基于UPLC-Q TOF-MSE技術(shù)的藤黃健骨丸指紋圖譜建立及共有峰鑒定

謝 東 胡健楠 李 念 楊 桔 黃 青 皮子鳳*鄭 飛 戴雨霖 越 皓*

（1長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院， 長春 130117）

（2長春人民藥業(yè)集團有限公司， 長春 130033）

藤黃健骨丸是著名中醫(yī)學(xué)家劉柏齡教授憑借大量的臨床實踐歸納總結(jié)出的中藥方劑，該方是由熟地黃、鹿銜草、肉蓯蓉、雞血藤、骨碎補（燙）、淫羊藿和炒萊菔子7 味中藥為原料，經(jīng)粉碎、提取后以煉蜜為粘合劑制成的純中藥濃縮蜜丸制劑［1］。方中7味藥，6味入腎經(jīng)，以補腎治本，治骨治標，標本兼治，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床［2-3］。研究表明，該方對骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等骨病具有良好的治療效果［4-5］。然而，目前對藤黃健骨丸的質(zhì)量標準研究報道較少，趙勇等［6］采用薄層色譜法對方中熟地黃和淫羊藿藥材進行了鑒別，利用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)檢測了骨碎補中柚皮苷以及淫羊藿中淫羊藿苷的含量，以提高其質(zhì)量標準。此外多數(shù)相關(guān)研究也僅是對方中單個或幾個化學(xué)成分建立含量測定方法，但檢測指標偏少，均難以反映藥品的整體質(zhì)量［7-10］?；诖?，本研究采用HPLC 法建立藤黃健骨丸的指紋圖譜，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其共有峰的結(jié)構(gòu)進行鑒定，并對其相似度進行評價，考察中間體和成品間的相關(guān)性，以期為藤黃健骨丸的質(zhì)量控制提供理論研究基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

U3000 型高效液相色譜儀（HPLC，美國Thermo 公司）；Acquity 型超高效液相色譜（UPLC，美國Waters 公司）；Q-TOF SYNAPT 型高分辨質(zhì)譜儀（HRMS，美國Waters 公司）；ME204/02 型電子天平（上海METTLER TOLED 公司）；KS-2200DE型超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

藤黃健骨丸10批中間體（組方中藥按制劑工藝制成的混合粉末）批號分別為：22039、22040、22041、22042、23003、23004、23005、23006、23007 和23008，及其對應(yīng)的10 批成品（組方中藥按制劑工藝制成的濃縮蜜丸）批號分別為：20221005、20221101、20221102、20221103、20230301、20230302、20230303、20230401、20230402和20230403，均來源于長春人民藥業(yè)集團有限公司，藥材產(chǎn)地來源分別為： 地黃（河南家種）；鹿銜草（內(nèi)蒙野生）；骨碎補（湖北、重慶、貴州野生）；肉蓯蓉（新疆家種）；淫羊藿（甘肅野生）；雞血藤（云南野生）；萊菔子（甘肅野生）。對照品松果菊苷（批號：N25GB168967）、淫羊藿苷（批號：T11A11B111118）、柚皮苷（批號：H24N9Z75896）、毛蕊花糖苷（批號：N19GB168679）、淫羊藿次苷Ⅱ（批號：A20GB158231）均購自于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于等于98%。甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；甲酸（色譜純，上海Aladdin公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 對照品溶液的制備

精密稱定淫羊藿苷、松果菊苷、淫羊藿次苷Ⅱ、柚皮苷和毛蕊花糖苷對照品各1.0 mg，加甲醇分別配置成濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱定藤黃健骨丸成品5 g 和中間體2.5 g，分別置于50 mL 錐形瓶中，再精密量取甲醇25 mL 加入使溶解，稱定質(zhì)量1，在功率為100 W，頻率為40 kHz的條件下超聲處理1 h，放冷，稱定質(zhì)量2，用甲醇補足2次稱定的質(zhì)量損失，搖勻，濾過，即得供試樣品［11］。

1.4 陰性樣品溶液的制備

按照處方工藝制備藤黃健骨丸中7味藥材相應(yīng)的陰性樣品，再分別按1.3節(jié)方法制備，即得。

1.5 色譜條件

采用Waters Symmetry C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）色譜柱； 在柱溫30 ℃下以0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，5%～10% B； 10～15 min，10%～15% B； 15～30 min，15%～25% B；30～42 min，25%～55% B； 42～52 min，55%～80% B； 52～57 min，80%～5% B； 57～62 min，5% B）；流速為0.4 mL/min； 進樣量為2 μL； 紫外檢測波長為260 nm。

1.6 質(zhì)譜條件

以ESI 為離子源，在MSE全掃描模式下對正/負離子進行分析； 掃描時間為1.5 s； 掃描范圍m/z50～2000； 離子源溫度正離子模式下為120 ℃，負離子模式下為110 ℃； 脫溶劑氣溫度400 ℃； 錐孔氣和脫溶劑氣的流速為50和800 L/h； 錐孔電壓為40 V； 毛細管電壓正離子模式設(shè)置為3.0 kV，負離子模式設(shè)置為2.5 kV； 碰撞能量為25～45 V； 采用甲酸鈉對質(zhì)譜儀進行校正，使用亮氨酸腦啡肽（正離子模式下m/z556.2771，負離子模式下m/z554.2615）對質(zhì)量數(shù)進行實時校正［12］。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

通過查閱文獻［13-17］確定各對照品常見紫外檢測波長，松果菊苷、毛蕊花糖苷的檢測波長分別為330 和334 nm，淫羊藿苷的檢測波長為270 nm，柚皮苷的檢測波長為283 nm，淫羊藿次苷Ⅱ的檢測波長為265 nm。結(jié)合文獻［13-17］并考察藤黃健骨丸紫外檢測波長，結(jié)果在260 nm 波長下指紋圖譜中各共有峰吸收較好，信號較強，故選擇其為最適檢測波長。

2.2 藤黃健骨丸指紋圖譜的建立

2.2.1 儀器精密度試驗

取藤黃健骨丸（成品）樣品連續(xù)進樣測定6次，以5號色譜峰（松果菊苷）作為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間［18］。結(jié)果見輔助材料表S1和S2，各共有峰的相對峰面積的RSD值均小于1.86%，相對保留時間的RSD值均小于1.52%，表明該儀器精密度良好，滿足分析質(zhì)量要求。

2.2.2 重復(fù)性試驗

取6份藤黃健骨丸（成品）樣品依次進樣測定，以5號色譜峰（松果菊苷）為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間［18］。結(jié)果見輔助材料表S3 和S4，各共有峰的相對峰面積的RSD 值均小于1.32%，相對保留時間的RSD值均小于1.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗

取藤黃健骨丸（成品）樣品在0、2、4、8、12、16、20和24 h 分別進樣測定，以5 號色譜峰（松果菊苷）為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間［18］。結(jié)果見輔助材料表S5 和S6，各共有峰的相對峰面積的RSD值均小于1.41%，相對保留時間的RSD值均小于1.22%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 指紋圖譜的建立及共有峰指認

取10批藤黃健骨丸（成品）樣品，依次進樣測定并記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版本）”對供試品溶液的色譜圖（X1-X10）進行分析，選擇X1作為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)置為0.1，再進行多點校正以及Mark 峰的匹配，最終獲得10 批成品的指紋圖譜（圖1），并自動生成對照指紋圖譜R（圖2A譜線a）［19］。因5號峰峰面積大，分離度好，保留時間及峰面積穩(wěn)定，因此以5號峰為參照峰，共標定出20個共有峰，共有峰面積占總峰面積90%以上。

圖1 10批藤黃健骨丸指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 10 batches of Tenghuang Jiangu Wan

圖2 對照指紋圖譜（a）和對照品HPLC色譜圖（b. 松果菊苷； c. 毛蕊花糖苷； d. 柚皮苷； e. 淫羊藿苷； f. 淫羊藿次苷Ⅱ）Fig. 2 Reference fingerprints（a） and HPLC chromatograms of reference standards（b. Echinacoside； c. Acteoside； d. Naringin；e. Icariin； f. Icariside Ⅱ）

對共有峰進行結(jié)構(gòu)鑒定，共指認了13 種成分。通過對比指紋圖譜（圖2 譜線a）與對照品保留時間（圖2 譜線b-f）指認出其中5個峰： 峰5為松果菊苷； 峰7 為毛蕊花糖苷； 峰8 為柚皮苷； 峰12為淫羊藿苷； 峰19 為淫羊藿次苷Ⅱ。通過串聯(lián)質(zhì)譜共有峰分析指認出另外8 種： 峰1 為3，5-二甲氧基-4-羥基苯基β-D-葡萄糖苷； 峰2為新北美圣草苷； 峰3為雙藿苷A； 峰9為柚皮素； 峰10為3，6-二芥子?；崽?；峰11 為朝藿定B； 峰13 為鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ；峰17 為淫羊藿次苷Ⅰ。這些化合物的串聯(lián)質(zhì)譜信息如表1 所示，以峰19 的質(zhì)譜裂解途徑為例，簡要說明它們的質(zhì)譜指認過程。峰19 在負離子模式下觀察到準分子離子峰m/z513.1760，其主要發(fā)生糖基和常見中性小分子的裂解，碎片離子集中在m/z367.1164、352.0912 和324.0966 處。m/z367.1164 的離子對應(yīng)［M－H－Rha］－，是由一分子鼠李糖基的丟失產(chǎn)生。m/z352.0912 和m/z324.0966 的離子為中性分子的丟失，分別對應(yīng)［M－H－Rha－CH3］－和［M－H－Rha－CH3－CO］－。通過在質(zhì)譜中與對照品的保留時間及裂解途徑進行比對，峰19被鑒定為淫羊藿次苷Ⅱ，其可能的裂解途徑如圖3所示。

表1 13種共有峰的質(zhì)譜鑒定Table 1 Identification of 13 common peaks by mass spectrometry

圖3 對照品（A）和樣品中（B）淫羊藿次苷Ⅱ的二級質(zhì)譜圖及其可能的裂解途徑（C）Fig.3 MS/MS spectrum of icariside Ⅱ in reference standard （A） and sample （B）， and its possible cleavage pathway （C）

2.3 共有峰歸屬

對制備的藤黃健骨丸7味藥材陰性樣品溶液進樣測定并記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版本）”對色譜圖進行分析，結(jié)果見圖4。比對共有峰發(fā)現(xiàn)峰1來源于藥材雞血藤G，峰2、8和9來源于藥材骨碎補D，峰3、6、11、12、13、14、15、16、17和19來源于藥材淫羊藿F，峰4、20來源于藥材熟地黃B，峰5、7來源于藥材肉蓯蓉E，峰10來源于藥材萊菔子H，峰18來源于藥材鹿銜草C。

圖4 指紋圖譜陰性對照Fig.4 Negative controls of fingerprints

2.4 共有峰相對保留時間和相對峰面積計算

設(shè)置參照峰（5 號色譜峰）的保留時間和峰面積為1.00，分別計算10 批藤黃健骨丸指紋圖譜中其他19 個共有峰相對參照峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見輔助材料表S7 和S8。表中結(jié)果可以看出，10 批藤黃健骨丸指紋圖譜中各共有峰相對保留時間的RSD 值均不超過0.33%，相對峰面積的RSD值均小于4.62%，表明各批次樣品的共有峰出峰時間和峰面積均比較穩(wěn)定，提示它們所代表的各成分含量差異較小，樣品質(zhì)量穩(wěn)定、可靠。

2.5 指紋圖譜相似度評價

取藤黃健骨丸10 批中間體和10 批成品的供試品溶液進行色譜分析并記錄色譜圖，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版本）”選擇X1 作為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)置為0.1，再進行多點校正以及Mark 峰的匹配，建立10 批成品的指紋圖譜，并自動生成對照指紋圖譜R。再以生成的對照指紋圖譜R為參照圖譜，對10批中間體色譜圖同法建立中間體-成品指紋圖譜。分別計算它們的相似度，結(jié)果見表2和3。10批藤黃健骨丸（成品）的指紋圖譜相似度均在0.95以上，表明各批樣品之間質(zhì)量均一、穩(wěn)定，制劑工藝穩(wěn)定。中間體-成品指紋圖譜的相似度在0.954～1.000范圍內(nèi)，說明藤黃健骨丸由中間體加蜜制備成品丸劑的工藝過程中，化學(xué)成分的損失較少，主要成分均在中間體及成品中體現(xiàn)，表明中間體與成品間相關(guān)性較好，該制劑工藝穩(wěn)定。

表2 10批成品指紋圖譜相似度計算結(jié)果Table 2 Fingerprint similarity calculation results of 10 batches finished products

表3 中間體-成品指紋圖譜相似度計算結(jié)果Table 3 Calculated similarity results of intermediate-control fingerprint

3 結(jié) 論

建立了藤黃健骨丸的HPLC指紋圖譜，確定了20個共有峰，并參照陰性樣品對峰進行了歸屬。通過對照品保留時間結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析對13 種成分（3，5-二甲氧基-4-羥基苯基β-D-葡萄糖苷、新北美圣草苷、雙藿苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、柚皮素、3，6-二芥子?；崽?、朝藿定B、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ）的色譜峰進行了指認，并推斷了淫羊藿次苷Ⅱ的質(zhì)譜裂解途徑。計算了10批藤黃健骨丸指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明各批次樣品共有峰相對保留時間和相對峰面積的差值均較小，所對應(yīng)的各成分含量保持穩(wěn)定。對建立的指紋圖譜進行了相似度評價，發(fā)現(xiàn)10批成品的相似度較好，均在0.95以上，表明該制劑質(zhì)量穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜能對其質(zhì)量進行整體控制，且藤黃健骨丸中間體與成品之間也具有良好的相關(guān)性。綜上，本研究建立的指紋圖譜可對藤黃健骨丸的內(nèi)在質(zhì)量進行整體性評價，為其質(zhì)量標準提升提供科學(xué)依據(jù)。

輔助材料（Supporting Information）［指紋圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)表格］可以從本刊網(wǎng)站（http：//yyhx.ciac.jl.cn/）下載。