響應面試驗優(yōu)化福林酚法測定三葉木通果皮多酚含量及其抗氧化活性

李艷輝，楊蕊西，何靖怡，袁亞宏，岳田利，盛慶林

（西北大學食品科學與工程學院，陜西西安 710069）

三葉木通（Akebia trifolia），俗稱“八月瓜”“八月炸”“野香蕉”等，廣泛分布在我國19 個省的山脈中，包括甘肅、陜西、山西、河北、四川等。三葉木通憑借其優(yōu)良的藥用價值，在中藥成分中占有一席之地，被稱為“預知子”，用來治療水腫、舌痛、閉經(jīng)等疾病[1]。三葉木通最大的特點是當果實成熟時，果皮會沿著腹部縫合線縱向裂開，常發(fā)生在農(nóng)歷8 月，因此三葉木通有了“八月瓜”這個美名。

近年來，由于生活水平不斷提高及市場消費結(jié)構(gòu)的改變，三葉木通作為一種保健水果越來越受到大眾的喜愛，主要是因為三葉木通富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，并且風味甘甜、柔軟多汁。三葉木通果皮中富含各種植物化學成分，這些化學物質(zhì)已被證明具有抗炎[2]、抗菌[3]和體外抗氧化作用[4]。張孟琴等人[5]采用多種方法測定了三葉木通果皮的基本理化指標。有研究表明，果皮中果膠、蛋白質(zhì)、還原糖、總糖等營養(yǎng)物質(zhì)和黃酮類、多酚類、皂苷等活性物質(zhì)豐富。在材料研究方面，果皮提取物被用于開發(fā)活性包裝膜、制備納米顆粒，甚至作為環(huán)境保護的緩蝕劑。除此之外，三葉木通果實的應用與專利研究也有很多。例如，發(fā)酵型八月瓜復合飲料、八月瓜酸奶、復合酵素、富硒八月瓜飲料等。果皮經(jīng)常被當作垃圾丟棄，不但造成了資源的浪費，而且在很大程度上污染了環(huán)境。以三葉木通果皮為研究對象，對比了80%甲醇、60%乙醇、水3 種溶劑得到的提取物的抗氧化活性能力，同時采用響應面優(yōu)化福林酚法測定了提取物的多酚含量，為三葉木通果皮的開發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三葉木通（即八月瓜），購自四川涼山，挑選表面光滑、無蟲害、機械損傷較輕的成熟八月瓜置于陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

沒食子酸標準品、福林酚試劑、TPTZ 溶液、Trolox 標準品、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH）、Na2EDTA、啡咯嗪（Ferrozine）、pBR322質(zhì)粒DNA，美國Sigma 公司提供；瓊脂糖、甲醇、乙醇、碳酸鈉、鹽酸、FeCl3、FeSO4，上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機、電子分析天平、LC-10N/12N/18N冷凍干燥機、超聲波清洗儀、抽濾機、LC-RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、凝膠電泳儀、紫外分光光度計、水浴鍋、凝膠呈像儀等。

1.3 試驗方法

1.3.1 三葉木通果皮提取的工藝流程

三葉木通果皮提取的工藝流程圖見圖1。

圖1 三葉木通果皮提取的工藝流程圖

1.3.2 三葉木通果皮粗提粉的體外抗氧化活性測定

（1）清除DPPH 自由基能力的測定。清除DPPH自由基能力的測定參考R Scherer 等人[6]的方法并加以修改，于波長517 nm 處測定吸光度。

（2）FRAP 能力的測定。FRAP 能力的測定參考I F F Benzie 等人[7]的方法并加以修改。以Trolox 為標準品，于波長593 nm 處測定吸光度。

（3）對Fe2+絡合能力的測定。對Fe2+絡合能力的測定參考N Singh 等人[8]的方法并加以修改。于波長562 nm 處，以EDTA-2Na 為對照品進行吸光度測定。

（4）對·OH 誘導的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護。對·OH 誘導的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護采用瓊脂糖凝膠電泳法，參考B Tepe 等人[9]的方法并加以修改。結(jié)果用凝膠呈像儀拍照，用Quantity One 軟件對每個條帶進行光密度分析。

瓊脂糖凝膠電泳法各組加樣量見表1。

表1 瓊脂糖凝膠電泳法各組加樣量/μL

1.3.3 三葉木通果皮粗提粉中多酚含量的測定

多酚含量的測定采用Folin-ciocalteu 分光光度測定法，參照J Rumpf 等人[10]的方法并加以修改。對照品選用質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的沒食子酸溶液，樣品溶液為1 mg/mL 的果皮粗提粉溶液。

1.3.4 三葉木通果皮粗提粉多酚測定條件的優(yōu)化

對Folin-Ciocalteu 分光光度法中福林酚試劑稀釋倍數(shù)（0，2 倍，4 倍，6 倍，8 倍）、20%碳酸鈉用量（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL）、反應溫度（20，30，40，50，60 ℃）和反應時間（50，70，90，110，130 min）[11]這4 個因素設計單因素試驗，測定三葉木通果皮粗提粉中多酚的含量。

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，將多酚含量作為響應值，將福林酚試劑稀釋倍數(shù)、20%碳酸鈉用量、反應溫度和反應時間作為四因素，根據(jù)響應面設計原理對三葉木通果皮粗提粉中的多酚含量設計四因素三水平試驗。

響應面設計的因素與水平設計見表2。

表2 響應面設計的因素與水平設計

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉木通果皮粗提粉的體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.1.1 清除DPPH 自由基能力的測定

標準曲線圖見圖2。

圖2 標準曲線圖

DPPH（2,2 -二苯基-1 -三硝基肼基）相對較安全且便宜，根據(jù)體內(nèi)自由基穩(wěn)定的機制起作用[12]。3 種方法獲得提取物的清除DPPH 自由基能力的標準曲線（見圖2（a）～（c）），經(jīng)計算得，80%甲醇、60%乙醇、水提取物對DPPH 自由基的清除能力分別為（28.33±0.12），（13.21±0.04），（6.02±0.05）mg/mL。

2.1.2 FRAP 能力的測定

FRAP（Ferric ion reducing antioxidant power）用來測定總抗氧化能力，簡單且直接。Trolox 標準曲線（見圖2（d）），擬合回歸方程為Y=0.054 1X-0.001 3（R2=0.999），計算得80%甲醇、60%乙醇、水提取物的FRAP 能力分別為（20.51±0.02），（10.15±0.11），（4.25±0.04）mg/g。

2.1.3 對Fe2+絡合能力的測定

絡合能力測定抗氧化能力的原理是Fe2+可以催化Fenton 反應的進行，對機體產(chǎn)生氧化應激[13]。EDTA-2Na 標準曲線（見圖2（e）），擬合回歸方程為Y=-0.012 9X+0.975 6（R2=0.991），計算得80%甲醇、60%乙醇、水提取的APPE 對Fe2+的絡合能力分別為（23.11±0.14），（11.34±0.21），（4.20±0.01）mgEDTA-2Na/g。

2.1.4 對·OH 誘導的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護

Fe2+和H2O2混合會發(fā)生Fenton 反應（Fe2++H2O2→Fe3++·OH+-OH），從而產(chǎn)生羥基自由基，破壞DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)[14]。通過瓊脂糖凝膠電泳，會出現(xiàn)2 個條帶，移動快的是超螺旋DNA，移動較慢的是開鏈和線性形狀DNA[15]。

不同提取方式對DNA 的保護作用見圖3，不同提取方式對DNA 的保護作用見表3。

表3 不同提取方式對DNA 的保護作用/%

圖3 不同提取方式對DNA 的保護作用

由圖3 和表3 可知，3 種提取方法得到的提取物對·OH 誘導的pBR322 質(zhì)粒DNA 的氧化損傷均有保護作用。其中，80%甲醇組的開鏈占比最低，為41.53%；其次是60%乙醇組，為43.34%；水組的開鏈占比最高，為46.81%。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

20%碳酸鈉用量、反應溫度、反應時間及福林酚稀釋倍數(shù)對多酚測定結(jié)果的影響見圖4。

圖4 20%碳酸鈉用量、反應溫度、反應時間及福林酚稀釋倍數(shù)對多酚測定結(jié)果的影響

由圖4 可知，隨著福林酚稀釋倍數(shù)的升高，測得的三葉木通果皮提取物中的多酚含量逐漸降低。但是，當福林酚完全不稀釋時，由于反應后的溶液中有白色沉淀析出，并伴隨著大量氣泡產(chǎn)生，因此根據(jù)試驗并結(jié)合前期經(jīng)驗，最終決定將福林酚稀釋2 倍使用[16]。

反應溫度及20%碳酸鈉用量對三葉木通果皮提取物的多酚測定的影響都是先上升后下降。當反應溫度達到30 ℃，20%碳酸鈉用量為1 mL 時，此時的多酚含量分別達到（18.25±0.13）mg/g 及（19.20±0.11）mg/g。當溫度過高時，會使得結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的多酚分解，導致測定結(jié)果降低。碳酸鈉過多會導致體系達到過堿狀態(tài)，稀釋藍色絡合物[17]。

三葉木通果皮提取物的多酚測定結(jié)果隨著反應時間的延長，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當反應時間達到110 min 時，多酚含量達到（18.22±0.17）mg/g。當反應時間過短，反應未充分進行。反應時間過長，可能會影響藍色絡合物，使得測得結(jié)果偏低[18]。

2.3 響應面結(jié)果分析

2.3.1 響應模型的建立與分析

利用Design Expert.V8.0.6.1 對選取的4 個因素進行響應面分析。通過二次多項式回歸擬合，得到多酚含量（Y）。

由表4 可知，F(xiàn)=39.57，p＜0.0001，失擬項p=0.650 9，證明模型是合適的。該模型的R2=0.975 4，說明試驗誤差比較小，三葉木通果皮提取物的多酚測定條件結(jié)果和模型預測結(jié)果較一致。除此之外，該模型的校正系數(shù)R2Adj=0.950 7，也證明了模型的可靠性。

表4 方差分析

方差分析見表4。

各因素對多酚測定結(jié)果的響應面圖見圖5。

圖5 各因素對多酚測定結(jié)果的響應面圖

響應面分析圖可以被用來評價設置的一些試驗因素對三葉木通果皮提取物中總酚測定結(jié)果的兩兩交互作用[19]。由圖5 可知，響應面坡度越陡，說明該因素對吸光度的影響越大，反之影響程度越小[20]。

2.3.2 最優(yōu)條件的確定

根據(jù)響應面模型分析，通過Design Expert.V 8.0.6.1 得到的Folin-ciocalteu 分光光度法測量三葉木通果皮提取物中多酚含量的最優(yōu)條件為福林酚稀釋倍數(shù)0.63，20%碳酸鈉用量1 mL，反應溫度26.47 ℃，反應時間108.29 min，此時得到多酚含量為19.50 mg/g。參考最佳測定條件，在實際測定中對條件進行微調(diào)：將福林酚稀釋倍數(shù)設為2 倍，20%碳酸鈉用量設為1 mL，反應溫度設為27 ℃，反應時間設為110 min，所得80%甲醇提取物中多酚含量的平均值為（18.91±0.38）mg/g，該結(jié)果略低于最佳條件下的最高值，但與預估值接近，吻合度達96.9%，說明在該條件下測三葉木通果皮提取物中的多酚含量較可靠。

3 結(jié)論

通過80%甲醇、60%乙醇和水3 種溶劑對三葉木通果皮進行超聲提取及體外抗氧化試驗證明，80%甲醇提取物的具有最強的FRAP 能力（20.51±0.02）mg/g，清除DPPH 自由基的能力（28.33±0.12）mg/mL，對Fe2+的絡合能力（23.11±0.14）mg EDTA-2Na/g 及對·OH 引起的pBR322 質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護能力。經(jīng)響應面優(yōu)化福林酚檢測多酚的試驗結(jié)果表明，80%甲醇提取物中多酚含量的平均值為（18.91±0.38）mg/g，確定的最優(yōu)檢測條件為福林酚稀釋倍數(shù)設為2 倍，20%碳酸鈉用量為1 mL，反應溫度27 ℃，反應時間110 min。該研究為三葉木通果皮中多酚的提取與應用提供了參考，有利于三葉木通的進一步開發(fā)與利用。