基于臨床療效挖掘和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)驗證的二陳湯治療高脂血癥燥濕化痰功效研究

李榮榮，杜 航，李 航，生立嵩，盧佳寶，劉持年，鄭 暉*，孫 蓉, *

基于臨床療效挖掘和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)驗證的二陳湯治療高脂血癥燥濕化痰功效研究

李榮榮1, 2，杜 航2，李 航2，生立嵩3，盧佳寶4，劉持年1，鄭 暉2*，孫 蓉2, 3*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2. 山東大學(xué)第二醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250033 3. 山東大學(xué)高等醫(yī)學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250012 4. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

采用“系統(tǒng)評價定療效指標(biāo)-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測靶點(diǎn)-交互燥濕化痰類中藥定功效-體內(nèi)驗證療效指標(biāo)和功效靶點(diǎn)”的集成創(chuàng)新策略，解析二陳湯發(fā)揮燥濕化痰功效治療高脂血癥臨床證據(jù)和作用靶點(diǎn)的現(xiàn)代表征關(guān)系。篩選符合納入標(biāo)準(zhǔn)的二陳湯治療高脂血癥臨床隨機(jī)對照研究，抽提與二陳湯燥濕化痰功效密切相關(guān)的臨床證候，繼而開展臨床研究Meta分析。篩選并收集二陳湯和燥濕化痰類中藥活性成分及其對應(yīng)的靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.9.1等軟件構(gòu)建二陳湯燥濕化痰功效的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，將二陳湯燥濕化痰功效的關(guān)鍵靶點(diǎn)與高脂血癥疾病靶點(diǎn)交集，通過Matescape平臺對共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和現(xiàn)代藥效物質(zhì)研究，通過高脂飲食構(gòu)建高脂血癥模型，利用qRT-PCR技術(shù)對二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥的作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗證。Meta分析顯示，二陳湯單獨(dú)或聯(lián)合其他治療在治療高脂血癥患者的總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的療效方面均優(yōu)于對照組。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究得到二陳湯燥濕化痰功效的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)37個，治療高脂血癥涉及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、PPARA等20個關(guān)鍵靶點(diǎn)。GO分析涉及小分子代謝過程的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)等生物過程，KEGG分析涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路和單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路等91條通路。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，二陳湯能夠有效改善高脂血癥大鼠血脂水平（＜0.05、0.01、0.001），上調(diào)高脂血癥大鼠肝臟中和mRNA的表達(dá)（＜0.05、0.001），下調(diào)脂肪組織中mRNA的表達(dá)（＜0.05、0.01）。二陳湯治療高脂血癥時燥濕化痰功效表征為TC、TG、LDL-C水平下降和HDL-C水平升高，功效作用網(wǎng)絡(luò)與PPARG、AKT1、PPARA等多個關(guān)鍵靶點(diǎn)和VEGF信號通路、AMPK信號通路有關(guān)，共同發(fā)揮對脂質(zhì)代謝、脂肪細(xì)胞中脂肪分解調(diào)節(jié)、肝脂調(diào)控等的作用。結(jié)合其功效物質(zhì)基礎(chǔ)分析和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)PPARα和PPARγ是二陳湯發(fā)揮燥濕化痰功效治療高脂血癥的核心靶點(diǎn)。

二陳湯；燥濕化痰；高脂血癥；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；系統(tǒng)評價；橙皮苷；過氧化物酶體增殖物激活受體α；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

高脂血癥指血清中膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）水平升高和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）降低在內(nèi)的各種血脂異常[1]。其發(fā)病與脂質(zhì)來源、脂蛋白合成、代謝過程關(guān)鍵酶異常或降解過程受體通路障礙等相關(guān)。根據(jù)高脂血癥患者的臨床癥狀及體征，本病屬于中醫(yī)的“痰濁”“痰濕”等范疇[2]。

二陳湯源自宋代《太平惠民和劑局方》，因“橘、半二物貴乎陳久爾”（《醫(yī)方考》）而得名。由半夏（湯洗7次）、橘紅、茯苓、甘草（炙）、生姜和烏梅6味中藥組成，具燥濕化痰、理氣和中之功，清代醫(yī)家張璐將其譽(yù)為“治痰之祖方”。

本研究采用Meta分析系統(tǒng)挖掘二陳湯通過燥濕化痰功效治療高脂血癥的臨床有效證據(jù)，明確臨床證候特征和檢測指標(biāo)，用真實世界證據(jù)指導(dǎo)藥理研究。同時將二陳湯和半夏、天南星、佛手、陳皮、橘紅、化橘紅這些經(jīng)典燥濕化痰類中藥的共有靶點(diǎn)進(jìn)行治療高脂血癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[3]研究，預(yù)測二陳湯治療高脂血癥的功效網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制與“燥濕化痰”功效有關(guān)；繼而將預(yù)測靶點(diǎn)與方中藥味成分現(xiàn)代研究數(shù)據(jù)和體內(nèi)實驗相互印證，以證實臨床療效與燥濕化痰功效的對應(yīng)性，力求說清楚、講明白二陳湯“燥濕化痰”治療高脂血癥的安全性、有效性和現(xiàn)代功效表征、功效物質(zhì)以及作用靶點(diǎn)，以期為二陳湯臨床應(yīng)用提供高級別臨床與實驗證據(jù)參考。

1 材料

1.1 動物

36只SFP級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，8周齡，購自北京維通利華有限公司，生產(chǎn)許可證編號SCXK（京）2019-0008。動物飼養(yǎng)室溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～60%，人工照明在明暗之間交替使用（12 h光照/12 h黑暗），動物自由進(jìn)食飲水。動物實驗經(jīng)山東大學(xué)第二醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號HN-IACUC-2022-049）。

1.2 藥材

法半夏（批號211201）、陳皮（批號230402）、茯苓（批號230101）、炙甘草（批號200501）、烏梅（批號221101）購自山東百味堂中藥飲片有限公司，生姜購自世紀(jì)生鮮超市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)孫蓉教授分別鑒定為天南星科植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥塊莖、蕓香科植物橘Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮、多孔菌科真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核、豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖、薔薇科植物梅(Sieb.) Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果實、姜科植物姜Rosc.的新鮮根莖。

1.3 藥品與試劑

辛伐他汀片（批號W014386，10 mg/片）購自杭州默沙東制藥有限公司；對照品橙皮苷（批號K09S11L123847，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；Trizol試劑（批號7E742D3）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號7E703F3）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批號7E750E3）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TG檢測試劑盒（批號A110-1）、TC檢測試劑盒（批號A111-1）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒（批號A113-1）、HDL-C檢測試劑盒（批號A112-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

DS-11型超微量紫外可見分光光度計（美國DeNovix公司）；AL104型萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；TC型基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）；CFX96TM Optics Module（美國Bio-Rad公司）；Agilent 1260 Infinity II型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

2 方法

2.1 二陳湯燥濕化痰治療高脂血癥的療效系統(tǒng)評價

2.1.1 檢索策略 檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)（Wanfang Data）、維普網(wǎng)（VIP）、PubMed、Cochrane圖書館、Embase數(shù)據(jù)庫截至2022年11月有關(guān)二陳湯及其加減方治療高脂血癥的臨床隨機(jī)對照研究文獻(xiàn)。中文檢索詞：二陳湯、二陳湯加減、加味二陳湯、高脂血癥、高血脂、血脂異常、高脂蛋白血癥；英文檢索詞：Erchen Decoction、Hyperlipidemia、Dyslipidemia。

2.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）已公開發(fā)表的隨機(jī)對照試驗（randomized controlled trial，RCT）文獻(xiàn)；（2）明確診斷為高脂血癥的患者，年齡、性別、病例來源、地域、種族不限；（3）治療組治療方式為二陳湯或二陳湯＋常規(guī)治療（常規(guī)治療包括低脂飲食或他汀類臨床有效調(diào)脂藥），對照組常規(guī)治療與治療組均相同；（4）治療組的二陳湯加減方至少含有半夏、陳皮、茯苓、甘草4味中藥；（5）研究至少報告以下結(jié)局指標(biāo)之一：TC、TG、LDL-C、HDL-C。

2.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）無法獲取全文的文獻(xiàn)；（2）信息不完整或有邏輯錯誤的數(shù)據(jù)；（3）非RCT；（4）高脂血癥合并冠心病、非酒精性脂肪肝、甲狀腺功能減退等其他疾病的研究；（5）會議、綜述等論文。

2.1.4 數(shù)據(jù)提取 由2名研究人員根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)篩選和資料提取，若存在意見不一致的情況，將通過討論或第3方意見進(jìn)行協(xié)商解決。主要收集以下信息：作者姓名、發(fā)表年份、研究地點(diǎn)、研究人群、平均年齡、性別、樣本量、干預(yù)措施、干預(yù)持續(xù)時間和結(jié)局指標(biāo)。

2.1.5 文獻(xiàn)質(zhì)量評價 根據(jù)Cochrane協(xié)作評估工具制定的RCT質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)，2名研究人員從選擇偏倚、實施偏倚、測量偏倚、隨訪偏倚、報告偏倚和其他偏倚6個方面評估方法質(zhì)量。

2.1.6 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學(xué)方法 通過Revman 5.4軟件進(jìn)行Meta分析。二分類變量資料采用風(fēng)險比（risk ratio，RR），連續(xù)性變量資料單位相同采用均數(shù)差（mean difference，MD）。當(dāng)各研究間異質(zhì)性不明顯時（2≤50%），采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析；當(dāng)異質(zhì)性較大時（50%＜2≤80%），采用隨機(jī)效應(yīng)模型；當(dāng)異質(zhì)性顯著時（2＞80%），剔除異質(zhì)性較大的文獻(xiàn)，再進(jìn)行分析。

2.2 二陳湯燥濕化痰治療高脂血癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 二陳湯活性成分檢索與篩選 使用TCMSP、TCMID和STITCH數(shù)據(jù)庫，分別以二陳湯中的半夏、橘紅、茯苓、甘草、生姜、烏梅為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索。篩選過程中設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充生姜和烏梅常見成分以獲取二陳湯化學(xué)成分信息；通過UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/），物種選擇“Homo sapiens”，將成分靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱，獲得相關(guān)靶點(diǎn)信息。

2.2.2 燥濕化痰類中藥活性成分檢索與篩選 選擇《中國藥典》2020年版和《中藥學(xué)》新世紀(jì)第4版教材中均明確記載的半夏、天南星、陳皮、橘紅、佛手、化橘紅為燥濕化痰類中藥。使用“2.2.1”項下方法進(jìn)行檢索和篩選，獲取燥濕化痰類中藥活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)信息。

2.2.3 燥濕化痰類中藥功效作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將所有燥濕化痰類中藥的靶點(diǎn)通過STRING平臺（http://string-db.org/）構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，隨后將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，使用CytoNCA插件計算度值，并基于度值的2倍中位數(shù)篩選出重要靶點(diǎn)。利用微生信網(wǎng)站對燥濕化痰類中藥預(yù)測的靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，將篩選得到的共有靶點(diǎn)和重要靶點(diǎn)構(gòu)建燥濕化痰類中藥功效靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。

2.2.4 二陳湯燥濕化痰功效“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING平臺對二陳湯靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，創(chuàng)建二陳湯“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Merge功能將其與燥濕化痰類中藥功效作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交集處理，得到二陳湯發(fā)揮燥濕化痰功效的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.2.5 高脂血癥的疾病靶點(diǎn)檢索 通過CTD（http://ctdbase.org/）、PubMed（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/pmc/）、GeneCards（https://www. genecards.org/）、DisGeNET（http://www.disgenet. org/）、TTD（https://db.idrblab.net/ttd/）等數(shù)據(jù)庫，以關(guān)鍵詞“Hyperlipidemia”進(jìn)行高脂血癥作用靶點(diǎn)基因的檢索，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫以Relevance score≥1作為條件篩選靶點(diǎn)；合并這5個數(shù)據(jù)庫的信息并保留唯一值，以獲取與高脂血癥相關(guān)的靶點(diǎn)基因信息。

2.2.6 二陳湯燥濕化痰治療高脂血癥交集靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將高脂血癥疾病靶點(diǎn)在STRING平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過Merge功能對高脂血癥PPI網(wǎng)絡(luò)與二陳湯燥濕化痰功效的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)取交集，并計算度值。

2.2.7 二陳湯燥濕化痰治療高脂血癥的基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 使用Metascape（https://Metascape.org/）對二陳湯燥濕化痰和高脂血癥的共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO分功能和KEGG通路分析。隨后，利用微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化作圖，以深入研究關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的主要分子生物學(xué)過程和信號通路。

2.3 二陳湯燥濕化痰功效調(diào)血脂作用機(jī)制驗證

2.3.1 藥物制備 取法半夏15 g、陳皮15 g、茯苓9 g、甘草4.5 g、烏梅1個（3 g）、生姜7片（5 g），加8倍量雙蒸水浸泡1 h，煎煮2次，每次0.5 h，合并2次煎煮所得藥液并進(jìn)行濃縮，得到生藥量分別為0.464、0.927、1.854 g/mL的二陳湯藥液。

2.3.2 二陳湯活性成分橙皮苷含量檢測

（1）色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，10%～20% A；5～25 min，20%～50% A；25～35 min，50%～20% A；35～40 min，20%～10% A。檢測波長283 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取橙皮苷對照品4.2 mg，加甲醇制成0.42 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

（3）供試品溶液的制備：取200 μL二陳湯藥液（0.927 g/mL），加入800 μL甲醇，3 000 r/min離心15 min，取上清，得到供試品溶液。

2.3.3 動物分組、造模與給藥 36只大鼠隨機(jī)分成對照組、模型組、辛伐他?。?.9 mg/kg）組和二陳湯低、中、高劑量（4.64、9.27、18.54 g/kg）組，每組6只。除對照組外，其余大鼠給予高脂血癥模型飼料（10%豬油、10%蛋黃粉、2%膽固醇、1%膽酸鈉、77%基礎(chǔ)飼料）共造模8周[4]。第5周開始時，各給藥組每日ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig蒸餾水。

2.3.4 血清指標(biāo)檢測 實驗結(jié)束后，各組大鼠ip戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，靜置1 h后3 000 r/min離心15 min，分離得到血清。按照試劑盒說明書檢測血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.3.5 qRT-PCR檢測肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，）、和附睪白色脂肪組織mRNA表達(dá) 各組大鼠取血后處死，收集肝臟、附睪白色脂肪組織。按照試劑盒說明書提取大鼠肝臟、脂肪組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 基于二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥的系統(tǒng)評價結(jié)果

3.1.1 文獻(xiàn)篩選及基本特征 基于上述檢索策略，共檢索到235篇中、英文文獻(xiàn)，在去除重復(fù)文獻(xiàn)后，得到了114篇文獻(xiàn)。根據(jù)設(shè)定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)剔除不合適的文獻(xiàn)，最終納入5篇RCT文獻(xiàn)[5-9]，具體篩選流程如圖1所示。這5篇文獻(xiàn)包括了共計376例患者，其中試驗組197例，對照組179例。文獻(xiàn)中高脂血癥患者多由痰濁、痰濕所致，表現(xiàn)為形體偏胖、頭痛如裹、胸悶、嘔惡痰涎、身重困倦等證候。二陳湯治療后能夠明顯改善上述中醫(yī)證候，調(diào)節(jié)血脂水平。文獻(xiàn)基本特征見表2。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

表2 納入文獻(xiàn)基本特征

T-試驗組；C-對照組；①臨床總有效率；②TC；③TG；④LDL-C；⑤HDL-C；⑥安全性評價。

T-test group; C-control group; ①total clinical effective rate; ②TC; ③TG; ④LDL-C; ⑤HDL-C; ⑥safety evaluation.

3.1.2 文獻(xiàn)質(zhì)量評價 納入的5篇RCT文獻(xiàn)中，2篇采用了隨機(jī)數(shù)字表法，被評為低風(fēng)險；3篇提及隨機(jī)化但未明確隨機(jī)化方法，被評為風(fēng)險不明確；所有文獻(xiàn)均存在分配隱藏、未報道盲法應(yīng)用情況，被評為風(fēng)險不明確；所有文獻(xiàn)結(jié)局資料完整，未發(fā)現(xiàn)選擇性報告偏倚，被評為低風(fēng)險；所有文獻(xiàn)其他偏倚來源不清楚，被評為風(fēng)險不明確。偏倚風(fēng)險評價見圖2。

圖2 納入文獻(xiàn)的偏倚風(fēng)險評估

3.1.3 重要結(jié)局指標(biāo)

（1）TC變化情況：5篇文獻(xiàn)（＝376）報告了高脂血癥患者接受二陳湯治療前后TC的變化，異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示＝0.008，2＝71%，提示納入研究的異質(zhì)性較大，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果（圖3）顯示，高脂血癥患者接受二陳湯治療后，TC水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[MD＝?0.31, 95% CI (?0.52, ?0.11),＝0.003]。

（2）TG變化情況：4篇文獻(xiàn)（＝270）報告了高脂血癥患者接受二陳湯治療前后TG的變化情況，異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示＝0.07，2＝58%，提示納入研究的異質(zhì)性較大，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果（圖4）顯示，高脂血癥患者接受二陳湯治療后，TG水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[MD＝?0.36, 95% CI (?0.64, ?0.09),＝0.010]。

（3）LDL-C變化情況：3篇文獻(xiàn)（＝190）報告了高脂血癥患者接受二陳湯治療前后LDL-C的變化情況，異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示＝0.002，2＝84%，提示納入研究的異質(zhì)性顯著。剔除楊雨鳴研究[8]后，異質(zhì)性降低，故采用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果（圖5）顯示，高脂血癥患者接受二陳湯治療后，LDL-C水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[MD＝?0.57, 95% CI (?0.89, ?0.24),＝0.000 7]。

圖3 二陳湯對高脂血癥TC水平影響的森林圖

圖4 二陳湯對高脂血癥TG水平影響的森林圖

（4）HDL-C變化情況：5篇文獻(xiàn)（＝376）報告了高脂血癥患者接受二陳湯治療前后HDL-C的變化情況，異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示＝0.31，2＝17%，故采用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果（圖6）顯示，高脂血癥患者接受二陳湯治療后，HDL-C水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[MD＝0.09, 95% CI(0.05, 0.14),＜0.000 1]。

圖5 二陳湯對高脂血癥LDL-C水平影響的森林圖

圖6 二陳湯對高脂血癥HDL-C水平影響的森林圖

（5）總有效率變化情況：3篇文獻(xiàn)（＝210）報告了高脂血癥患者接受二陳湯治療前后總有效率的變化情況，異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示＝0.09，2＝58%，提示納入研究的異質(zhì)性較大，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果（圖7）顯示，高脂血癥患者接受二陳湯治療后，總有效率高于對照組，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義[RR＝1.15, 95% CI (0.98, 1.36),＝0.09]。

3.2 基于二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.2.1 二陳湯和燥濕化痰類中藥活性成分與作用靶點(diǎn) 基于上述數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，并通過查閱文獻(xiàn)，補(bǔ)充生姜和烏梅的活性成分，共獲取了二陳湯活性成分145種，燥濕化痰類中藥活性成分34種。然后，利用UniProt數(shù)據(jù)庫將蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，獲得二陳湯相關(guān)靶點(diǎn)392個，燥濕化痰類中藥的相關(guān)靶點(diǎn)172個。

圖7 二陳湯對高脂血癥臨床總有效率影響的森林圖

3.2.2 燥濕化痰類中藥功效作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING平臺構(gòu)建燥濕化痰類中藥PPI網(wǎng)絡(luò)后，導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1軟件計算度值，以度值大于2倍中位數(shù)進(jìn)行篩選，得到重要靶點(diǎn)34個；利用微生信網(wǎng)站對每味燥濕化痰類中藥預(yù)測的靶點(diǎn)交集后獲得共有靶點(diǎn)9個。將重要靶點(diǎn)和共同靶點(diǎn)合并得到燥濕化痰類中藥功效靶點(diǎn)39個，通過Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建燥濕化痰類中藥功效靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)（圖8）。

圖8 燥濕化痰類中藥功效靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)

3.2.3 二陳湯燥濕化痰功效“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING平臺和Cytoscape 3.9.1軟件創(chuàng)建二陳湯“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用Merge功能將其與燥濕化痰類中藥功效作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交集，得到二陳湯燥濕化痰關(guān)鍵靶點(diǎn)37個，包括前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、雌激素受體1（estrogen receptor，ESR1）、PPARG、ESR2、核受體共激活因子2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）等靶點(diǎn)，并構(gòu)建二陳湯燥濕化痰功效的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖9）。

3.2.4 高脂血癥的相關(guān)靶點(diǎn)檢索分析 通過檢索獲得與高脂血癥密切相關(guān)的靶點(diǎn)共821個，然后導(dǎo)入STRING平臺繪制PPI網(wǎng)絡(luò)（圖10）并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示有757個靶點(diǎn)參與蛋白互作，蛋白與蛋白之間的相互作用達(dá)17 458條，其間作用力的大小以線條的粗細(xì)表示。

圖9 二陳湯燥濕化痰功效的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

圖10 高脂血癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

3.2.5 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 利用STRING平臺對二陳湯燥濕化痰所涉37個靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并將其與高脂血癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，通過Merge功能取交集，獲得二陳湯燥濕化痰治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)20個（表3）。

表3 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥關(guān)鍵靶點(diǎn)

3.2.6 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥GO和KEGG分析 GO分析條目共有500個（＜0.01），根據(jù)值排序，分別在生物過程、分子功能和細(xì)胞組分中選出排名前10的條目進(jìn)行作圖（圖11）。生物過程（biological process，BP）涉及小分子代謝過程調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過程調(diào)節(jié)、調(diào)控miRNA轉(zhuǎn)錄和代謝過程、細(xì)胞內(nèi)受體信號通路等449個條目；細(xì)胞組成（cell composition，CC）涉及小窩、膜閥、細(xì)胞外基質(zhì)等11個條目；分子功能（molecular function，MF）涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、核類固醇受體活性等40個條目。

KEGG分析（＜0.01）涉及通路共有91條，根據(jù)值排序，排除癌癥通路、肝炎、病毒感染等無關(guān)通路，篩選出排名前20條相關(guān)通路作圖（圖12）。KEGG通路包括松弛素信號通路、長壽調(diào)節(jié)途徑、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）-糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of AGEs，RAGE）通路、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路等。

圖11 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥關(guān)鍵靶點(diǎn)GO分析

圖12 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG富集分析

3.3 二陳湯活性成分橙皮苷的測定

HPLC圖見圖13，橙皮苷峰面積為5 662.35，二陳湯峰面積為3 489.02，采用外標(biāo)一點(diǎn)法得出回歸方程為＝13 481.79，計算出二陳湯中橙皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.40 mg/g。

圖13 橙皮苷 (A) 及二陳湯 (B) 的HPLC圖

3.4 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果驗證

3.4.1 二陳湯對高脂血癥大鼠血脂水平的影響 如圖14所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（＜0.05、0.001），HDL-C水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，二陳湯各劑量組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），二陳湯中、高劑量組HDL-C水平顯著升高（＜0.05、0.001）。

3.4.2 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥預(yù)測靶點(diǎn)驗證 如圖15所示，與對照組比較，模型組大鼠肝臟中和mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），白色脂肪組織中mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，二陳湯高劑量組肝臟中mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）；二陳湯各劑量組肝臟中PPARγ mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），白色脂肪組織中mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

4 討論

脂質(zhì)代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致血漿中脂質(zhì)增加超過正常即為高脂血癥[10]。中醫(yī)并無這一病名，但有關(guān)“膏”“脂”的論述。中醫(yī)臨床上將高脂血癥分為痰濁內(nèi)阻、脾虛濕盛、氣滯血瘀和肝腎陰虛4種證型[2]，多與飲食不節(jié)或過逸少勞等導(dǎo)致津液代謝障礙，濕濁內(nèi)生，積聚成痰，痰濁內(nèi)阻，氣血運(yùn)行不暢的病因病機(jī)有關(guān)。

二陳湯主治濕痰證，《丹溪心法附余》言其為“標(biāo)本兩盡之藥也”。方中半夏為君，善燥濕化痰，和胃降逆；橘紅為臣，既可理氣行滯，又能燥濕化痰；茯苓健脾滲濕，甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥，均為佐藥；煎加生姜，既能制半夏毒，又能協(xié)助半夏化痰和胃；復(fù)用少許烏梅，收斂肺氣，消痰益精；方中諸藥合用，標(biāo)本同治，共奏燥濕化痰之功，以改善脂質(zhì)代謝異常，達(dá)到治療高脂血癥的作用。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖15同。

圖15 二陳湯對高脂血癥大鼠肝臟中PPARα (A)、PPARγ (B) 和脂肪組織中PPARγ(C) mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

臨床高脂血癥（痰濁內(nèi)阻證）可見形體肥胖、頭重如裹、胸悶、心悸等證候，相比其他證型血清TG、TC、LDL-C水平更高，HDL-C水平更低[11]。張冰嬋等[12]發(fā)現(xiàn)痰濕體質(zhì)的高脂血癥患者TC、TG水平高于其他體質(zhì)的高脂血癥患者。Meta分析中二陳湯顯著改善形體肥胖、胸悶嘔惡等痰濕證候，降低血中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，充分證實二陳湯治療高脂血癥的有效性，為藥理學(xué)研究提供真實世界證據(jù)。聚焦中醫(yī)中有形之痰和無形之痰，本課題組曾在2000年開展了二陳湯燥濕化痰功效的實驗研究，通過小鼠酚紅祛痰、氨水誘發(fā)小鼠咳嗽等實驗和脂肪乳致大鼠高脂血癥、蛋黃乳致小鼠高脂血癥實驗研究，發(fā)現(xiàn)二陳湯具有化痰、止咳、調(diào)血脂的藥理作用，為其燥濕化痰功效治療臨床有形之痰和無形之痰的療效提供了藥理學(xué)證據(jù)[13-15]。另外，本研究Meta分析發(fā)現(xiàn)觀察組均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，也證實了二陳湯治療高脂血癥的安全性。

為進(jìn)一步確認(rèn)二陳湯通過“燥濕化痰”功效發(fā)揮了治療高脂血癥的療效，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)將燥濕化痰類中藥的功效作用網(wǎng)絡(luò)與二陳湯“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)相交，構(gòu)建了二陳湯燥濕化痰功效的“藥物-成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)；然后，通過交叉分析二陳湯燥濕化痰的關(guān)鍵靶點(diǎn)與高脂血癥疾病靶點(diǎn)，得到了PPARG、PTGS2、ESR1、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、PPARA等20個二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥的潛在作用靶點(diǎn)，其中PPARG可能為核心靶點(diǎn)。靶點(diǎn)GO分析涉及小分子代謝和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)等生物過程，而KEGG分析則涉及松弛素信號通路、長壽調(diào)節(jié)途徑、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、脂肪細(xì)胞中脂肪分解調(diào)節(jié)、VEGF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE通路和AMPK通路等。這些結(jié)果系統(tǒng)預(yù)測了二陳湯治療高脂血癥的潛在功效機(jī)制和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

藥理作用是通過藥物分子與靶標(biāo)之間相互作用實現(xiàn)的。二陳湯發(fā)揮燥濕化痰功效的物質(zhì)基礎(chǔ)就是方中那些調(diào)控血脂穩(wěn)態(tài)的藥效物質(zhì)，如半夏中的β-谷甾醇[16]，橘紅中的川陳皮素、橘皮素、柚皮苷[17-18]，茯苓中的茯苓多糖、茯苓酸[19]，甘草中的甘草查耳酮A[20]，生姜中的6-姜酚[21]，烏梅中熊果酸、齊墩果酸[22]等成分，其調(diào)控機(jī)制與PPARα和PPARγ對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的核心靶點(diǎn)相互印證，具體機(jī)制見表4。

表4 二陳湯方中藥味成分調(diào)血脂作用與機(jī)制

CPT-1-肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶；SREBP-1c-膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c；LPL-脂蛋白脂肪酶；ATGL-脂肪甘油三酯脂肪酶；UCP2-線粒體解偶聯(lián)蛋白；FXR-法尼醇X受體；C/EBPα-CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α；aP2/FABP4-脂肪酸結(jié)合蛋白4；FAS-脂肪酸合酶；SCD1-固醇輔酶A去飽和酶1；GPAT-甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶。

CPT-1-carnitine palmitoyltransferase1; SREBP-1c-sterol regulatory element-binding protein 1c; LPL-lipoprteinlipase; ATGL-adipose triacylglyceride lipase; UCP2-mitochondrial uncoupling protein; FXR-arnesol X receptor; C/EBPα-CCAAT enhancer binding protein α; aP2/FABP4-fatty acid binding protein 4; FAS-fatty acid synthase; SCD1-stearoyl-CoA desaturase-1; GPAT-glycerol-3-phosphate acyltransferases.

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果和現(xiàn)代功效物質(zhì)研究，本研究選擇構(gòu)建高脂血癥大鼠模型，對靶點(diǎn)PPARα和PPARγ進(jìn)行驗證。PPARα是脂肪酸氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)肝臟中膽固醇代謝、脂肪酸氧化過程影響脂質(zhì)代謝[29]。PPARγ則是脂質(zhì)生成的主要調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)合成，還能促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)揮調(diào)血脂作用[30-31]。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，二陳湯能夠上調(diào)高脂血癥大鼠肝臟中和mRNA表達(dá)，下調(diào)脂肪組織中mRNA表達(dá)，參與脂質(zhì)代謝，改善高脂血癥大鼠血脂異常（圖16）。

綜上，本研究采用“系統(tǒng)評價-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-現(xiàn)代實驗研究”的創(chuàng)新集成策略，明晰二陳湯臨床治療高脂血癥的燥濕化痰功效表征為改善痰濕證候，降低TC、TG、LDL-C和升高HDL-C水平；功效機(jī)制為通過PPARG、AKT1、PPARA等多個關(guān)鍵靶點(diǎn)和VEGF信號通路、AMPK信號通路來共同調(diào)控脂質(zhì)代謝；基于上述預(yù)測靶點(diǎn)、功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，PPARα和PPARγ是二陳湯發(fā)揮燥濕化痰功效治療高脂血癥的核心靶點(diǎn)，實現(xiàn)了聚焦現(xiàn)代疾病，“源于中醫(yī)理論-證于現(xiàn)代研究-回歸臨床應(yīng)用”進(jìn)行了傳統(tǒng)功效現(xiàn)代闡發(fā)的有益嘗試。

圖16 二陳湯燥濕化痰功效治療高脂血癥作用機(jī)制

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Efficacy study of Erchen Decoction in treatment of hyperlipidemia by eliminating dampness and phlegm based on clinical efficacy mining and target network verification

LI Rongrong1, 2, DU Hang2, LI Hang2, SHENG Lisong3, LU Jiabao4, LIU Chinian1, ZHENG Hui2, SUN Rong2, 3

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. The Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China 3. Advanced Medical Research Institute, Shandong University, Jinan 250012, China 4. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To elucidate the modern evidence-based relationships between the clinical efficacy of Erchen Decoction (二陳湯) in treating hyperlipidemia by eliminating dampness and phlegm and effect target based on integrated innovation strategy of “systematic evaluation to determine the efficacy index-network pharmacological prediction target-interaction of dampness and phlegm-eliminating traditional Chinese medicine to clarify the efficacy index-experiment to verify the efficacy index and efficacy target”.Clinical randomized controlled trials of Erchen Decoction for the treatment of hyperlipidemia that meet the inclusion criteria was selected, clinical syndromes closely related to the efficacy of Erchen Decoction in drying dampness and resolving phlegm was extracted, and then a meta-analysis of clinical studies was conducted. The active ingredients and corresponding targets of Erchen Decoction and traditional Chinese medicine for drying dampness and resolving phlegm were screened and collected, “drug-active ingredient-key target” network for the drying dampness and resolving phlegm effect of Erchen Decoction was construct by Cytoscape 3.9.1 software. The key targets of Erchen Decoction’s drying dampness and resolving phlegm effect were intersected with those of hyperlipidemia disease, and gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on common targets were performed by Matescape platform. Based on network pharmacology and modern pharmacological substance research, a hyperlipidemia model was constructed through a high-fat diet, and qRT-PCR technology was used to verify the therapeutic targets of Erchen Decoction’s drying dampness and resolving phlegm effect in the treatment of hyperlipidemia.Meta-analysis revealed that Erchen Decoction either as a standalone treatment or in conjunction with other therapies, exhibited superior outcomes compared to the control group in managing total cholesterol (TC), triglycerides (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C). A total of 37 key targets of Erchen Decoction for eliminating dampness and phlegm were obtained from the network pharmacological research. The treatment of hyperlipidemia involved 20 key targets such as peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG), prostaglandin G/H synthase 2 (PTGS2), estrogen receptor 1 (ESR1), tumor protein p53 (TP53), RAC-alpha serine/threonine-protein kinase (AKT1) and PPARA. GO analysis involved biological processes such as the regulation of small molecule metabolism and lipid metabolism, while KEGG analysis involved 91 pathways such as lipid and atherosclerosis, regulation of lipolysis in adipocytes, vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway and AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling pathway. Theexperiment results showed that Erchen Decoction could effectively improve the level of blood lipids in hyperlipidemia rats (< 0.05, 0.01, 0.001), up-regulate the expressions ofandmRNA in liver (< 0.05, 0.001), and down-regulate the expression ofmRNA in adipose tissue of hyperlipidemia rats (< 0.05, 0.01).The drying dampness and resolving phlegm effectiveness of Erchen Decoction in hyperlipidemia treatment is marked by a reduction in TC, TG and LDL-C levels, coupled with an elevation in HDL-C levels. This efficacy network is closely linked to several key targets including PPARG, AKT1, PPARA, as well as pathways such as VEGF signaling pathway and AMPK signaling pathway. These elements collectively play a role in lipid metabolism, regulation of lipolysis in adipocytes and liver lipid regulation. Combined with a fundamental analysis of its functional components andexperiments, PPARα and PPARγ are the central targets of Erchen Decoction for treating hyperlipidemia, utilizing its dampness elimination and phlegm resolution properties.

Erchen Decoction; drying dampness and resolving phlegm; hyperlipidemia; network pharmacology; systematic evaluation; hesperidin; peroxisome proliferator-activated receptor α; peroxisome proliferator-activated receptor γ

R285.6

A

0253 - 2670(2024)08 - 2708 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.020

2023-11-27

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2022YFC3502100）；濟(jì)南市科研帶頭人工作室項目（202228099）；高等醫(yī)學(xué)研究院前沿學(xué)科發(fā)展基金（GYY2023QY01）

李榮榮，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學(xué)與毒理學(xué)。E-mail: lirongrong113@163.com

通信作者：孫 蓉，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。E-mail: sunrong107@163.com

鄭 暉，助理研究員，從事中藥心血管藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。E-mail: zhenghui@sdu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]