 ℃水浴解凍1.5 min,即可轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。趙云青等[12]亦采用超低溫脫除太子參蠶豆萎蔫病毒。具體如下:1～2 mm莖尖接種于MS+0.3 mol·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂中4 ℃暗培養(yǎng)1～3 d,隨后將莖尖放入加載液,室溫下加載20～40 min,加載過的莖尖轉(zhuǎn)移到PVS2溶液中(冰上操作,處理30～50 min),接著在鋁箔盒中制作莖尖液滴,制作好后投入液氮處理30 min,再立即進(jìn)行40 ℃水浴化凍處理0.2～1.5 min,0 ℃冰水混合物處理10 min,投入卸載液20 min,最后取出莖尖0 ℃暗培養(yǎng)5～7 d,弱光培養(yǎng)1個(gè)月可獲得再生植株。

1.4 熱處理脫毒熱處理脫毒的原理是高溫可使病毒蛋白變性而失去活性,而寄主植物與病毒耐高溫程度不同,篩選適合的溫度即可達(dá)到脫毒的目的[13]。朱艷等[14]的研究表明熱處理結(jié)合莖尖法脫毒,脫毒率高達(dá)100%。具體如下:取莖尖分生組織誘導(dǎo)的已分化出3～4片葉的組培苗,轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上,38 ℃、1 000 lx下連續(xù)培養(yǎng)30 d。

2 化學(xué)成分研究

太子參主要含糖類、環(huán)肽類、微量元素、苷類、氨基酸類、揮發(fā)油類、甾醇類、酚類、油脂類、生物堿類、磷脂類等多種化學(xué)成分[15-17]。以往的文獻(xiàn)已對太子參化學(xué)成分進(jìn)行了詳細(xì)的歸納和總結(jié),但鮮有太子參單一化學(xué)成分的藥理活性及其合成影響因素的總結(jié)報(bào)道。近年來學(xué)者們對太子參化學(xué)成分藥理活性的探討主要集中在太子參多糖和太子參環(huán)肽B上。下文將對太子參多糖和環(huán)肽B的藥理活性及其含量影響因素進(jìn)行歸納總結(jié)。

2.1 太子參多糖太子參多糖的相對分子質(zhì)量為3.0～212.0 kDa,主要由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等單糖組成[18]。目前太子參多糖的提取主要有以下5種方法[19-24]:①水提醇沉法;②超聲提取法;③超高壓技術(shù)提取法;④蒸汽爆破技術(shù)提取法;⑤酶提取法。以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn),大規(guī)模生產(chǎn)建議使用水提醇沉法或酶提取法。檢測方法通常采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖計(jì)多糖得率?，F(xiàn)代藥理研究表明太子參多糖具有以下生物活性。

2.1.1 免疫調(diào)節(jié)作用謝美林等[25]的研究表明太子參多糖對LPS(脂多糖)誘導(dǎo)損傷的Raw 264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)巨噬細(xì)胞有保護(hù)作用,表現(xiàn)為提高細(xì)胞存活率及改善細(xì)胞形態(tài)。喬石等[26-30]的研究表明太子參多糖對環(huán)磷酰胺(CY)造成的免疫抑制小鼠具有提高其免疫功能作用,具體表現(xiàn)為注射太子參多糖的小鼠免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM 和細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的含量顯著升高,改善因 CY 所致小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的降低,調(diào)節(jié)小鼠脾細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,降低脾淋巴細(xì)胞的凋亡。曾麗等[31]的研究表明,太子參多糖能在一定程度上提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖水平、NK細(xì)胞殺傷活性,調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平等,從而能在一定程度上提高小鼠對抗原卵清白蛋白的免疫應(yīng)答能力,表現(xiàn)出一定的佐劑作用。

2.1.2 降糖作用Liu等[32]的研究表明太子參多糖可通過抑制2型糖尿病大鼠空腸RORγ蛋白的表達(dá)和增加Foxp3蛋白,進(jìn)而恢復(fù)STZ誘導(dǎo)的T輔助因子17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)細(xì)胞失衡,從而維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。王林莉等[33]的研究表太子參多糖具有促進(jìn)高血糖大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合的藥效。徐先祥等[34]的研究表明太子參多糖能明顯改善糖尿病小鼠抗氧化功能,保護(hù)胰腺。

2.1.3 其他作用Yang等[35]的研究表明太子參多糖可通過被動擴(kuò)散及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入Caco-2細(xì)胞。Pu等[36]的研究表明太子參多糖可將M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為M1型,從而在體外促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;作用機(jī)制為太子參多糖PHP-1被TLR4受體識別,促進(jìn)Ca2+釋放,并激活NF-κB和MAPK信號通路以重置M2型巨噬細(xì)胞。此外太子參多糖還具有改善記憶、保護(hù)心肌等[37-38]作用。

2.2 太子參環(huán)肽B太子參環(huán)肽B是一種環(huán)狀八肽,由肽鍵和8個(gè)L-氨基酸[cyclo-(gly-gly-leu-pro-pro-pro-ile-phe)]組成的單環(huán)[39]。與其他植物環(huán)肽相比,具有在植物體中含量大、結(jié)構(gòu)明確、原植物易得等特點(diǎn)。Morita等[40]的研究表明太子參環(huán)肽B是由核糖體合成和翻譯后修飾肽(RiPP)衍生自前體基因prePhHB編碼的前體肽,環(huán)肽B的核心肽序列是太子參中的IFGGLPP。目前對太子參環(huán)肽B的提取主要有以下3種方法:①甲醇提取法[41];②乙酸乙酯提取法[42];③乙醇熱回流提取[43]。其中最常用的是甲醇提取法,檢測方法通常采用高效液相色譜法?，F(xiàn)代藥理研究表明太子參環(huán)肽B具有以下生物活性。

2.2.1 增強(qiáng)記憶作用楊志友等[44]的研究表明太子參環(huán)肽B可促進(jìn)大腦皮層神經(jīng)元突起再生,保護(hù)Aβ誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元丟失和突起萎縮;增強(qiáng)注射Aβ-42的阿爾茨海默病(AD)小鼠的記憶恢復(fù),并可調(diào)節(jié)脾臟輔助性T細(xì)胞,改善神經(jīng)炎癥[45];增加海馬中HT的5個(gè)水平,減少前額葉皮層和海馬中多巴胺、二羥苯乙酸和高香草酸的代謝產(chǎn)物,可用于制備防治老年癡呆癥的藥品或保健食品[46]。

2.2.2 抗炎作用鄧音樂等[47]的研究表明太子參環(huán)肽B對白色念珠菌的黏附性和致病性具有很好的抑制作用,在抗白色念珠菌感染藥物開發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。謝海峰等[48]的研究表明太子參環(huán)肽B可顯著改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎;環(huán)肽B通過激活A(yù)MPK顯著改善腸上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài),并重塑腸道微生物群,尤其是提高了黏液阿克曼菌的相對豐度[49],從而起到預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的作用,可用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎疾病的藥物。Yang等[50]的研究表明環(huán)肽B通過P13K/Akt信號通路抑制細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥和凋亡,是治療炎癥性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

2.2.3 抗癌作用Tantai等[51]的研究表明環(huán)肽B通過介導(dǎo)P13K/Akt/β連環(huán)蛋白途徑并調(diào)節(jié)黏附和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)水平,有效抑制人食管癌細(xì)胞的黏附和侵襲。Chen等[52]的研究表明環(huán)肽B抑制食管癌的機(jī)制有兩點(diǎn):①抑制MMP9、MMP2、CCND1、STAT3、CXCR4、BDKRB1、PTGS2等75食管癌靶點(diǎn);②正調(diào)控蛋白質(zhì)水解、膠原蛋白分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)分解、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、胞漿鈣離子濃度等生物過程。

2.2.4 其他作用太子參環(huán)肽B還具有降血糖、減少皮膚中的黑色素、促進(jìn)血管新生等作用。Morita等[53]的研究表明從太子參中提取和鑒定到的太子參環(huán)肽 B,可以通過抑制酪氨酸酶的合成減少皮膚中的黑色素。林少兵[54]的研究表明太子參環(huán)肽B有明顯促進(jìn)血管新生作用。Liao等[55-56]的研究表明環(huán)肽B可通過抑制二肽基肽酶4(DPP-4),減緩GLP-1降解;同時(shí)可作為激動劑刺激GLP-1R促進(jìn)胰島素分泌,從而起到降血糖的作用。謝海峰等[57-58]的研究表明環(huán)肽B可通過抑制TGF-Smad2/3信號和AMPK介導(dǎo)的STING信號,顯著改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化,可用于制備治療肺纖維化疾病的藥物。

2.3 太子參多糖與環(huán)肽B含量的影響因素太子參多糖及環(huán)肽B含量不同產(chǎn)區(qū)差異較大,這與其生長環(huán)境、生長發(fā)育狀態(tài)及人為等因素密切相關(guān)。

在生長環(huán)境方面,康傳志等[59]的研究表明太子參多糖及環(huán)肽B與土壤中有效鉀、銨態(tài)氮、速效磷及Cu、B、Zn、Pb、Cr元素?zé)o顯著相關(guān)性。彭益書等[60]的研究表明太子參環(huán)肽B含量與種植土壤Ca、Cd、Mg含量及pH呈正相關(guān),與種植土壤Rb、Mn呈負(fù)相關(guān)。馬陽等[61]的研究表明氣候因子中月最低氣溫、月平均空氣濕度、月降水量以及年降水量是影響太子參指標(biāo)成分含量的主導(dǎo)因素,其中月最低氣溫與環(huán)肽B呈正相關(guān);年降水量與多糖含量呈正相關(guān),卻與環(huán)肽B呈負(fù)相關(guān)?？祩髦镜萚62]的研究表明太子參多糖并不是氣候主導(dǎo)型的代謝物質(zhì);而環(huán)肽B含量與降水量相關(guān),其含量總體呈現(xiàn)從東南向西北先升高后減低的趨勢,與全國降水量變化情況相一致。

在生長發(fā)育方面,太子參多糖及環(huán)肽B含量與采收時(shí)間、采收部位、種植材料等相關(guān)。吳玉香等[63]的研究表明常規(guī)的太子參多糖積累最佳時(shí)期是6、7月,此段時(shí)間內(nèi)隨著采收期的推遲多糖含量會下降。鄒立思等[64]的研究表明太子參塊根環(huán)肽B含量7月為最高峰,含量為311.895 μg·g-1。陳傳藝等[65]的研究表明貴陽太子參種子種植的多糖含量為42.61%,低于塊根種植的多糖含量(47.53%);而環(huán)肽B含量卻高于塊根種植的,種子種植的環(huán)肽B含量為0.0240%,塊根種植的環(huán)肽B含量為0.0217%。陳前鋒等[66]表示太子參須根亦具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其從中分離到4個(gè)環(huán)肽類化合物,分別為pseudostellarin L、heterophyllin B、pseudostellarin B、pseudostellarin C。朱宏濤等[67]的研究表明太子參組培苗環(huán)肽B含量為492.33 μg·g-1組培苗干重。

在人為因素方面,包含栽培模式及加工貯藏方法。在栽培模式方面,吳紅淼等[68]的研究表明連作會干擾太子參的代謝過程,而菌肥修復(fù)可有效改善重茬太子參品質(zhì);菌肥改良組多糖含量與正茬組無顯著性差異,約為30 mg·g-1;環(huán)肽B含量(約15 μg·g-1)顯著低于正茬組(約24 μg·g-1),但顯著高于重茬組(約8 μg·g-1)。曾麗娜[69]的研究表明陰坡上種植的太子參各有效藥用成分的含量均高于陽坡,具體為陽坡多糖含量是陰坡的82.5%,環(huán)肽B含量是陰坡的95.9%,總皂苷含量是陰坡的56.2%;玉-參、稻-參、豆-參3種輪作模式下環(huán)肽B含量均低于正茬,但高于重茬,分別為重茬含量的1.18倍、1.16倍和1.12倍;稻-參輪作多糖含量僅次于正茬,約為正茬的85.65%,是重茬含量的1.52倍。在加工貯藏方面,眾多學(xué)者的研究皆表明陰干有利于太子參多糖和環(huán)肽B的保留:徐榮等[70]采用陰干、曬干、微波真空干燥、遠(yuǎn)紅外干燥等13種方式對太子參新鮮塊根進(jìn)行干燥,結(jié)果表明太子參粗多糖含量在16.29%～26.73%之間,其中陰干處理太子參多糖含量為26.73%,顯著高于其他干燥方式;環(huán)肽B含量為0.020 7%,亦為最高;羅文敏等[71]采用傳統(tǒng)加工、現(xiàn)代恒溫烘干及變溫烘干等12種方法加工太子參,結(jié)果表明傳統(tǒng)加工方法環(huán)肽B含量在0.017%～0.025%之間,現(xiàn)代烘干方法環(huán)肽B含量在0.015%～0.027%之間,其中陰干處理環(huán)肽B含量為0.0251%,位于第三,次于70～110 ℃(環(huán)肽B含量為0.0268%)及70～90 ℃(環(huán)肽B含量為0.0254%)處理。強(qiáng)靜等的研究表明隨著貯藏時(shí)間延長,多糖含量降低,其選取不同貯藏時(shí)間的樣品2005-09-27、2006-04-25、2006-10-25、2007-04-25,經(jīng)檢測多糖含量分別為17.42%、17.13%、16.76%、16.27%[72]。

3 指紋圖譜研究

3.1 基于液相色譜的指紋圖譜高效液相色譜法具有操作簡便、靈敏度高、效率高及速度快等特點(diǎn),在中藥指紋圖譜中被廣泛應(yīng)用。太子參高效液相色譜檢測波長通常為203 nm;流動性為乙腈-水梯度洗脫;色譜柱為C18;柱溫則根據(jù)檢測環(huán)境溫度選擇25、30 ℃;流速為0.8、1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量10、20 μL。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,學(xué)者們通常將高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用,以達(dá)到對復(fù)雜體系定性和定量分析的目的。近年來學(xué)者們針對太子參塊根、飲片、顆粒等材料,采用高效液相色譜及相關(guān)技術(shù)建立了相應(yīng)的指紋圖譜,具體見表2。

表2 基于液相色譜的太子參指紋圖譜

3.2 基于毛細(xì)管電泳的指紋圖譜高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是一種基于不同質(zhì)荷比的離子在同一電場下遷移速度不同的分離手段,具有分離效率高、析速度快等特點(diǎn)[78]。李文龍等[78-79]應(yīng)用該技術(shù)建立了江蘇、福建、安徽、貴州、湖南、浙江、山東的太子參指紋圖譜。

3.3 基于氣相色譜及紅外光譜的指紋圖譜劉訓(xùn)紅等[80]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對江蘇、福建、貴州、安徽的太子參揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析,結(jié)果表明含有12個(gè)共有峰,占揮發(fā)性總成分的80%左右。這12個(gè)物質(zhì)分別為吡咯、己醛、糠醛、糠醇、2-戊基呋喃、3-呋喃甲基乙酸酯、4-丁基-3-甲氧基-2,4-環(huán)己二烯-1-酮、4-丁基-3-甲氧基-2-環(huán)己烯1-酮、未鑒定A、2-環(huán)己烯-1-醇-苯甲酸酯、未鑒定B、正-十六烷酸。萬忠民等[81]采用傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR)建立了太子參 FTIR 指紋圖譜,該圖譜能區(qū)分栽培品和野生品的差異。

4 結(jié)語

隨著分析技術(shù)的進(jìn)步太子參化學(xué)成分被逐漸挖掘出來,藥理作用也越來越清晰,越來越被人們看好,并大力推廣種植。但存在以下問題:①在化學(xué)成分研究上,關(guān)于它們的合成和基因表達(dá)機(jī)制尚不明確[15];②在種植上,太子參自人工種植以來,極大地減少了太子參野生資源的壓力,緩解了太子參野生資源緊缺的問題,滿足了市場的需求。但人工種植過程中以太子參塊根進(jìn)行無性繁殖,病毒可經(jīng)無性繁殖材料一代一代在塊根中積累,病毒病已成為危害太子參生產(chǎn)的重要病害。目前關(guān)于太子參病毒病的防治有兩種方法:第一種方法是化學(xué)防治,鄭明強(qiáng)等[82]的研究表明抗病毒1號復(fù)配劑在防控已經(jīng)發(fā)生的病毒病及提升產(chǎn)質(zhì)量具有顯著效果。姚永松[83]的研究表明病毒病初期可用平平佳粉劑600倍液+營養(yǎng)增效劑100倍液進(jìn)行防治;第二種方法是控制種苗傳毒,即使用脫毒苗,雖然目前已建立成熟的太子參脫毒繁育體系,但在生產(chǎn)上沒有形成完整的產(chǎn)業(yè)體系;③在指紋圖譜研究上,雖然相關(guān)研究較多,亦未形成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。未來在這些問題上需要更深層次的研究,以逐步形成標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的種植技術(shù)方案,明確太子參活性物質(zhì)的分子調(diào)控模式,完善太子參內(nèi)在質(zhì)量評測指標(biāo),為太子參在食品、保健食品和藥品等方面的開發(fā)與利用提供參考。