宏基因組二代測(cè)序在下呼吸道感染患者支氣管肺泡灌洗液中的病原學(xué)診斷價(jià)值

程長(zhǎng)昆 姜長(zhǎng)舟

下呼吸道感染是指喉以下的氣管、支氣管、肺泡等部位發(fā)生的感染性疾?。?］。下呼吸道感染的病原體十分復(fù)雜，以細(xì)菌和真菌為主要致病因素［2］。及時(shí)準(zhǔn)確地鑒定下呼吸道感染的病原體，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥、降低耐藥率、改善患者預(yù)后具有重要意義［3］。目前，臨床上常用的下呼吸道感染病原體檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測(cè)和宏基因組二代測(cè)序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）等［4-7］。近年來(lái)，mNGS在下呼吸道感染的病原學(xué)診斷中逐漸展現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)和潛力［8-10］。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）是利用支氣管鏡對(duì)肺段或亞肺段進(jìn)行灌洗后采集到的肺泡表面液體，是目前最能反映下呼吸道感染的病原體分布情況的標(biāo)本，具有較高的代表性和準(zhǔn)確性［11］。因此，本研究采用mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法對(duì)下呼吸道感染患者BALF中的病原體進(jìn)行分析，探討2種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和一致性，以及mNGS檢出陽(yáng)性與患者臨床指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供有價(jià)值的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2020年4月至2023年3月安慶市望江縣醫(yī)院內(nèi)科130例下呼吸道感染患者的臨床資料。根據(jù)mNGS是否檢出病原體，將患者分為檢出組100例和未檢出組30例。兩組患者年齡、性別和基礎(chǔ)疾病比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。本研究符合倫理原則，經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2023-LC-003）。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲者；②以《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》（第8版）［12］中下呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，包括社區(qū)獲得性肺炎、醫(yī)院獲得性肺炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎等者；③入院后24 h內(nèi)進(jìn)行支氣管鏡檢查并采集BALF樣本者；④BALF樣本同時(shí)進(jìn)行mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位的感染性疾病者；②BALF樣本不符合質(zhì)量要求，如回收率低于30%、細(xì)胞總數(shù)低于104/mL、中性粒細(xì)胞比例高于80%等者；③BALF樣本在運(yùn)輸或保存過(guò)程中發(fā)生污染或損壞者；④患者或其家屬不同意參與本研究者。

1.3 方法 所有患者均在入院后24 h內(nèi)進(jìn)行支氣管鏡檢查，按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序采集BALF樣本，每個(gè)肺段或亞肺段灌注生理鹽水20～40 mL，回收率不低于30%，回收液體立即分裝為2份，一份用于mNGS檢測(cè)，另一份用于常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)。

1.3.1 mNGS檢測(cè) 采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德國(guó)）提取BALF樣本中的總核酸，采用NEBNext Ultra Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美國(guó)）構(gòu)建文庫(kù)，采用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行雙端150 bp高通量測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制、去除人源序列、去除低質(zhì)量序列、去除重復(fù)序列等步驟后，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果確定病原體種類和相對(duì)豐度。設(shè)定檢出閾值為每百萬(wàn)條reads中至少有5條reads與目標(biāo)序列匹配。

1.3.2 常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè) 將BALF樣本接種于血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、MacConkey瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等不同培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，按照常規(guī)方法進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。同時(shí)將BALF樣本接種于液體培養(yǎng)基中，置于自動(dòng)血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)5 d，觀察是否有陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生，如有陽(yáng)性信號(hào)，則進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。另外，將BALF樣本制成涂片，在油鏡下觀察是否有真菌或寄生蟲存在。

1.4 觀察指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)為mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)的陽(yáng)性率、檢測(cè)病原體的分布、病原體檢測(cè)的一致性。次要觀察指標(biāo)為mNGS檢出組和未檢出組患者的臨床指標(biāo)、治療方案、預(yù)后情況及影響mNGS檢出陽(yáng)性的因素。其中，臨床指標(biāo)包括外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清中細(xì)胞因子的濃度。預(yù)后情況包括住院時(shí)間、轉(zhuǎn)入ICU的比例、機(jī)械通氣的比例及病死率等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的一致性采用Kappa系數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，Kappa值在0.01～0.20為無(wú)一致性，0.21～0.40為較低一致性，0.41～0.60為中等一致性，0.61～0.80為較高一致性，0.81～1.00為完全一致性。影響mNGS檢出陽(yáng)性的因素采用logistic多因素回歸分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果比較 mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示，130例下呼吸道感染患者BALF中共檢出病原體100株，未檢出寄生蟲。mNGS檢出陽(yáng)性率為76.9%（100/130）。常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果顯示，130例下呼吸道感染患者BALF中共檢出病原體56株，未檢出非典型病原體和寄生蟲。mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.026，P＜0.001）。見表2。以《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》（第8版）中下呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，分別以常規(guī)培養(yǎng)及mNGS檢測(cè)結(jié)果為檢驗(yàn)變量，繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線。ROC曲線顯示，mNGS檢測(cè)的曲線下面積（area under the curveAUC）為0.84，而常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)的AUC為0.76。見圖1。

圖1 mNGS與常規(guī)培養(yǎng)的ROC曲線分析

表2 mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)的陽(yáng)性率和病原體分布比較

2.3 兩組患者臨床指標(biāo)和預(yù)后比較 mNGS檢出組與未檢出組在外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清中細(xì)胞因子濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。mNGS檢出組患者的住院時(shí)間、轉(zhuǎn)入ICU的比例、機(jī)械通氣的比例、病死率等預(yù)后指標(biāo)均高于未檢出組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者臨床指標(biāo)比較

2.4 影響mNGS檢出陽(yáng)性的多因素logistic回歸分析將mNGS檢出陽(yáng)性作為因變量，將年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清中細(xì)胞因子等作為自變量。連續(xù)變量（年齡、外周血細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清中細(xì)胞因子）以原始數(shù)值表示，二分類變量：性別（0=女性，1=男性）和基礎(chǔ)疾?。?=無(wú)，1=有）。采用逐步回歸法進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，年齡、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白是影響mNGS檢出陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 影響mNGS檢出陽(yáng)性的多因素logistic回歸分析

3 討論

下呼吸道感染是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其病原體復(fù)雜多樣，及時(shí)準(zhǔn)確地鑒定病原體對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥、降低耐藥率、改善患者預(yù)后具有重要意義。本研究采用mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法對(duì)下呼吸道感染患者BALF中的病原體進(jìn)行分析，探討兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和一致性，以及mNGS檢出陽(yáng)性與患者臨床指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供有價(jià)值的參考。

本研究結(jié)果顯示，mNGS檢出陽(yáng)性率高于常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），與張彩霞等［13］的研究結(jié)果一致。這可能與mNGS能夠同時(shí)檢測(cè)樣本中所有類型的核酸序列，從而鑒定出多種已知或未知的微生物有關(guān)，而常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)受限于培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間、抗生素干擾等因素，不能檢測(cè)非培養(yǎng)性或難培養(yǎng)性微生物。

本研究結(jié)果顯示，mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果在細(xì)菌、真菌和非典型病原體方面具有中等一致性（Kappa=0.42～0.54），在病毒和寄生蟲方面具有較低一致性（Kappa=0.12～0.25）。可能與以下原因有關(guān)：①mNGS能夠檢測(cè)出常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)難以發(fā)現(xiàn)的病原體，如非培養(yǎng)性或難培養(yǎng)性微生物、新發(fā)現(xiàn)的微生物等；②mNGS能夠區(qū)分不同菌屬或菌種之間的微小差異，而常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)可能將其歸為同一類；③mNGS可能檢測(cè)到一些非致病性或低致病性的微生物，如皮膚或口腔的正常菌群，而常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)可能忽略其存在；④mNGS可能檢測(cè)到一些已經(jīng)死亡或被抑制的微生物的核酸殘留，而常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)只能檢測(cè)活性的微生物［14-15］。因此，mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果之間存在一定的差異，不能完全替代或否定彼此，而應(yīng)結(jié)合臨床綜合判斷。

本研究結(jié)果顯示，mNGS檢出陽(yáng)性與患者年齡、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白等因素相關(guān)，提示mNGS可作為下呼吸道感染患者病情評(píng)估和預(yù)后判斷的輔助手段。mNGS檢出組患者的外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清中細(xì)胞因子等炎癥指標(biāo)均高于未檢出組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明mNGS檢出陽(yáng)性反映了患者體內(nèi)存在較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)［16-17］。mNGS檢出陽(yáng)性提示患者預(yù)后不良［18-19］。多因素logistic回歸分析顯示，年齡、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白是影響mNGS檢出陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素，表明這些因素與患者體內(nèi)病原體負(fù)荷和感染嚴(yán)重程度有關(guān)［20］。

本研究有以下局限性：①本研究為回顧性對(duì)照研究，存在選擇偏倚和混雜因素的可能；②本研究納入的患者數(shù)量較少，可能影響結(jié)果的穩(wěn)定性和可信度；③本研究未對(duì)mNGS檢測(cè)到的非致病性或低致病性微生物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，可能導(dǎo)致結(jié)果的過(guò)度解釋或誤解。

綜上所述，mNGS在下呼吸道感染患者BALF中的病原學(xué)診斷中具有較高的敏感性和廣譜性，能夠檢測(cè)出常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)難以發(fā)現(xiàn)的病原體，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥和改善患者預(yù)后有重要意義。mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果之間存在一定的差異，不能完全替代或否定彼此，而應(yīng)結(jié)合臨床綜合判斷。