核轉(zhuǎn)錄因子κB家族蛋白及HPV E6/E7 mRNA與早期宮頸癌復(fù)發(fā)的關(guān)系

孫曉娟 周高英 王羽

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染會導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病風(fēng)險顯著增加，宮頸鱗狀上皮細(xì)胞受HPV感染后癌基因E6/E7能持續(xù)表達(dá)［1］，因此HPV E6/E7 mRNA水平常作為宮頸癌發(fā)生的可靠預(yù)測指標(biāo)。HPV在宮頸癌術(shù)后仍可能持續(xù)感染［2］，HPV E6/E7表達(dá)水平是否能對宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)產(chǎn)生影響尚需要研究。研究證實(shí)，系統(tǒng)慢性炎癥參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，HPV感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)［3-4］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factorκB，NF-κB）是免疫炎癥信號通路的關(guān)鍵因子，c-Rel、p65、p50是NF-κB的主要成員，參與細(xì)胞增殖、遷移等多種生物學(xué)作用，其在肺癌［5］、前列腺癌［6］等多種惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平異常升高，可能參與癌細(xì)胞惡性進(jìn)展，但NF-κB家族成員與早期宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系尚不明確。本研究通過檢測不同程度宮頸病變及宮頸癌患者NF-κB家族c-Rel、p65、p50核表達(dá)及HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平，旨在探討其與宮頸病變及宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年12月在開灤總醫(yī)院婦產(chǎn)科接受宮頸癌根治術(shù)的163例早期宮頸癌患者為研究對象，設(shè)為宮頸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷明確為宮頸癌［7］；②首診，術(shù)前未接受新輔助治療；③國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）［8］分期I～I(xiàn)Ia期；④能夠耐受手術(shù)，接受根治性子宮切除術(shù)、盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)治療；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病者；②合并嚴(yán)重心、肝、腎臟功能障礙者；③慢性肝炎、艾滋病等活動期傳染病者；④圍術(shù)期死亡者；⑤轉(zhuǎn)移性宮頸癌者。另收集醫(yī)院同期收治的101例非宮頸癌患者的臨床資料，設(shè)為非宮頸癌組，根據(jù)病理結(jié)果分為3個亞組：對照組（子宮肌瘤患者，n=31）、低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（low-grade squa-mous intraepithelial lesion，LSIL）組（n=26）、高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）組（n=44）。宮頸癌組與非宮頸癌組基線資料匹配（P＞0.05）。見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批（16051907）。

表1 兩組基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族核表達(dá)檢測 ①免疫組化法測定轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族（c-Rel、p65、p50）表達(dá)情況：取4組患者的宮頸組織石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片（厚度5 μm），經(jīng)脫蠟、水化后，置0.3%過氧化氫滅活，室溫放置30 min，山羊血清封閉，滴加1∶200稀釋的鼠抗人c-Rel、p65、p50（美國Abcam），4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白G二抗（美國Abcam）室溫孵育，DAB顯色、復(fù)染、封片，光鏡下觀察，二抗及顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。②讀片：由兩名對病理結(jié)果不知情的專家獨(dú)立閱片，若有分歧則協(xié)商一致；由于核轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞質(zhì)中的染色缺乏特異性，本研究僅對細(xì)胞核染色情況做出判定。③評分標(biāo)準(zhǔn)［9］：以著色程度與著色范圍兩方面評分的乘積作為最終積分，其中著色程度為無、輕度、中度、強(qiáng)，著色范圍：＜5%、≥5%～＜25%、≥25%～＜75%、≥75%，分別記為0～3分，將最終積分0分定義為陰性，1～4分為弱陽性，＞5分為強(qiáng)陽性。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA表達(dá)檢測 應(yīng)用專用刷于宮頸外口取宮頸組織標(biāo)本，采用支鏈DNA擴(kuò)增技術(shù)，嚴(yán)格按照HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒（蒂亞生物技術(shù)有限公司）說明書操作檢測HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)，以＜1拷貝/毫升定義為陰性，≥1拷貝/毫升為陽性［10］。

1.2.3 隨訪 以門診為主，輔助電話、短信、住院等，隨訪頻率為術(shù)后1年內(nèi)3個月1次，之后半年1次。懷疑復(fù)發(fā)者經(jīng)CT/MRI、病理學(xué)檢查證實(shí)，以隨訪日期截止或出現(xiàn)失訪、復(fù)發(fā)為終點(diǎn)事件。截止隨訪日期為2022年7月31日。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料以表示，行t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例或百分比表示，行χ2檢驗(yàn)；以Kaplan-Meier法分析c-Rel、p65、p50及HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與宮頸癌術(shù)后無復(fù)發(fā)生存的關(guān)系，Cox法分析宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-Rel、p65、p50蛋白陽性率及HPV E6/E7 mRNA陽性率比較 宮頸癌組c-Rel、p65、p50及HPV E6/E7 mRNA陽性率均高于非宮頸組（P＜0.05）。見表2。HSIL組c-Rel、p50及HPV E6/E7 mRNA陽性率均高于對照組（P＜0.05），LSIL組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 非宮頸癌3個亞組患者c-Rel、p65、p50蛋白陽性及HPV E6/E7 mRNA陽性情況比較[例（%）]

2.2 各因子在不同臨床病理特征宮頸癌患者中的表達(dá)情況 c-Rel表達(dá)與脈管浸潤程度有關(guān)，p65表達(dá)與FIGO分期、宮旁浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，p50表達(dá)與間質(zhì)浸潤有關(guān)，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與腫瘤直徑、宮旁浸潤及間質(zhì)浸潤有關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 各因子在不同臨床病理特征宮頸癌患者中的表達(dá)情況

2.3 宮頸癌組織c-Rel、p65、p50及HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與復(fù)發(fā)的關(guān)系 163例宮頸癌患者隨訪期間7例失訪，隨訪率95.71%，隨訪時間36（12～75）個月。截至2022年7月，共有32例復(fù)發(fā)。c-Rel陽性患者復(fù)發(fā)26例、失訪5例，c-Rel陰性患者復(fù)發(fā)6例、失訪2例；p50陽性患者復(fù)發(fā)27例、失訪5例，p50陰性患者復(fù)發(fā)5例、失訪2例。Kaplan-Meier法分析，c-Rel、p50陽性患者與陰性患者無復(fù)發(fā)生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)（LogRankχ2=0.820，P=0.367；LogRankχ2=3.181，P=0.075）。見圖1A、1C。

圖1 不同c-Rel、p65、p50、HPV E6/E7 mRNA表達(dá)宮頸癌患者無復(fù)發(fā)生存曲線

p65陽性患者復(fù)發(fā)27例、失訪6例，p65陰性患者復(fù)發(fā)5例、失訪1例；HPV E6/E7 mRNA陽性患者復(fù)發(fā)29例、失訪5例，HPV E6/E7 mRNA陰性患者復(fù)發(fā)3例、失訪2例。Kaplan-Meier法分析，p65陰性患者無復(fù)發(fā)生存率優(yōu)于陽性患者（LogRankχ2=10.597，P=0.001）；HPV E6/E7 mRNA陰性患者無復(fù)發(fā)生存率優(yōu)于陽性患者（LogRankχ2=4.474，P=0.034）。見圖1B、1D。

2.4 宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的Cox回歸分析 以宮頸癌術(shù)后是否復(fù)發(fā)為因變量（否=0，是=1），以年齡（＜46=0，≥46=1）、分娩次數(shù)（＜2=0，≥2=1）、FIGO分期（Ia～I(xiàn)b=0，IIa=1）、病理類型（鱗癌=0，其他=1）、腫瘤直徑（≤4=0，＞4=1）、分化程度（高/中分化=0，低分化=1）、宮旁浸潤（無=0，有=1）、間質(zhì)浸潤（無=0，有=1）、脈管浸潤（＜1/2=0，≥1/2=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無=0，有=1）、術(shù)后輔助治療（有=0，無=1）、c-Rel（陰性=0，陽性=1）、p65（陰性=0，陽性=1）、p50（陰性=0，陽性=1）、HPV E6/E7 mRNA（陰性=0，陽性=1）可能影響宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的因素為自變量進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析（逐步后退法，α進(jìn)=0.05，α出=0.10），單因素Cox回歸分析顯示，F(xiàn)IGO分期IIa期、非鱗癌、低分化、脈管浸潤≥1/2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后未輔助治療、p65陽性、p50陽性、HPV E6/E7 mRNA陽性表達(dá)是宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素（P＜0.05）；進(jìn)一步將上述9個因素納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示FIGO分期IIa期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p65陽性、HPV E6/E7 mRNA陽性可增加宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險（HR=1.617、1.506、3.180、1.460，P＜0.05）。見表5。

3 討論

我國早期宮頸癌在臨床中檢出率逐年升高，但其5年生存率仍較低，宮頸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其治療失敗的重要原因［11］?！案呶PV感染—上皮細(xì)胞癌化”是宮頸病變演變路徑，其中細(xì)胞內(nèi)癌基因E6/E7表達(dá)與此演變路徑密切相關(guān)［12］。有報道稱，E6/E7 mRNA高表達(dá)可增加HSIL宮頸錐切術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，其機(jī)制可能為殘留HPV在宮頸管深部病灶中隱藏，術(shù)后病毒再感染，從而增加局部復(fù)發(fā)風(fēng)險［13-14］。此外，NF-κB家族核表達(dá)是多種惡性腫瘤演變路徑的關(guān)鍵因素。早期宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)已成為棘手問題，但影響其復(fù)發(fā)的危險因素尚未完全統(tǒng)一［15-16］，探討宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的機(jī)制，尋找可靠的早期評估指標(biāo)對延長患者生存期尤為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組c-Rel，p65，p50及HPV E6/E7 mRNA陽性率均高于非宮頸癌組，與對照組相比，HSIL組c-Rel，p50及HPV E6/E7 mRNA陽性率及LSIL組HPV E6/E7 mRNA陽性率均升高，提示NF-κB家族核表達(dá)、HPV E6/E7 mRNA可能參與宮頸病變。Gupta等［17］研究顯示，舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）合并HPV16感染者癌組織中c-Rel、p50上調(diào)，c-Rel與p50形成二聚體，從而增加DNA結(jié)合活性，促進(jìn)TSCC惡性侵襲過程。E6/E7轉(zhuǎn)錄水平是判斷腫瘤惡性程度的重要參考指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，c-Rel表達(dá)與脈管浸潤程度有關(guān)，p65表達(dá)與FIGO分期、宮旁浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，p50表達(dá)與間質(zhì)浸潤有關(guān)。分析原因，E6/E7轉(zhuǎn)錄水平越高，宮頸癌細(xì)胞惡性程度越高，癌細(xì)胞侵襲周圍組織能力越強(qiáng)，導(dǎo)致宮旁浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險越大，F(xiàn)IGO分期越高。本研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA與腫瘤直徑、宮旁浸潤、間質(zhì)浸潤有關(guān)。分析原因，腫瘤直徑越大，提示癌細(xì)胞向病灶旁侵襲的風(fēng)險越高，隨之HPV隱匿性感染病灶殘端的幾率越高［18］。因此，宮頸病變尤其是早期宮頸癌患者術(shù)后治療后，通過觀察HPV消退情況可能作為預(yù)測病灶復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)。

本研究宮頸癌復(fù)發(fā)率19.63%，KAPLAN-MEIER分析顯示，C-REL、P50表達(dá)對無復(fù)發(fā)生存無明顯影響，P65、HPV E6/E7 MRNA陰性患者累計無復(fù)發(fā)生存率分別優(yōu)于P65、HPV E6/E7 MRNA陽性患者，提示p65、HPV E6/E7 mRNA可影響宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)。進(jìn)一步應(yīng)用Cox回歸分析證實(shí)，F(xiàn)IGO分期IIa期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p65陽性、HPV E6/E7 mRNA陽性的確可增加宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。Singh等［19］報道顯示，葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UM）組織發(fā)現(xiàn)NF-κB家族c-Rel、p65、p50蛋白的高核免疫反應(yīng)性，且p65和p50的核免疫反應(yīng)性與UM患者的存活率有關(guān)，但c-Rel與預(yù)后存活無關(guān)，提示p65、p50可能參與UM惡性腫瘤學(xué)行為。有研究顯示，CIN2+/HSIL+較CIN1/LSIL患者HPV E6/E7 mRNA水平更高［20］，與本研究結(jié)果相符，在其研究中另發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA高表達(dá)是預(yù)測錐切手術(shù)失敗（殘留/復(fù)發(fā)）的可靠指標(biāo)，但在LSIL隨訪中未發(fā)現(xiàn)有預(yù)測價值。NF-κB和HPV E6/E7 mRNA高表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)，但其具體機(jī)制尚不明確，國外有研究報道了HPV15型感染能夠干擾人皮膚角質(zhì)細(xì)胞中NF-κB活性［21］；Jia等［22］報道稱HPV感染后可介導(dǎo)NF-κB通路IKB激酶α/β和p65級聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)宮頸癌順鉑耐藥。由此推測，HPV E6/E7 mRNA高表達(dá)可能通過介導(dǎo)p65激活，從而參與宮頸癌預(yù)后轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族核表達(dá)、HPV E6/E7 mRNA表達(dá)在宮頸病變進(jìn)展過程中存在差異，其表達(dá)水平與早期宮頸癌多種病理特征有關(guān)，且p65、HPV E6/E7 mRNA可影響宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)，可作為識別早期宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的可靠參考指標(biāo)。