清熱化濕調(diào)樞方對(duì)葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜MUC-2、Claudin-2表達(dá)的影響

王倩影 楊晨 鐘卓泰 張濤 姚夢(mèng)茜 王琳 張格知 班彥然 蘇曉蘭 魏瑋

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)以非特異性腸道炎癥為病變特點(diǎn)[1],主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便和腹痛,病變范圍主要局限于結(jié)腸及直腸黏膜,是一種難治性、易復(fù)發(fā)的消化系統(tǒng)疾病。

UC是腸道腫瘤發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一[2],有報(bào)道稱,UC患者的結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)比普通人高3～5倍[3],而且病程越長(zhǎng),癌變機(jī)率越高[4]。盡管治療UC的藥物日新月異,包括用于誘導(dǎo)和維持UC緩解的5-氨基水楊酸(5-amino salicylic acid,5-ASA)藥物、皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑等,但無法維持這種疾病的緩解和避免復(fù)發(fā),在臨床上仍是一個(gè)難以解決的問題。保護(hù)腸道免受有害物質(zhì)入侵的第一道屏障——腸黏膜屏障,當(dāng)腸道上皮細(xì)胞受到破壞,黏液層的組成出現(xiàn)缺陷時(shí),就會(huì)導(dǎo)致腸道屏障的破壞,從而促使腸道炎癥產(chǎn)生[5]。因此,維護(hù)腸道黏膜屏障功能完整,提高黏膜修復(fù)能力是預(yù)防和維持UC患者病情穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)。

中醫(yī)藥治療UC強(qiáng)調(diào)的是系統(tǒng)化的認(rèn)識(shí)和個(gè)體化的治療,且中藥具有多成分,多環(huán)節(jié),多靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì),能夠起到誘導(dǎo)緩解、預(yù)防病情復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)復(fù)發(fā)時(shí)間、穩(wěn)定患者病情的作用。清熱化濕調(diào)樞方為魏瑋教授傳承國(guó)醫(yī)大師路志正先生學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上,根據(jù)三十余年臨床經(jīng)驗(yàn)及對(duì)UC病因病機(jī)的認(rèn)識(shí),化裁烏梅丸、葛根芩連湯等經(jīng)典名方而來,方中以烏梅、敗醬草、白芍、白術(shù)、太子參、茯苓、木香、黃連、秦皮等藥為主,功專清熱化濕,健脾調(diào)樞,臨床研究顯示清熱化濕調(diào)樞方治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床療效突出[6]。前期課題組的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,清熱化濕調(diào)樞方對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠的腸道黏膜屏障損傷有修復(fù)作用,但尚不清楚清熱化濕調(diào)樞方在預(yù)防和延緩UC發(fā)作方面,能否保持腸道屏障功能穩(wěn)定。本研究將基于腸道黏膜組織中粘蛋白2(mucoprotein-2,MUC-2)、閉合蛋白2(Claudin-2)表達(dá)變化,通過建立葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠模型,探討清熱化濕調(diào)樞方在預(yù)防和緩解DSS結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜屏障功能損傷方面可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

購(gòu)買于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司的SPF級(jí)C57BL/6小鼠24只,雄性,8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2015-0015。在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸所SPF級(jí)獸舍飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)鼠,在室溫(24±2)℃、相對(duì)濕度35%～45%的通風(fēng)隔音籠舍內(nèi),每隔12小時(shí)進(jìn)行一次光照與黑暗交替飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)已由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所倫理委員會(huì)審批,實(shí)驗(yàn)倫理證號(hào):D2021-03-16-2。

1.2 藥物與試劑

中藥免煎顆粒:購(gòu)于四川新綠藥業(yè),用蒸餾水配至所需濃度得到中藥混懸液,于4 ℃保存?zhèn)溆?使用前恢復(fù)室溫并搖勻。清熱化濕調(diào)樞方(烏梅12 g、敗醬草12 g、黃連6 g、當(dāng)歸10 g、炒白芍12 g、木香9 g、枳實(shí)10 g、葛根12 g、麩炒白術(shù)10 g、太子參12 g、茯苓15 g、秦皮12 g、兒茶6 g、甘草9 g)1劑生藥轉(zhuǎn)換為免煎顆粒為13 g。

美沙拉嗪混懸液:美沙拉嗪腸溶片(0.5 g/片,LosanPharmma GmbH公司,進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20171358),外部黃色藥衣于每日干預(yù)前刮去,取0.5 g藥片,充分溶于50 mL溫水制成使用。

DSS溶液:美國(guó)MP Biomedicals公司(43 kDa,批號(hào)160110),用100 mL純水溶解2.5 g的DSS配成2.5%的DSS溶液。

MUC-2單抗(貨號(hào):PAA705Mu01)、抗原修復(fù)液(貨號(hào):C1010)、PBS緩沖液(貨號(hào):C1003)、蘇木精染液(貨號(hào):C1001)、二抗(貨號(hào):PAE001)、DAB顯色劑(貨號(hào):C1101),48T(貨號(hào):SEA641Mu),購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司;抗閉合蛋白2(Claudin-2)抗體(貨號(hào):ab15098),購(gòu)于Abcam公司;水合氯醛(批號(hào):EB05980),購(gòu)于上海士鋒生物科技有限公司;中性組織固定液(批號(hào):R20486) 購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液(批號(hào): H8070) ,購(gòu)于北京賽因坦科技有限公司;BSA(貨號(hào):A8020),購(gòu)于Solarbio公司。

1.3 儀器

電泳儀(型號(hào):DYY-6D)、電泳槽(型號(hào):DYCZ-24DN),北京六一儀器廠;其林貝爾水平搖床(型號(hào):TS-1),海門市其林貝爾儀器制造有限公司;轉(zhuǎn)印槽(型號(hào):JY-ZY5),北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;X膠片觀片燈(型號(hào):GPD-Ⅱ),北京雅迪萊特醫(yī)療科技有限公司;掃描儀(型號(hào):5600F),佳能公司;高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):HC-3018R),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;超聲細(xì)胞破碎機(jī)(型號(hào):650Y),上海利聞科學(xué)儀器有限公司;紫外分光光度計(jì)(型號(hào):UV1800),日本島津公司;脫水機(jī)(型號(hào):JJ-12J),武漢俊杰電子有限公司;包埋機(jī)(型號(hào):KD-BM)、病理切片機(jī)(型號(hào):KD-2258)、凍臺(tái)(型號(hào):KD-BL)、組織攤片機(jī)(型號(hào):KD-P),浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;正置光學(xué)顯微鏡(型號(hào):CK31),日本奧林巴斯公司。

1.4 分組

24只小鼠進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng),采用隨機(jī)函數(shù)進(jìn)行分組,分為正常組、模型組、清熱化濕調(diào)樞方組、美沙拉嗪組,每組6只。

1.5 干預(yù)與造模

參照《中藥藥理研究方法學(xué)》[7],按小鼠與人體表面積比等有效劑量折算的比例,作為給藥劑量,將人的日常給藥劑量折算為小鼠等有效劑量。在UC模型小鼠造模過程中,同時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)。正常組可自由飲用蒸餾水,其余各組小鼠參照Wirtz等造模方法,給予2.5%的DSS水溶液自由飲用7天。自造模第1天起,每日1次,連續(xù)7天,清熱化濕調(diào)樞方組小鼠予清熱化濕調(diào)樞方灌胃,劑量為1.69 g/(kg·d),美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液灌胃,劑量為0.52 g/(kg·d),正常組和模型組給予0.5 mL純水灌胃,至第8天安樂死小鼠取結(jié)腸組織。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 一般情況 每天對(duì)各組小鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤、大便性狀、肉眼血便及大便潛血、體質(zhì)量等一般情況的變化進(jìn)行觀察并記錄。

1.6.2 疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分[8]根據(jù)Murano M等[9]的研究,評(píng)估小鼠體質(zhì)量下降、大便性狀以及潛血情況,并計(jì)算出各組小鼠DAI評(píng)分,對(duì)疾病活動(dòng)情況進(jìn)行評(píng)估。DAI評(píng)分=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+潛血分?jǐn)?shù))/3。

1.6.3 測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度及觀察結(jié)腸切片組織學(xué)變化 干預(yù)結(jié)束后,用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉小鼠并將其處死,分離結(jié)腸后測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度,在結(jié)腸遠(yuǎn)端約1 cm處取病理組織,用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片,病理染色。在光鏡下觀察小鼠結(jié)腸切片組織學(xué)變化。

1.6.4 用蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)腸組織MUC-2、Claudin-2蛋白表達(dá)水平 將結(jié)腸組織剪碎,取蛋白樣品測(cè)定濃度。加適量濃縮SDS-PAGE蛋白上清緩沖液,通過電泳及轉(zhuǎn)膜。完成轉(zhuǎn)膜后,室溫封閉PVDF膜1小時(shí),用PBST進(jìn)行沖洗。將一抗稀釋至1∶500,一抗孵育,在室溫水平搖床上緩慢搖動(dòng)1小時(shí),PBST沖洗3次;二抗孵育方法重復(fù)上述操作。利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng),在化學(xué)發(fā)光底物中加入PVDF膜,然后放進(jìn)增光屏的暗盒中進(jìn)行曝光,掃描圖片顯影、定影。以GAPDH單抗檢測(cè)作為內(nèi)參對(duì)照,利用ImageJ V1.8.0.112對(duì)目標(biāo)蛋白條帶的灰度值加以分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較

正常組小鼠狀態(tài)良好、毛色黑亮,進(jìn)食和飲水均正常。模型組在第3～5天,部分小鼠糞便潛血陽(yáng)性,造模結(jié)束時(shí),該組大部分小鼠見肉眼血便,出現(xiàn)腹瀉,可明顯觀察到活動(dòng)遲緩,精神萎靡,喜蜷縮,小部分無肉眼血便小鼠同樣顯示糞便潛血陽(yáng)性。與模型組比較,美沙拉嗪組及清熱化濕調(diào)樞方組小鼠精神狀態(tài)良好,毛發(fā)色澤黑亮,活動(dòng)未見明顯遲緩,大便稀軟及便血情況較少。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量、DAI評(píng)分及結(jié)腸長(zhǎng)度比較

與正常組相比,模型組、美沙拉嗪組和清熱化濕調(diào)樞方組小鼠的體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。美沙拉嗪組和清熱化濕調(diào)樞方組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但與模型組比較,兩組小鼠均顯示體質(zhì)量增加, DAI評(píng)分下降, 結(jié)腸長(zhǎng)度增長(zhǎng)(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、DAI評(píng)分及結(jié)腸長(zhǎng)度比較

2.3 各組小鼠結(jié)腸病理情況比較

圖1示,正常組小鼠腸黏膜上皮完整,杯狀細(xì)胞數(shù)量較多,固有層排列整齊,具有完整的隱窩結(jié)構(gòu),無炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠腸黏膜上皮缺損,杯狀細(xì)胞明顯減少,固有層和隱窩結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸黏膜上皮可見多處黏膜中斷,固有層排列欠規(guī)整,部分隱窩結(jié)構(gòu)破壞,杯狀細(xì)胞減少,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。清熱化濕調(diào)樞方組小鼠結(jié)腸組織中黏膜上皮基本完整,杯狀細(xì)胞較多,隱窩結(jié)構(gòu)完整且規(guī)律排列,無炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

注:A 正常組;B 模型組;C 美沙拉嗪組;D 清熱化濕調(diào)樞方組。

2.4 各組小鼠蛋白表達(dá)水平比較

模型組小鼠MUC-2蛋白表達(dá)與正常組比較明顯降低(P<0.05);美沙拉嗪組和清熱化濕調(diào)樞方組小鼠MUC-2蛋白表達(dá)與模型組比較明顯升高(P<0.05)。模型組小鼠Claudin-2蛋白表達(dá)與正常組比較明顯降低(P<0.05);清熱化濕調(diào)樞方組小鼠Claudin-2蛋白表達(dá)與模型組比較明顯升高(P<0.05),美沙拉嗪組小鼠Claudin-2蛋白表達(dá)雖有增加趨勢(shì),但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。各組小鼠結(jié)腸組織MUC-2、Claudin-2蛋白電泳圖見圖2。

注:A 正常組;B 模型組;C 美沙拉嗪組;D 清熱化濕調(diào)樞方組。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織MUC-2、Claudin-2蛋白相對(duì)表達(dá)比較鼠只=6)

3 討論

根據(jù)腹痛、腹瀉、下利赤白膿血等臨床表現(xiàn),潰瘍性結(jié)腸炎可歸屬于中醫(yī)學(xué)“腸澼”“泄瀉”“下利”“休息痢”等范疇。病位在大腸,久病易損肝腎,其根本責(zé)之于脾虛。本病主要病機(jī)在于脾虛引起的內(nèi)濕不運(yùn),郁久化熱,濕熱相搏,下注大腸,氣血搏結(jié),腸道血絡(luò)脂膜受損,血敗肉腐而成瘍。大腸濕熱膠著不化,氣血津液運(yùn)行受阻,因濁成痰,搏血成瘀,致大腸傳導(dǎo)失司,脾胃升降失調(diào),中焦樞機(jī)逆亂而出現(xiàn)腹痛、腹瀉、下利赤白、里急后重等癥狀。治療當(dāng)緊扣脾虛濕熱蘊(yùn)腸,脾胃樞機(jī)失衡的核心病機(jī),以清腸化濕、健脾調(diào)樞為主。

清熱化濕調(diào)樞方重用烏梅,取其酸澀止瀉之用,《本草求真》言烏梅“收澀之性,而使下脫上逆皆治”,敗醬草清熱解毒、消癰排膿,白芍苦酸入肝,養(yǎng)肝陰而柔剛木桀驁之威,故能養(yǎng)血柔肝,木達(dá)則土和,故能緩急止痛,白術(shù)、太子參、茯苓、炙甘草四味取四君子之意,健脾益氣,使脾健而行,非專止瀉而瀉自能止,又久瀉耗氣傷津,故取太子參易人參以健脾益氣。木香配黃連、秦皮善治濕熱瀉痢,伍枳實(shí)調(diào)氣而除痞脹,當(dāng)歸養(yǎng)血和血,兒茶苦澀收斂,葛根升發(fā)清陽(yáng),調(diào)暢脾胃樞機(jī),鼓舞脾胃陽(yáng)氣上升而瀉止,取“清氣在下,則生飧泄”之意。甘草和中緩急,調(diào)和諸藥。上藥合用共奏清熱化濕,健脾調(diào)樞之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,烏梅具有抗炎、抗菌等作用[10-11],其機(jī)制可能與影響細(xì)胞通透性有關(guān)。敗醬草提取物可下調(diào)促炎因子而發(fā)揮抗炎功效[12]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)美沙拉嗪和清熱化濕調(diào)樞方干預(yù)后的小鼠與模型組相比,如軟便、便血等一般情況均有明顯改善,疾病活動(dòng)指數(shù)得分下降,組織病理、黏膜結(jié)構(gòu)損害不明顯。以上結(jié)果顯示,清熱化濕調(diào)樞方在預(yù)防和穩(wěn)定DSS結(jié)腸炎小鼠的腸組織病理?yè)p傷方面效果突出,與美沙拉嗪近乎等效。

在UC的發(fā)生和發(fā)展中,腸道屏障功能起著不容忽視的作用,UC腸道黏膜屏障損傷或早于炎癥表現(xiàn)在多項(xiàng)研究中體現(xiàn)[13-14]。腸黏膜屏障是腸道重要的“防線”,它可以阻止病原體、細(xì)菌、毒素等與上皮直接接觸,進(jìn)入體循環(huán)[15]。黏蛋白是黏液的主要成分,其屏障和潤(rùn)滑功能在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用[16-17]。MUC-2是結(jié)腸黏液屏障中最主要的黏蛋白,在結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),MUC-2的高度糖基化保護(hù)蛋白免遭降解,并促進(jìn)與水的相互作用,有利于形成黏液凝膠,使細(xì)菌與上皮分離,保護(hù)腸道正常結(jié)構(gòu)功能,使機(jī)體能夠有效抵御細(xì)菌及毒素的侵害[18],并能在一定程度上修復(fù)機(jī)械損傷,從而起到保護(hù)結(jié)腸黏膜的作用[19]。因此MUC-2的含量可以作為衡量結(jié)腸黏膜完整性及修復(fù)程度的重要生物學(xué)指標(biāo)。主要由上皮緊密連接中跨膜蛋白和胞質(zhì)支架蛋白組成的腸道黏膜機(jī)械屏障是腸道屏障中最重要的組成部分。Claudin蛋白是構(gòu)成緊密連接復(fù)合體的主要結(jié)構(gòu),不同的Claudin分子對(duì)緊密連接的通透性有不同的影響。一部分Claudin分子被稱為“l(fā)eaking”Claudin,它們可以形成特異性離子通道,從而提高上皮和內(nèi)皮通透性,其中就包括Claudin-2[20-21]。Claudin-2與孔隙形成有關(guān),表達(dá)上調(diào)可能會(huì)增加細(xì)胞旁通透性,影響緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致黏膜屏障結(jié)構(gòu)功能紊亂[22]。

經(jīng)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與模型組比較,DSS結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中Claudin-2、MUC-2的表達(dá),在美沙拉嗪和清熱化濕調(diào)樞方干預(yù)后,表現(xiàn)出較高的恢復(fù)程度,這表明清熱化濕調(diào)樞方對(duì)黏蛋白的恢復(fù)以及腸黏膜屏障的修復(fù)有顯著的作用,并且其療效與美沙拉嗪近似。

綜上,清熱化濕調(diào)樞方可以有效預(yù)防DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜損傷,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)結(jié)腸組織中黏蛋白MUC-2、Claudin-2的分泌,使黏膜愈合,從而維護(hù)黏膜屏障完整性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)存在以下不足,如未對(duì)腸道免疫屏障、腸道菌群等方面進(jìn)行研究,而僅從腸黏膜機(jī)械與化學(xué)屏障的相關(guān)蛋白探索了部分機(jī)制,后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步拓展研究范圍,為清熱化濕調(diào)樞方預(yù)防UC復(fù)發(fā)提供更可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。